脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素G_1对体外培养人外周血淋巴细胞凋亡影响的研究

以细胞培养、流式细胞仪ＤＮＡ含量分析及ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳方法研究了我国食管癌高发区磁县居民粮食中优势污染霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）和黄曲霉毒素Ｇ１（ＡＦＧ１）对人淋巴细胞凋亡的影响。流式细胞术（ＦＣＭ）检测结果显示，ＤＯＮ、ＡＦＧ１处理组淋巴细胞出现了典型的亚二倍体凋亡细胞峰，凋亡百分率与毒素作用时间（ＤＯＮ：２～７２小时；ＡＦＧ１：２～２４小时）及剂量（ＤＯＮ：５０～２０００μｇ／Ｌ；ＡＦＧ１：３．１２～２０００μｇ／Ｌ）呈正相关关系。ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果表明，ＤＯＮ（１０００μｇ／Ｌ）、ＡＦＧ１（１０００μｇ／Ｌ）处理２４小时淋巴细胞出现特征性的ＤＮＡ＂Ｌａｄｄｅｒ＂条带。因此表明，ＤＯＮ、ＡＦＧ１可诱导和促进体外培养的人外周血淋巴细胞发生凋亡。

幽门螺杆菌诱导人胃癌MKN45细胞COX-2表达的信号转导研究

目的:探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信号转导对幽门螺杆菌(Heli-cobacter pylori,Hp)感染的胃上皮细胞MKN45中环氧合酶(cyclooxygenase-2,COX-2)表达的调控作用,揭示Hp感染引发胃癌的部分机制。方法:采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测Hp标准株NCTC11637感染对MKN45细胞中COX-2 mRNA表达的影响,Western印迹法检测Hp感染MKN45细胞后p38MAPK信号通路的激活情况;运用p38MAPK特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号通路后,观察Hp对MKN45细胞COX-2 mRNA表达的影响。结果:Hp感染MKN45细胞后COX-2mRNA水平明显上调,Hp感染后3、6、9和12h时COX-2 mRNA的表达量分别为正常值的3.0、7.2、5.1和4.3倍,各时间组COX-2 mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01)。Hp作用MNK45细胞20min后p38MAPK信号通路被激活,60min时达峰值;而采用p38MAPK特异性抑制剂SB203580阻断p38MAPK信号转导通路后,Hp诱导的COX-2 mRNA表达明显降低(P<0.01)。结论:Hp感染能激活p38MAPK信号通路,通过p38MAPK信号转导上调COX-2的表达,这可能是Hp感染引发胃癌的重要机制之一。

杂色曲霉素对体外培养人胚肺成纤维细胞rasp21和超微结构的影响

以人胚肺组织体外培养、流式免疫技术和电镜相结合的方法，对河北省肿瘤高发区粮食中污染的常见霉菌毒素－杂色曲霉素作用后人胚肺成纤维细胞癌基因ｒａｓｐ２１蛋白产物的表达及相应超微结构变化进行了研究。结果表明：在杂色曲霉素作用下人胚肺成纤维细胞癌基因ｒａｓｐ２１的蛋白表达明显增强。电镜观察可见杂色曲霉素处理细胞出现细胞核明显增大、异型、核膜内褶、核仁明显等一系列具有恶性肿瘤细胞特征的超微结构变化。

B-myb C-myc在肝细胞性肝癌中的表达及临床意义

目的:检测肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中B-myb及C-myc蛋白的表达情况,探讨其在肝癌发生、发展及转移中的作用。方法:采用免疫组化法检测60例肝癌组织及60例癌旁肝组织中B-myb和C-myc的表达情况。结果:B-myb、C-myc在癌组织中的阳性率分别为56.67%和53.33%,而在癌旁组织中的阳性率分别为36.67%和35.00%,癌组织与癌旁组织比较差异有显著性(P<0.05)。B-myb在肝癌组织中的表达与临床分期、肝外转移、术后复发肿瘤个数及包膜完整相关(P均<0.05);C-myc在肝癌组织中的表达与门静脉癌栓、肝外转移、术后复发、肿瘤分化程度及包膜完整相关(P均<0.05)。B-myb与C-myc在癌组织中的表达正相关。结论:B-myb及C-myc蛋白的过表达,可促使肝癌细胞增殖,使肝癌细胞具有更强的侵袭力,与肝癌的发生、发展密切相关。

