人β_3肾上腺素受体真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β_3-AR的构建及表达

目的构建人β3肾上腺素受体(β3-AR)的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR,并通过脂质体介导转染HEK293细胞使之表达该受体蛋白。方法以pENTR_ADRB3-Stop质粒为模板,采用PCR法扩增出人β3-AR cDNA,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建成真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR。将该质粒转染HEK293真核细胞,通过RT-PCR检测β3-AR mRNA在HEK293细胞内的表达,通过免疫荧光法检测β3-AR蛋白在HEK293细胞中的表达。结果酶切和DNA测序鉴定均证实重组质粒含有人β3-AR编码区全长。在转染重组质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR的HEK293细胞中检测到了β3-AR基因的转录和翻译产物。结论通过基因工程方法成功构建了β3-AR的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β-AR,为进一步建立β-AR的稳定表达细胞株,用于筛选高效、高选择性β-AR激动剂奠定了基础。

p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达

目的构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选。22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Westernblot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡。结果酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108TU/ml。p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-PCR检测结果显示,各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(P<0.01),其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高。Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加(P<0.01)。p38MAPK-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加(P<0.01);p38MAPK-shRNA慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(P<0.05,P<0.01)。结论成功构建了靶向p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。

重组腺病毒CD82／KAI1对小鼠子宫基质细胞内α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin蛋白表达的影响

目的研究CD82/KAI1对着床窗口期小鼠子宫基质细胞内整合素α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin蛋白表达的影响。方法采用基因工程技术,构建CD82/KAI1腺病毒;用免疫细胞化学技术观察妊娠小鼠子宫基质细胞感染CD82/KAI1腺病毒后,细胞内α5、β3、MMP-9、E-cadherin和β-catenin的表达变化情况。结果①构建的小鼠重组腺病毒的滴度达到6.5×1012pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫基质细胞48h后,CD82/KAI1蛋白有明显表达。②妊娠4d的小鼠子宫基质细胞中E-cadherin、β-catenin、α5、MMP-9均有表达,没有检测到β3的表达;对照组未妊娠小鼠细胞中均没有检测到E-cadherin、β-catenin、α5、MMP-9和β3的表达。③与导空腺病毒组相比,妊娠4d的小鼠子宫基质细胞感染CD82/KAI1腺病毒后,β-catenin和MMP-9表达显著上升(P<0.05),α5表达显著下降(P<0.05),E-cadherin的表达量没有显著变化(P>0.05),未检测到β3的表达。结论成功构建含小鼠CD82/KAI1全基因的重组腺病毒。胚胎植入前小鼠子宫基质细胞内整合素α5、MMP-9、E-cadherin和β-catenin的表达可能受CD82/KAI1的影响。

