用PCR技术检测革螨、恙螨体内EHFV的研究

本次研究拟用PCR技术直接检测鼠巢、鼠体中革螨和恙螨体内EHFV-RNA。结果从5份革螨和恙螨标本中有4份检出EHFV-RNA,分别为格氏血厉螨、厩真厉螨、巴氏厉螨和小盾纤恙螨。表明用PCR技术可直接从革螨、恙螨体内检测出EHFV-RNA.为流行病学调查提供了一种方法。

逆转录-半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究．方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性、特异性及临床应用研究．结果：所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测均为阴性；８６份经ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清，其阳性检出率按发病时间分别为：１ｗｋ内１００％；１ｗｋ～２ｗｋ６１．２９％；２ｗｋ～３ｗｋ３．３％；＞３ｗｋ为２８．５％．另外２０份ＩＦＡ（－）但疑诊ＨＦＲＳ的初入院患者血清的检出率为３０％，经进一步跟踪观察，确认为ＨＦＲＳ．结论：ＲＴ－ＰＣＲ是一种敏感、特异的ＨＦＲＳ诊断方法，可弥补血清学检测的不足，值得进一步完善、推广和应用．

528例登革热患者临床表现与实验室数据的回顾性分析

目的分析登革热患者临床表现和实验室指标的变化。方法回顾性分析2015年潮州登革热暴发期间潮州中心医院就诊的528例登革热患者症状、体征以及实验室数据,并与普通人群进行对比,同时比较普通登革热、登革出血热和重症登革热各项指标之间是否存在差异。结果所有患者均为登革热病毒Ⅱ型感染,主要临床表现为发热、头痛、皮疹、肌肉酸痛、淤斑、出血、呕吐、腹泻。登革热组患者白细胞(WBC)、血细胞比容(HCT)、血小板(PLT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TCHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与普通人群比较差异均有统计学意义(P=0.000)。登革热患者中普通登革热患者491例(93.0%),登革出血热22例(4.2%),重症登革热15例(2.8%)。重症登革热组患者WBC、PLT、ALT、AST、磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平与普通登革热组比较差异有统计学意义(P<0.05),WBC、ALT、AST、CK、CK-MB、LDH在登革出血热组和重症登革热组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论登革热患者多项实验室指标均可表现出不同程度异常,综合分析这些数据可以辅助指导临床诊断与治疗,对登革热病毒感染的控制有显著意义。

HFRS患者血清中HV-RNA的PCR检测及扩增产物的测序分析

目的 探讨 RT- PCR用于 HFRS临床标本中病毒基因检测的若干影响因素及西安地区近年主要流行汉坦病毒(HV)毒株的分子流行病学特点 .方法 设计合成了两套分别互补于 HV M基因片段和 S基因片段的引物 ,建立了检测HFRS患者临床血清标本中 HV基因的 RT- nested PCR方法 ,并对扩增的部分 HV靶基因进行了测序分析和比较 .结果 119份 HFRS患者血清 (经临床和 IFA确诊 )经用 S基因片段引物的 RT- nested PCR检测 ,阳性率分别为 :6 0 .5 %(<1wk) ,34 .1% (1～ 2 wk) ,4.0 % (2～ 3wk) ,0 % (>3wk ) ,31份 HFRS急性期患者血清用 M基因片段引物的RT- nested PCR检测 ,仅 12份阳性 ,阳性率 40 .0 % .将 PCR扩增的 6个靶基因序列与 76～ 118株 S基因片段相应的核苷酸序列进行分析比较 ,同源性为 87.2 %～ 96 .0 % ;其推导的氨基酸序列与 76～ 118株核衣壳蛋白相应的氨基酸序列比较 ,同源性为 89.0 %～ 96 .0 % .结论 S基因片段引物的PCR扩增效果优于 M基因片段引物 .6份 S基因片段引物扩增产物的测序结果显示 ,西安地区引起

套式反转录-聚合酶链反应检测革螨体内肾综合征出血热病毒的初步研究

用ＨＴＮ病毒姬鼠型Ｍ基因型特异性引物，异硫氰酸胍一步法提取ＲＮＡ，ｎｅｓｔｅｄＲＴＰＣＲ检测鼠肺和厩真厉螨体内７６１１８株病毒ＲＮＡ，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和点印迹杂交证实。结果表明，姬鼠型７６１１８株病毒液和叮刺感染病毒乳鼠后第１０天厩真厉螨组织悬液接种乳鼠第９天鼠肺、叮剌后第１０天和３０天螨，均检出病毒ＲＮＡ。３０只螨样本提取ＲＮＡ也能扩增出病毒ＲＮＡ。家鼠型ＵＲ株感染样本不能被扩增。该方法具有较高特异性和敏感性，操作简单，结合原位分子杂交，可用于螨媒传播ＨＦＲＳＶ的研究。