EB病毒LMP-1上调鼻咽癌细胞系AP-1的活性

为了探讨 EB病毒潜伏膜蛋白 1 ( LMP- 1 )通过信号传导途径介导的致瘤分子机制 ,由此首先构建了 AP- 1报告基因 ,用佛波酯诱导确定了其报道 AP- 1的功能 ;通过建立荧光素酶双报道系统 ,研究了 LMP- 1表达对 AP- 1和 NFκB活性的影响 .研究发现 :在 LMP- 1阴性鼻咽癌 ( NPC)细胞系 ,导入 LMP- 1表达质粒后 ,AP- 1和 NFκB的活性均升高 4～ 5倍 ;而在 LMP- 1阳性 NPC细胞系中 ,当导入 LMP- 1反义表达质粒 ,AP- 1和 NFκB的活性则受抑制 ,活性下调 3～ 4倍 .结果表明 ,LMP- 1能上调 NPC细胞系 AP- 1的活性 ,同时再次证实了 LMP- 1能活化 NFκB.

杂色曲霉素对体外培养人外周血白细胞介素Ⅱ分泌影响的研究

杂色曲霉素是我国肿瘤高发区粮食中的优势污染霉菌毒素。为探讨杂色曲霉素 (ST)对人体免疫机能的影响 ,采用双抗体夹心ELISA方法对ST作用后人外周血单核细胞 (HPBMc)培养上清液中白血细胞介素Ⅱ (IL 2 )的分泌水平进行了检测。结果表明 ,不同浓度 ( 0 0 3 12 5～ 2mg L)ST处理 2 4h后 ,体外培养的HPB Mc的IL 2分泌均受到一定程度的抑制 ,其中以较低浓度ST( 0 0 3 12 5～ 0 12 5mg L)和较高浓度ST( 1～ 2mg L)抑制作用最明显 (P <0 0 5 )。在ST 1mg L作用 1～ 64h的时间范围内 ,ST对HPBMcIL 2的分泌总体表现抑制作用。ST处理后 8～ 64h ,随ST处理时间的延长 ,对IL 2分泌的抑制作用逐渐增强 (r =0 82 2 ,P <0 0 5 )。本研究结果提示 ,ST对HPBMcIL

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导哺乳类细胞转化的实验研究

用人胚肺成纤维细胞的体外转化实验检测出甲基丙烯酸环氧丙酯可诱导人胚肺成纤维细胞形态学改变，转化细胞核浆比例增大，排列紊乱，交叉重叠生长。从转化集落分离的细胞可被较低浓度的刀豆凝集素Ａ凝集，在半固体琼脂内非贴壁依赖生长。转化细胞的染色体发生结构和数目改变。上述结果表明：甲基丙烯酸环氧丙酯具有诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化的作用，预示它可能对人具有潜在的致癌危险性。

内脏伤害性刺激诱导的大鼠延髓内Fos表达

用抗Ｆｏｓ蛋白和酪氨酸羟化酶（ＴＨ）的免疫组织化学方法，对大鼠两种内脏（胃肠道和心脏）伤害性刺激诱导的大鼠延髓Ｆｏｓ表达情况及其与儿茶酚胺能神经元的关系进行了观察。结果表明：Ｆｏｓ样免疫阳性神经元主要分布在延髓中段和尾段的孤束核、腹外侧区以及两者之间的网状结构内；在抗Ｆｏｓ和抗ＴＨ的双重免疫染色切片上，见到许多Ｆｏｓ阳性神经元的胞浆同时呈ＴＨ样免疫反应阳性（Ｆｏｓ／ＴＨ双重阳性细胞），计数结果证明Ｆｏｓ／ＴＨ细胞占ＴＨ阳性细胞总数的５０％以上，提示延髓内脏带半数以上的儿茶酚胺神经元参与对内脏伤害性刺激的反应。

金葡菌及其L型感染荷瘤小鼠的实验研究

本文应用金黄色葡萄球菌及Ｌ型分别感染肿瘤和非肿瘤Ｃ＿（５７）ＢＬ／６Ｎ小鼠，病理学和细菌学检测发现细菌及Ｌ型感染种植肿瘤的小鼠组，肿瘤转移率和诱癌能力均显著提高。此外金葡菌及其Ｌ型感染还可引起小鼠多器官间质性炎，尤以肺、肝、肾、脑及生殖器官等为著。结果表明细菌及Ｌ型感染与肿瘤转移和肿瘤的发生可能有关。