miR-23b-3p调控脂蛋白(a)抑制同型半胱氨酸诱导的冠状动脉血管内皮细胞损伤

目的 探讨miR-23b-3p作为一种高效降低载脂蛋白（a）[apolipoprotein（a）,Apo（a）]的内源性miR,对高同型半胱氨酸引起的冠状动脉内皮细胞损伤抑制效果及作用机制。方法 通过生物信息学、miR芯片及基础实验筛选ETS1为靶基因,设计miR-23b-3p mimic/inhibitor。构建pmir GLOETS1 3＇-UTR质粒分6组转染人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCAECs）,分别为A组（pmirGLO-ETS1 3＇-UTR转染）、B组（miR-23b-3p inhibitor＋pmir GLO-ETS1 3＇-UTR转染）、C组（miR-23b-3p minics＋pmirGLO-ETS13＇-UTR转染）、D组（pmirGLO-ETS13＇-UTR mut转染）、E组（miR-23b-3p minics＋pmirGLO-ETS13＇-UTR mut转染）和F组（miR-23b-3p inhibitor＋pmirGLO-ETS13＇-UTR mut转染）,经双荧光素酶报告基因实验验证。HCAECs分为：对照组（无干预）、阴性对照组（miR-23b-3p inhibitor转染）和实验组（miR-23b-3p mimic转染）。3组细胞均置于含1. 0 mmol/L同型半胱氨酸（homocysteine,hcy）培养基中培养7 d。检测各组HCAECs存活率、miR-23b-3p和Apo（a） mRNA表达、akt、p-akt和eNOS蛋白表达。结果 双荧光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p能够和ETS13＇-UTR直接结合,可得ETS1是miR-23b-3p直接靶基因。实验组HCAECs存活率（66. 22±5. 17）%、阴性对照组（42. 12±2. 35）%和对照组（38. 36±2. 21）%均显著低于正常HCAECs（P 〈0. 01）,实验组HCAECs存活率显著高于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）。转染后,实验组miR-23b-3p mRNA表达显著高于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）,实验组Apo（a） mRNA表达显著低于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）。转染后,实验组p-akt表达和eNOS蛋白相对表达显著高于阴性对照组和对照组（P 〈0. 01）。结论 miR-23b-3p能够以ETS1为靶基因,可能通过akt/eNOS信号通路下调hcy诱导损伤的内皮细胞中Apo（a）表达,从而保护冠状动脉血管内皮细胞。

人乳腺癌细胞HYAL1基因真核表达载体的构建及其在MCF-7和ZR-75-30细胞中的表达

目的构建人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体并稳定转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞株,为进一步探讨HYAL1基因在乳腺癌的侵袭和转移中的作用奠定基础。方法采用RT-PCR技术从高表达HYAL1的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S中扩增透明质酸酶HYLAL1基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,构建的重组表达质粒经脂质体介导转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞。结果用RT-PCR成功地扩增出1条1332bp的DNA片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序证明已经成功构建了人乳腺癌HY-AL1基因的真核表达载体。RT-PCR证明转染了重组质粒的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞可以高效稳定的表达HYAL1基因,且其穿透细胞外基质的能力增强。结论成功构建了人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体,获得了稳定表达人HYAL1基因的MCF-7和ZR-75-30细胞克隆,且其侵袭能力增强。

miR-449b多态性位点rs10061133差异调控LHCGR表达

目的探究miR-449b多态性位点rs10061133 A>G在卵巢功能不全(POI)中的可能作用机制。方法生物信息学预测可能与POI相关的miR-449b潜在靶基因。双荧光素酶检测LHCGR是否为miR-449b的靶基因以及miR-449b rs10061133不同基因型对LHCGR表达调控的影响。结果生物信息学预测LHCGR为miR-449b的潜在靶基因,双荧光素酶测定证实LHCGR是miR-449b的靶基因。与GG基因型相比,rs10061133 AA基因型显著减弱LHCGR 3’UTR的荧光素酶活性。结论LHCGR为miR-449b的靶基因,多态性位点rs10061133 A>G可能通过差异调控LHCGR表达在POI的发生发展中发挥作用。

microRNA 26b-5p靶向下调p300对人脐带间充质干细胞的增殖作用

目的探讨潜在microRNA靶向下调p300表达水平对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)增殖的影响。方法通过双荧光素酶报告基因(Firefly/Renilla Luciferase)系统筛选出作用于p300 3'UTR的目标microRNA,mimic转染UC-MSCs后RT-q PCR检测miRNA表达水平的变化,Western blot检测p300蛋白水平变化,RT-q PCR和Western blot检测多潜能转录因子表达水平的变化,MTT法检测UC-MSCs增殖能力的变化,并比较克隆形成能力的差异。结果证实mir 26b-5p通过不完全互补配对结合p300的3'UTR区,显著降低了荧光素酶的相对活性(P<0.05);mir 26b-5p mimic转染后抑制p300蛋白表达水平(P<0.05),并下调Nanog基因和蛋白表达水平(P<0.05);mir 26b-5p mimic转染后UC-MSCs的增殖受到抑制(P<0.05),克隆形成能力下降(P<0.05)。结论 UC-MSCs高表达mir 26b-5p能够显著抑制p300蛋白表达和干性相关基因Nanog的表达,并且抑制UC-MSCs的增殖能力和克隆形成能力。