NS1抗原捕获ELISA在登革热筛查及诊断中的应用

目的评价检测登革病毒NS1抗原捕获酶联免疫吸附试验（NS1-ELISA）在登革热实验室诊断中的应用价值。方法选取2014年9-10月在广东省佛山市第一人民医院就诊的疑似登革热病毒感染的患者共173例,分别采用NS1-ELISA、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和胶体金免疫层析法（以下简称金标法）对其血清中的登革病毒标志物进行检测,比较3种方法对登革热诊断的灵敏度、特异性、预测值、似然比、约登指数和卡帕值。结果 173例疑似患者中共88例（50.87%）被确诊为登革热患者,检测结果阳性率最高为金标法,显著高于NS1-ELISA和PCR;NS1-ELISA敏感度、阴性预测值和约登指数均高于PCR和金标法,阴性似然比低于PCR和金标法,3种方法的敏感度差异无有统计学意义（P〉0.05）,PCR和NS1-ELISA特异性显著优于金标法,差异有统计学意义（P〈0.05）,PCR特异性高于NS1-ELISA,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 NS1-ELISA对登革热的检测效能和应用价值优于PCR和金标法,可作为登革热暴发或散发的筛查及确诊方法。

应用捕获ELISA法早期诊断肾综合征出血热

探讨肾综合征出血热早期诊断方法。方法 :用macELISA、IFAT两种方法同时检测经临床诊断肾综合征出血热病人血清 40份 ,非出血热血清 2 0份 ,正常人血清 2 0份 ,并进行对比研究。而且阳性血清用 2 -巯基乙醇破坏IgM试验 ,阴性血清加类风湿因子阳性血清进行干扰试验。结果 :用macELISA法检测肾综合征出血热病人病程第 2天即可出现阳性 ,第 3～ 4天特异性抗体IgM阳性率达 89% ;第 5～ 7天可达 10 0 % ,而IFAT法同病日抗体阳性率只有 5 5 %与 70 % (P <0 .0 5 )。非出血热病人与正常人特异性抗体全部阴性。阳性血清用 2 -巯基乙醇破坏IgM后macELISA检测为阴性 ;而阴性血清加类风湿阳性血清后再用本法检测无假阳性。结论 :与IFAT法相比 ,macELISA法诊断肾综合征出血热特异性强 ,灵敏度高 ,早期诊断意义大。

原位分子杂交检测HFRSVRNA方法研究

采用非放射性标记物－地高辛碱性磷酸酶标记肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）ｃＤＮＡ制备分子探针，检测ＨＦＲＳＶ在鼠肺、恙螨体内分布定位，并对原位分子杂交的各环节进行探讨。结果表明：鼠肺的吞噬细胞、支气管粘膜上皮细胞、血管内皮细胞等均见有阳性颗粒，在恙螨卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞也存在阳性颗粒；在前处理中，明胶硫酸铬钾与多聚赖氨酸的铺片效果相似；室温２ｈ，４２℃１ｈ，４％多聚甲醛处理冰冻切片，可有效防止脱片，且保持良好的细胞形态结构；探针ＰＣＲ标记法优于随机引物标记法；预杂交液加入ｓｐｅｒｍＤＮＡ和ｙｅａｓｔｔＲＮＡ，不用硫酸萄聚糖，可有效地减少背景染色；４２℃杂交１６ｈ。

流行性出血热特异性诊断与常规诊断的对比分析

流行性出血热(EHF)是一种由病毒引起的自然疫源性疾病,以IFA 和ELISA 法进行特异性EHFIgM 抗体检测以及从患者体内分离病毒可以确诊.由于实验条件的限制,这些方法尚未作为EHF 的常规诊断技术在我国医院推广.我们对85例EHF

RT-nested PCR检测肾综合征出血热患者血清病毒核酸

采用异硫氨酸胍-酚-氯仿（AGPC）一步法提取病毒-RNA，并依据肾综合征出血热病毒（HFRSV）核蛋白（NP）编码基因保守区核苷酸序列合成两对巢式引物，建立了逆转录巢式聚合酶链反应（RT－nestedPCR）检测HFRSVRNA方法。应用此法对HFRSV感染的VeroE6细胞培养液及HFRS患者血清中的病毒RNA进行检测。结果显示，感染细胞培养液及35例HFRS患者血清均为阳性，正常的VeroE6细胞及20例正常人血清均为阴性。将HFRSV感染细胞提取的RNA进行10倍系列稀释，可检出10（－7）稀释度的病毒RNA（约0.2pg）。该法灵敏、特异、快速、简便，为从分子水平探讨HFRS的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

用直接免疫金银法检测组织内流行性出血热病毒抗原

作者以胶体金标记抗流行性出血热病毒多克隆及单克隆抗体的直接免疫金银法,做流行性出血热尸检、活检及动物组织中病毒抗原的免疫细胞化学定位,并同ABC,PAP及APAAP法进行比较。该法操作简便,金标一抗与组织孵育后即可显色,所需时间较上述对比方法缩短2～4h,并能定位长期保存尸检组织中,用上述对比方法难以检测到的病毒抗原。该法可不受组织内色素、内源酶活性及交叉染色对结果的干扰,是一种较理想的免疫细胞化学染色方法。