饮用水微囊藻毒素与消化道恶性肿瘤死亡率关系的流行病学研究

目的研究饮用水微囊藻毒素 (MC)与消化道主要恶性肿瘤死亡率的关系。方法在无锡市选取 10个饮水类型不同的乡镇或街道作为调查点 ,收集 1992～ 2 0 0 0年各调查点恶性肿瘤的死亡资料 ,同时采集不同类型水样 ,综合评价各调查点 MC的暴露水平 ,分析饮用水 MC暴露等级与恶性肿瘤死亡率的相关关系。结果饮用水 MC暴露等级与男性胃癌和男性各部位合计恶性肿瘤的标化死亡率呈现正相关 ;与男性肠癌的标化死亡率呈现负相关 (P<0 .0 5 )。结论饮水MC污染可能与男性消化道恶性肿瘤死亡率 ,尤其是胃癌死亡率的上升有关。

黄曲霉毒素致癌机理的研究进展

黄曲霉毒素为肝脏毒素,主要损害肝脏。介绍了黄曲霉毒素的种类、毒性,以及对人类和其他动植物的危害。并综述了近年来关于黄曲霉毒素引发DNA损伤与基因突变、对ras等癌基因与P53等抑癌基因的作用及与HBV联合致癌等致癌机理的最新研究进展。

EB病毒诱导胸腺恶性T细胞淋巴瘤的研究

为研究EB病毒在恶性T细胞淋巴瘤发生中的作用 ,将EB病毒感染的人胚胸腺细胞移植于Scid鼠皮下 ,于移植后第 3日起在移植处对侧皮下注射TPA5 0ng/只 ,每周 1次。于移植后第 4周起 ,移植处皮下有结节状隆起形成 ,并逐渐增大。于 6～ 15周内行病理学检查和免疫组织化学染色 ,证实为T细胞淋巴瘤 8例。其中实验组胸腺细胞 +EBV的成瘤率为 2 5 %(1/ 4) ,胸腺细胞 +EBV +TPA组的成瘤率为 5 3 8%(7/ 13) ,对照组胸腺细胞 +TPA的成瘤率为 0 (0 / 5 )。PCR和原位杂交在诱导肿瘤中可检测到EB病毒的基因EBERs、LMP1和BARF1,并有病毒基因LMP1蛋白编码产物的表达。EB病毒可感染人胚胸腺细胞 ,并使其发生恶性转化 ,EB病毒可能在恶性T细胞淋巴瘤的发生中起病因作用。

恶性肿瘤中抗酸菌L型检出意义的研究

本文用改良抗酸染色法和卡介苗抗体免疫组化染色法对４２０例恶性肿瘤（乳腺癌１１２例肠腺癌１００例、恶性淋巴病５４例、子宫颈癌７０例、绒毛膜癌８４例）进行了研究。结果发现４２０例恶性肿瘤中４７例（１１．２％），１Ｋ抗酸染色阳性和４９例（１１．６％）免疫组化染色阳性，其中以恶性淋巴瘤抗酸菌Ｌ型检出率最高（４４．４％）绒毛膜癌最低（２．４％），抗酸菌Ｌ型主要（８５％）分布于癌巢或肿瘤实质内该区５１．１％癌细胞呈增生活跃状态，３４％癌细胞呈空泡样变性，颇似病毒感染的凹空细胞，２．１％的瘤细胞发生坏死。结合文献复习，提示抗酸菌Ｌ型感染可能与肿瘤发生有关。

杂色曲霉素对人胚胃粘膜细胞p53基因致突变研究

为探讨杂色曲霉素（ＳＴ）的致癌作用，运用细胞培养、流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）和银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ等方法研究了不同浓度的ＳＴ（１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ）诱发体外培养的人胚胃粘膜细胞恶性转化情况以及此过程中抑癌基因ｐ５３在蛋白及基因水平上的变化。结果表明，ＳＴ处理４周后处理细胞增殖旺盛，并出现恶性转化灶；ＳＴ处理２４周后处理细胞可在软琼脂上形成细胞集落（ＳＴ１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ组每皿细胞集落数平均分别为１５和１７个）；ＦＣＭ检测结果表明，ＳＴ处理的细胞细胞增殖指数增高，ＤＮＡ含量增高，出现ＤＮＡ异倍体，突变型抑癌基因ｐ５３蛋白表达明显增强。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结果显示，ＳＴ处理２２周后，处理细胞ｐ５３第８外显子出现异常泳动带型。