慢病毒介导shRNA沉默LAMP-2A和TSG101表达对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响

目的采用慢病毒介导的shRNA干扰技术,下调PC12细胞中溶酶体相关膜蛋白-2A(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP-2A)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene101,TSG101)的表达,并研究其对EGFP-α-synuclein(A53T)降解的影响。方法以LAMP-2A和TSG101为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切的p HBLV-U6-Puro载体连接获得重组慢病毒载体;将其与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞,收集并浓缩上清液获得重组病毒,测定病毒滴度;病毒颗粒转染PC12细胞,经嘌呤酶素筛选获得稳定感染细胞株;Western blot检测LAMP-2A和TSG101蛋白的表达;分别采用LAMP-2A shRNA2和TSG101 shRNA1下调PC12细胞中LAMP-2A和TSG101蛋白的表达,并结合巴佛洛霉素A1处理,研究其对PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP、α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的影响,免疫荧光检测各组PC12细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)和LC3B蛋白的表达。结果成功构建干扰LAMP-2A和TSG101表达的慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒。重组病毒感染PC12细胞后,Western blot检测结果显示LAMP-2A shRNA2和TSG101 shRNA1干扰效果最好;下调LAMP-2A和TSG101蛋白表达均能够抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)、EGFP和α-synuclein(A53T)蛋白的降解(P<0.01),并提高LC3-Ⅱ蛋白的含量(P<0.01)。结论慢病毒介导的shRNA能有效地沉默PC12细胞中LAMP-2A和TSG101的表达,抑制细胞中EGFP-α-synuclein(A53T)的降解。

过表达长链非编码RNA H19促进miR-124-3p表达抑制肝癌细胞增殖

目的探讨长链非编码RNA H19(long non-coding RNA H19,lncRNA H19)对miR-124-3p表达的影响及在肝癌细胞增殖中的作用。方法 Real-time PCR检测肝癌细胞系及临床标本中lncRNA H19和miR-124-3p的表达;在肝癌细胞系Hep G2和SMMC7721中过表达lncRNA H19,Real-time PCR检测miR-124-3p及其靶基因cyclin D1的表达;Western blot检测cyclin D1蛋白表达水平;CCK-8法检测lncRNA H19对细胞增殖的影响;过表达lncRNA H19同时加入antagomiR-124-3p后,检测miR-124-3p及其靶基因表达情况及细胞增殖情况。结果 lncRNA H19和miR-124-3p在肝癌细胞系及肝癌组织中均低表达(P<0.05);过表达lncRNA H19后miR-124-3p表达显著增加(P<0.05),miR-124-3p的靶基因cyclin D1蛋白和mRNA表达明显下降(P<0.05),细胞增殖受到抑制(P<0.05);过表达lncRNA H19同时干扰miR-124-3p后,细胞增殖抑制作用减弱(P<0.05)。结论长链非编码RNA H19通过促进miR-124-3p表达,进而抑制其靶基因cyclin D1表达而抑制肝癌细胞增殖。