34例流行性出血热临床特点及分析

本文分析了３４例流行性出血热的临床特点：①多数病例“三痛”症状较少．消化道症状较明显；②发生腔道出血者较少（２０．５％）而皮肤粘膜出血较多（７０．５％）；③具典型临床五期经过者仅占２３．５％，越期或叠期较多（５８．８％）；④实验室结果显示，多数患者心肌，肝，肾，血液系统均有不同程度损害．误诊率较高（３８．２％）。为避免误漏诊，今后在本病流行季节凡遇到原因不明的发热，应动态监测血象，血小板，尿蛋白，血清ＢＵＮ及Ｃｒ的变化，对每一疑似病例应作血清学检查。

流行性出血热患者早期病毒血症及临床检测分析

本文对82例流行性出血热患者进行了早期病毒血症及临床检测分析。早期病毒血症和临床检测的变化与病情的轻重及预后有关,感染病毒量愈大,则机体受损愈重,临床检测指标异常愈明显。进一步提示流行性出血热病毒在流行性出血热发病机理中具有重要的作用。

逆转录-聚合酶链反应对肾综合征出血热早期的诊断

为了选择更为敏感，特异，快速的肾综合征出血热（HFRS）的诊断方法。我们建立了碘化钠—异流氰酸胍—氯仿法提取汉坦病毒（HV）核酸（RNA）用于逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同病型HFRS患者一周内血清中HV－RNA且与酶联免疫吸附法（ELISA）检测HFRS-IgM进行比较。45例HFRS患者血清中HV－RNA阳性率为82．2％，其中轻、中、重型阳性中分别为75％，78.5％，86.9％。HFRS-IgM阳性率55．5％，其中轻、中、重型阳性率分别为37.5％，50.0％，65/2％。RI-PCR法检出率高于ELISA法，差别有显著性。RT-PCR法和ELISA法均可以用于HFRS的早明诊断。但前者更为敏感。

恙螨体内HFRSV基因检测及定位的初步研究

１９９７ 年以来我们采用分子生物学方法对小盾纤恙螨的媒介意义进行研究。结果表明， 用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｎｅｓｔｅｄ Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 从恙螨体内检测到 Ｈ Ｆ Ｒ Ｓｒ－ Ｒ Ｎ Ａ； 用原位分子杂交技术在恙螨的卵巢细胞、支肠细胞等组织中检测到 Ｈ Ｆ Ｒ Ｓ Ｕ－ Ｒ Ｎ Ａ。以上结果为恙螨的媒介意义提供了具有分子水平的直接证据， 对 Ｈ Ｆ Ｒ Ｓ 的流行病学和预防具有重要的理论意义和实用价值。

用斑点杂交法检测肾综合征出血热患者尿沉渣细胞中病毒核酸

用光敏生物素标记的肾综合征出血热(HFRS)病毒R22株M片段R3克隆cDNA探针检测HFRS患者尿沉渣细胞内的病毒核酸,共检测81份患者尿液标本,阳性率为65.4％,而正常人及其他疾病患者的55份尿液标本均呈阴性,病程第1—7日病毒核酸检出率为80.8％(21/26),在发病第22日以后有的(5/13)仍可检出。7份尿液标本同时用光敏生物素和x-^(32)P标记探针检测,均为4份阳性,本实验结果提示,光敏生物素标记的核酸杂交技术可作为HFRS早期诊断及流行病学调查之用。

EHF 患者血清及尿液 TNF 及 sIL-2R 的研究

用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，对３０例流行性出血热患者的血清及尿液各９６份中的ＴＮＦ及ｓＩＬ－２Ｒ的含量进行了动态检测。结果显示ＴＮＦ及ｓＩＬ－２Ｒ水平皆高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）。其改变与患者的病程与病情密切相关。尿液中二者含量与尿蛋白含量呈正相关。血、尿中ＴＮＦ及ｓＩＬ－２Ｒ含量亦呈正相关。提示ＴＮＦ及ｓＩＬ－２Ｒ参与了流行性出血热的发病过程。

汉坦病毒逆转录与PCR单管法研究及初步应用

聚合酶链反应(PCR)是汉坦病毒特异、敏感、快速的基因检测方法,已逐步应用于临床,对流行性出血热的早期诊断意义较大.但在应用过程中,也逐步暴露出许多不完善之处,诸如容易污染、操作流程繁琐等.国内外许多学者都在积极从各个环节进行方法的优化和改进.我们尝试着将逆转录与半套式PCR第一次扩增在单管中进行,并用于临床标本检测,现报告如下:

流行性出血热患者血清IgE水平与肾脏损害关系的初步观察

流行性出血热(EHF)的免疫学研究已有许多报道,但有关EHF患者肾脏损害与体液免疫反应直接有关的系统研究甚少。