人乳头状瘤病毒诱导人胚食管上皮永生化细胞恶性转化

为了证实HPV18E6E7基因诱导的人胚食管上皮永生化细胞 (SHEE) 6 1代 (SHEE6 1)部份细胞 (SHEE6 1A)已经恶性转化 ,以寻找监控细胞早期恶性转化的方法。对培养的SHEE第 10代 (SHEE10 )和 6 1代 (SHEE6 1)细胞 ,用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及生长形式 ;用流式细胞仪分析细胞周期 ;用染色体G带核型分析和间期核染色体 1、7、8号着丝粒探针荧光原位杂交 (FISH)检测细胞染色体改变 ;用增殖优势克隆优选法选出生长快的细胞群体 ,接种裸小鼠和SCID小鼠。结果 :光学显微镜下见SHEE6 1细胞大小不等 ,重叠生长 ;电子显微镜下见细胞核多型性和核仁增大等增殖表型 ;流式细胞仪检测 ,SHEE6 1增殖指数和DNA >4n细胞高于SHEE10 ;SHEE6 1细胞染色体众数出现 5 7～ 6 0、6 3～ 6 5两亚群 ,1、7、9、13、17等染色体出现较多 3体、4体或 5体 ;FISH间期核 1、7号着丝粒数增多 ;SHEE6 1克隆优选的细胞SHEE6 1A接种SCID小鼠成瘤。这表明 :SHEE6 1细胞形态及生长特性有了改变 ,接触抑制减弱 ,高倍体和不整倍体细胞增多 ,染色体数目明显改变 ,SHEE6 1A接种SCID小鼠产生浸润性肿瘤 ,可以判定SHEE6 1部份细胞已恶性转化。用克隆优选法筛选和染色体检测可以监控永生化细胞早期恶性转化。

幽门螺杆菌对人胃癌MKN45细胞p38MAPK信号转导通路激活作用的研究

背景与目的:环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)是花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandins,PGs)代谢中重要的限速酶,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染诱导胃黏膜COX-2的过度表达是胃癌发生的重要环节,但坳感染胃黏膜细胞COX-2表达的机制尚不清楚。本研究旨在揭示Hp对人胃癌MKN45细胞COX-2表达和p38MAPK信号通路的影响,探讨COX-2表达的可能机制。方法:采用实时荧光定量PCR (real time-PCR)检测Hp标准株NCTC11637感染对人胃癌MKN45细胞COX-2 mRNA转录的影响,Western blot检测Hp COX-2蛋白表达的影响和p38MAPK信号通路的激活及其下游因子ATF-2的表达。结果:Hp感染人胃癌MKN45细胞后,COX-2 mRNA的表达明显上调,Hp感染3、6、9、12 h后COX-2 mRNA的表达量分别为正常值的3倍、7.2倍、5.1倍和4.3倍,各时间组COX-2 mRNA表达均明显高于对照组(P<0.01);Hp与MKN45细胞共培养24 h后,COX-2蛋白的表达亦显著增加(P<0.01)。Hp感染MKN45 20 min后,p38MAPK信号通路被激活,60 min达峰值:p38MAPK下游因子ATF-2的表达也明显增加,2 h达高峰,随着作用时间的延长,表达逐渐下降,24 h仍有表达。结论:np感染能诱导人胃癌MKN45细胞COX-2的表达;激活p38MAPK信号通路,增加其下游因子ATF-2的表达,可能是其诱导COX-2表达的机制。