腺病毒载体介导的siRNA对3T3-L1细胞脂联素表达的影响

目的构建携带小鼠脂联素(Acrp30)siRNA腺病毒载体,并检测其对小鼠脂肪细胞Acrp30表达的影响。方法首先用KpnⅠ+NotⅠ双酶切本课题组前期构建的质粒pSilencer1.0-U6-Acrp30-1和pSilencer1.0-U6-Acrp30-3,得到目的片段U6-Acrp30-1和U6-Acrp30-3,并将目的片段亚克隆入穿梭质粒pShuttle,用PmeⅠ线性化穿梭质粒pShuttle-U6-Acrp30-1和pShuttle-U6-Acrp30-3,并与pAdeasy-1在BJ5183内同源重组,筛选、鉴定、测序后,在XL10-Gold中扩增重组腺病毒质粒,最后在293细胞内包装扩增为重组腺病毒Ad-Acrp30-1和Ad-Acrp30-3。用此重组腺病毒感染3T3-L1脂肪细胞,用RT-PCR和ELISA检测其Acrp30 mRNA和蛋白表达。结果设计并构建了小鼠Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体,该载体感染脂肪细胞后,能显著抑制其Acrp30 mRNA和蛋白表达。结论构建的Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体能有效的抑制脂联素基因在3T3-L1脂肪细胞中的表达。

miR-143通过抑制AF9调控SKM-1细胞增殖和凋亡

目的探讨miR-143在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)中的表达情况及AF9对人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1增殖和凋亡的影响。方法利用实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测收集的33位MDS/AML患者以及11位健康人(健康对照)的骨髓标本中miR-143的表达;细胞实验分为过表达组(SKM-1细胞感染含LV-hsa-miR-143的慢病毒载体)、低表达组(SKM-1细胞感染含LV-hsa-miR-143-inhibitors的慢病毒载体)和阴性对照组(SKM-1细胞感染含空病毒LV-control的慢病毒载体),分别采用CCK-8法、流式细胞仪检测各组SKM-1细胞增殖、周期和凋亡情况;双荧光素酶报告基因检测miR-143对下游靶基因AF9在转录水平的影响;Western blot测定miR-143对下游靶基因AF9蛋白表达水平的影响。结果与健康对照比较,MDS患者的miR-143相对表达水平明显降低(P <0. 05);过表达组的光密度值在第3天为(0. 562±0. 069),明显低于阴性对照组(P <0. 05);低表达组的光密度值在第3天为(1. 537±0. 094),明显高于阴性对照组(P <0. 05);过表达组G0/G1期细胞比例为(57. 92±3. 58)%,明显高于阴性对照组(P <0. 05);低表达组G0/G1期细胞比例为(29. 73±2. 44)%,明显低于阴性对照组(P <0. 05);过表达组细胞凋亡率为(29. 80±2. 53)%,明显高于阴性对照组(P <0. 05);而低表达组细胞凋亡率为(5. 17±1. 04)%,明显低于阴性对照组(P <0. 05);miR-143可以显著抑制AF9 3’-UTR野生型的报告基因活性;低表达组AF9蛋白表达水平显著高于阴性对照组(P <0. 05)。结论 miR-143在MDS患者中的相对表达水平明显减低;过表达miR-143后骨髓增生异常综合征SKM-1细胞增殖活性降低、G0/G1期细胞阻滞增多、凋亡率增加;同时miR-143能够负性调节其靶基因AF9。

中国人群醛固酮合成酶基因T-344C位点单核苷酸多态性频率分析

目的研究醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C单核苷酸多态性(SNP)在中国人群中的分布。方法采用PCR-RFLP法对中国人群进行醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率分析比较。结果中国人群的醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C基因型频率分布:TT型占64.5%,TC型占30.8%,CC型占4.7%;等位基因频率T占79.9%,C占20.1%。各基因型频率、等位基因频率与西班牙人、德国人、苏格兰人、日本人差异非常显著。结论醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率的分布有明显的种族差异。

THE CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-3 GENE

In the present study, we have cloned the gene of human neurotrophin3 (hNT3) from the genomic DNA of white blood cells (WBC) by polymerase chain reaction (PCR). The amplification products were cloned into pUC19 and sequenced. Genomic sequence comparison of the cloned fragment and the reported hNT3 (GenBank M61180) reveals 7 base differences: 1 in the signal peptide, 3 in the prepro peptide, and 3 in the mature hNT3. Except the 2 varied bases (16th, T to G; 285th, A to C) in the signal peptide and prosequence resulted in the change of their encoded aminoacids (TyrAsp; GlnHis), the other varied bases have no influence on their respective encoded aminoacids, and all the changes have no influence on the open reading frame (ORF) of the hNT3.

GasderminA3基因在小鼠皮肤上皮中对NF-κB表达的影响

目的探讨Gasdermin A3(简写为Gsdma3)基因在小鼠皮肤上皮中对NF-κB表达的影响。方法通过组织切片与免疫荧光观察Gasdermin A3突变鼠与正常鼠背部皮肤中NF-κB蛋白的阳性表达区域与强弱情况;免疫荧光观察转染Gsdma3质粒后,小鼠皮肤细胞中Gsdma3与NF-κB蛋白的表达情况;RT-PCR检测Gsdma3基因突变或过表达的情况下,在体或离体小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB mRNA的表达变化情况;Western blot检测Gsdma3基因突变或过表达的情况下,在体或离体小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB蛋白的表达变化情况。结果在小鼠皮肤上皮细胞中,Gsdma3基因突变导致小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB mRNA表达平均降低39.53%,(P<0.01),蛋白表达平均降低65.03%(P<0.01),免疫荧光检测NF-κB阳性表达在Gsdma3突变的皮肤上皮中明显减弱;Gsdma3的过表达导致小鼠皮肤上皮细胞中NF-κB mRNA表达平均增强56.25%(P<0.01),蛋白表达平均增强199.6%(P<0.01),免疫荧光检测NF-κB阳性表达在过表达Gsdma3的皮肤上皮细胞中明显增强。结论在小鼠皮肤上皮中,Gsdma3能促进NF-κB的表达。

miR-378对骨髓增生异常综合征细胞凋亡及增殖的影响

目的研究miR-378对骨髓增生异常综合征SKM-1细胞凋亡和增殖的影响。方法我们分别用miR-378重组慢病毒和阴性对照病毒感染SKM-1细胞。然后采用CCK-8检测miR-378对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡和周期情况,并用Western blot检测凋亡过程中的关键因子cleaved-caspase-3蛋白的表达。用生物信息学方法预测miR-378可能的靶基因,用PCR和Western blot进行初步验证。结果 miR-378慢病毒转染组的细胞增殖活性明显降低,流式细胞术检测miR-378组的细胞凋亡率为(12.90±3.72)%,明显高于阴性对照病毒转染组和空白对照组[(3.21±1.91)%、(2.78±1.04)%,P<0.01];miR-378组的G0/G1期细胞增多,S期细胞减少。同时,Western blot结果显示miR-378过表达引起了cleaved-caspase-3的表达升高。用生物信息学方法预测抗凋亡蛋白基因BCL2L2为miR-378潜在的靶基因,并发现miR-378可以抑制BCL2L2蛋白的表达。结论 miR-378可以通过引起细胞凋亡和细胞周期阻滞来抑制SKM-1细胞的增殖,并降低BCL2L2蛋白的表达。

QF-PCR技术应用于快速产前诊断额外检出母体性染色体数目异常3例报告

目的探讨定量荧光PCR(Quantitive fluorescent PCR,QF-PCR)技术在快速产前诊断中额外检出母体性染色体数目异常的临床应用。方法对2例无创产前基因检测(Non-invasive prenatal testing,NIPT)提示性染色体异常与1例B超提示胎儿超声软指标异常的孕妇行产前诊断,获取孕妇外周血与羊水行QF-PCR检测,以及羊水行染色体微阵列分析(Chromosomal Microarray Analysis,CMA)与核型分析,并对QF-PCR检测提示性染色体数目异常的孕妇行核型分析进一步验证。结果3例孕妇的羊水样本均排除母体细胞污染,产前诊断结果显示3例胎儿未见检测范围内的染色体异常;QF-PCR检测显示3例孕妇存在性染色体非整倍体数目异常,经外周血染色体核型验证1例孕妇为47,XXX/45,XO嵌合体,2例孕妇为47,XXX三体。结论QF-PCR技术用于产前诊断不仅可快速检出胎儿常见的染色体非整倍体数目异常,排除样本母体细胞污染,同时可额外检出母体的性染色体数目异常,对提高孕妇性染色体异常检出率及提供优生优育指导具有重要意义。