启东肝癌高发区乙肝病毒流行株全基因分析

目的:通过对江苏启东地区乙型肝炎病毒(HBV)全基因序列的分析,探讨该地区肝癌高发的分子病毒学病因。方法:以蛋白酶K消化后,酚/氯仿抽提7例肝炎和7例肝癌患者血清中DNA。应用聚合酶链反应(PCR),扩增血清中HBV基因全长,克隆至T载体后行全自动测序。以PHYLIP软件构建的系统进化树判断HBV的基因型;以Clastal W软件对序列进行突变分析。结果:14例标本中有12例为C基因型,2例为B基因型。肝癌和肝炎组中HBV基因型类别分布无差异。有5例HBV发生了PreS2的缺失突变,其中肝癌标本4例(57.1%),肝炎标本仅1例(14.3%)。HBV基因组中常见的点突变为PreS1区的nt.3116及核心启动子区的nt.1762/1764,发生率高达78.6%(11/14)。与肝炎组相比,肝癌中点突变发生率显著增高的位点为前C区nt.1899 G→A的突变(P=0.01)及核心启动子区nt.1653 C→T的突变(P=0.05)。结论:启东地区HBV以C基因型为主;启东HBV基因组中可能存在着与肝癌相关的点突变和缺失突变。

肿瘤抗原基因OVA66对肿瘤细胞生物学特征的影响

目的:探讨肿瘤抗原基因OVA66对肿瘤细胞生物学特征的影响。方法:采用脂质体法,以重组真核表达载体pcDNA3.1-OVA66转染肝癌细胞系SMMC-7721,经G418稳定筛选、克隆及扩增,采用RT-PCR、Westernblot和免疫细胞化学(ICC)染色法,检测目的基因及其蛋白的表达。用FACS检测细胞周期的变化;电镜技术观察细胞的超微结构;体外运动、侵袭实验检测细胞运动及侵袭能力;并应用基因芯片技术检测相关基因的差异表达。结果:RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1-OVA66的细胞中OVA66基因呈高表达。Westernblot显示,在OVA66蛋白处出现明显的条带。电镜和FACS检测表明,该基因可增强肿瘤细胞的增殖能力。体外运动、侵袭实验证实,该基因可促进肿瘤细胞的迁移、侵袭。基因芯片显示,该基因的高表达可促进Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)等基因的表达,影响肿瘤的侵袭和转移。结论:OVA66基因及其蛋白可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列生物学功能。

裸小鼠人肺癌术后转移模型的建立及动态观察

目的:建立裸小鼠人肺癌术后转移模型,动态观察肿瘤转移情况,为研究肺癌转移机制和术后抗转移治疗提供动物模型。方法:采用组织块法建立裸小鼠人非小细胞肺癌NCI-H460皮下移植瘤模型。4周后,随机挑选25只裸小鼠作为手术组切除肿瘤组织,建立术后转移模型,其余15只裸小鼠作为对照组。每2周两组各处死5只裸小鼠,动态观察其远处各脏器转移情况。动物明显消瘦时结束实验,并采用免疫组化法检测MMP-2、OPN、CD44v6、CD62等蛋白在转移灶及原发灶的表达情况。结果:对照组裸小鼠10周时所携瘤体严重坏死,并出现明显消瘦,解剖发现各阶段均无转移。手术组裸小鼠于10周、12周各发现1例肺转移(1/5),14周时裸小鼠明显消瘦,肺转移率达100%(5/5),有肉眼明显可见的肺转移结节,其他脏器未见转移。免疫组化结果表明,MMP-2、OPN、CD44v6、CD62、E-cadherin、TIMP-2在肺转移灶内的表达明显高于原发灶,CD54和MMP-9在转移灶内的表达则低于原发灶。结论:本模型模拟了临床肿瘤根除术后发生远处转移的过程,结果提示肺癌转移的发生可能与部分粘附分子的表达异常相关,同时为研究肺癌转移机制和术后抗转移治疗提供了理想的动物模型。

杂色曲霉素诱导体外培养人外周血淋巴细胞凋亡的研究

目的：研究我国肿瘤高发区饮食污染霉菌毒素－杂色曲霉素（ＳＴ）对人免疫机能的可能影响。方法：流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）、形态学观察及ＤＮＡ电泳。结果：ＳＴ可诱导体外培养的人外周血淋巴细胞发生凋亡，并且在一定时间（２～４８ｈ）及剂量（０１２５～２．０ｍｇ／Ｌ）范围内呈正相关关系。光镜及透射电镜观察均发现了凋亡细胞典型的形态学变化，如核染色质凝集边集，凋亡小体形成等；ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳也出现特征性的ＤＮＡＬａｄｄｅｒ条带。结论：ＳＴ可诱导人外周血淋巴细胞发生凋亡。