miR-409-3p靶向ZEB1负性调控卵巢浆液性癌HO-8910细胞上皮间质转化

目的探讨miR-409-3p靶向ZEB1对卵巢浆液性癌HO-8910细胞上皮间质转化的影响及作用机制。方法利用脂质体分别将对照mimics和miR-409-3p mimics转染入HO-8910细胞中,qRT-PCR检测其转染效率,Western blot检测各组细胞中ZEB1、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-409-3p与ZEB1之间的靶向调控作用,Transwell侵袭和迁移实验分别各组细胞的侵袭和迁移能力变化。结果与mimics对照组相比,miR-409-3p过表达组中miR-409-3p表达显著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著增加(P<0.05),ZEB1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显减少(P<0.05),上皮间质转化进程被阻断。双荧光素酶报告基因实验结果显示ZEB1是miR-409-3p的直接作用靶点,过表达ZEB1可逆转转染miR-409-3p mimics介导的对细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的抑制作用(P<0.05)。结论过表达miR-409-3p通过抑制ZEB1蛋白表达,负性调控卵巢浆液性癌HO-8910细胞上皮间质转化,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法。方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100+NP40、Chelex-100+TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度。结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100+NP40法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度。结论:Chelex-100+NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR。

河南汉族人群16个Y-STR基因座遗传多态性

采集208名河南汉族无关男性个体的血样，用Chelex一100法提取。采用Yfiler试剂盒（美国AB公司）对16个Y—STR基因座进行PCR扩增。PCR产物在3130XL型遗传分析仪（美国AB公司）上进行毛细管电泳．GeneMapperIDv3．2软件进行基因分型。等位基因频率用直接计数法。

miR-29通过ITGB1抑制胃癌侵袭、转移的分子机制

目的观察miR-29对胃癌细胞体外侵袭力的影响,探讨miR-29通过ITGB1调节胃癌侵袭和转移的具体机制。方法通过基因芯片筛选胃癌与癌旁组织中差异性表达的miRNA;采用生物信息学预测ITGB1调控相关miRNA,通过比对上述2个结果,筛选出miR-29;进一步以miR-29慢病毒及miR-29mimics过表达miR-29后,用Western blot检测胃癌细胞中ITGB1的表达变化;采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGB1的作用机制;采用Transwell侵袭实验及划痕实验检测miR-29慢病毒感染后细胞体外侵袭能力的变化;qRT-PCR检测60例胃癌患者癌组织和癌旁组织中miR-29的表达差异,并分析miR-29的表达与肝癌患者临床病理之间的关系。结果基因芯片及生物信息学预测发现miR-29在胃癌组织里高表达,同时又可能调控ITGB1;双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGB13'UTR,miR-29慢病毒及miR-29mimics过表达miR-29都能在蛋白水平下调ITGB1;qRT-PCR结果显示miR-29家族3条miRNA在胃癌组织中的相对含量均低于癌旁组织[miR-29a:癌旁(32.01±10.38),癌(14.16±6.25);miR-29b:癌旁(26.95±5.05),癌(9.82±1.86);miR-29c:癌旁(53.56±8.05),癌(16.79±1.97),P<0.01];进一步统计学分析表明,miR-29a与淋巴结转移有关(P<0.05),miR-29b在具有远处转移的病例组织中C/P比值较无远处转移的病例组织明显降低(P<0.05)。结论miR-29可以在转录后水平调控ITGB1的表达,从而抑制胃癌细胞的侵袭和转移。