一株蝗虫病原菌的分离和鉴定

从内地黄脊竹蝗自然病死虫尸内分离到一种病原菌,其纯培养物经KOCK病症律证明,并按《伯杰细菌鉴定手册》(第九版)的方法进行了生物学测定、生理生化实验,并测定了其DNA中G+Cmol含量为63.73％,确定该病原物为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)。经生物测定,该菌对草地蝗虫和黄脊竹蝗有较强的感染力,对草地其他害虫也有一定的感染力。

我国不同森林立地带Bt分离株杀虫晶体蛋白及基因分析

利用苏云金芽孢杆菌cry基因的PCR RFLP鉴定体系和SDS PAGE方法分析了来自我国不同森林立地带土壤中的 72株苏云金芽孢杆菌的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11、cry1I等 10类基因类型和表达蛋白 ,并进行了杀虫活性的生物测定。研究表明 :同时含有cry1,cry2 ,cry1I 3类基因的有 2 1株菌 ,6株菌含有cry1,cry2类基因 ,4株菌含有cry1和cry1I类基因 ,只含有cry1基因的有 1株 ,cry2类基因的 4株 ,36株菌不含所鉴定的 10类cry基因。同时证明 ,绝大多数含有cry1基因的菌株表达了 130kDa蛋白 ,含有cry2基因的菌株表达了 6 0kDa蛋白。生物活性测定表明 ,共同含有cry1Aa、cry1Ac和cry2基因的菌株对棉铃虫幼虫具有较强的杀虫活性 ,只含有单一基因和不含上述基因的菌株杀虫活性较弱。

苏云金芽孢杆菌杀虫机理及害虫对其抗性机制的研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白具有高度专一性,其只对靶标害虫有效,对天敌等其他昆虫无害,转Bt基因植物和Bt杀虫剂是目前世界上产量最大、应用最广泛的生物防治技术。通过对Bt的发现和分类、Bt的结构与功能、Bt毒蛋白的杀虫机理、昆虫对Bt的抗性机制及昆虫体内Bt受体蛋白与抗性的关系等研究现状的论述与分析,对Bt作物害虫抗性治理策略和前景进行了展望。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5，对218株Bt菌株进行PCR鉴定，有51株含有vip3A类基因，其中12株为不同亚种的标准菌株，有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因，并插入表达载体pET—21b，转化大肠杆菌BL21，诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白，表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性，LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg，对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列)，杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低，说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。

一株几丁质酶产生菌的分离鉴定及其灭蝗增效作用

从土壤中分离到一株几丁质酶活性较高的细菌,其48 h发酵液的酶活力达到110 U／mL。Biolog MicroStation全自动细菌鉴定系统鉴定确认,该菌为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的一个亚种。该菌与类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoaligenes)等量混合制成一种新的混合型生物灭蝗剂在防治蝗虫上比其单一菌株有明显的增效作用,对蝗虫平均死亡率达93.33％。

对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌菌株的分离及鉴定

从我国3种典型植被覆盖的6个地区的土壤样品分离得到了348株苏云金芽孢杆菌菌株,采用杀虫活性测定方法从中获得了32株对小地老虎具有高毒力的菌株。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析法,研究了这32株苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因类型和晶体蛋白表达情况,对小菜蛾、二化螟、棉铃虫的杀虫活性测定也证明了苏云金芽孢杆菌cry基因类型、表达蛋白及杀虫活性间的相关性。

解淀粉芽孢杆菌对山茶灰斑病菌的抑制作用

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其分泌物对山茶灰斑病病原菌茶褐斑拟盘多毛孢(Pestalotiopsis guepini(Desm.)Stey)具有较好的拮抗作用。采用正交试验法探究了碳源、氮源、pH值、温度、接种量等因子对解淀粉芽孢杆菌产拮抗物质的影响。结果表明:最佳碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。最佳优化条件为25℃、蛋白胨0.3 g、葡萄糖0.5 g、pH值6.0、每125 mL接种2 mL孢子悬液于300 mL锥形瓶中震荡培养。基于生长曲线的测定,通过研究解淀粉芽孢杆菌培养时间与代谢产物拮抗活性的关系,得到解淀粉芽孢杆菌对茶褐斑拟盘多毛孢的最佳作用时间为72 h,抑菌值达0.85。

类产碱假单胞菌杀虫物质的分离纯化和鉴定

类产碱假单胞菌是一株昆虫病原菌，该菌对草地蝗虫、竹蝗等具有良好的致死作用，经鉴定，该菌对蝗虫具有毒杀作用的物质为其代谢分泌到胞外的一种蛋白质。类产碱假单胞菌培养物经硫酸按沉淀，SephadexG-100凝胶过滤及DEAE-SephadexA-50阴离子交换柱层析，纯化获得的杀虫蛋白只含一种亚基，分子量25100，等电点5．16，含17种氨基酸，其中谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低，最大吸收峰为278．3nm。

外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达

【目的】研究构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)工程菌的方法。在构建Bt工程菌时,高拷贝外源质粒的转入导致Bt芽孢数量减少,芽孢形成期延滞,影响Bt菌株的杀虫活力。而且,外源质粒在Bt中的稳定性较差,外源基因容易丢失。将基因整合入染色体是一种构建遗传性状稳定、杀虫活力高的Bt工程菌的有效方法。【方法】本研究采用PCR技术,分两段扩增定位于Bt无晶体突变株XBU001染色体上的trigger factor基因片段作为同源臂,克隆入温度敏感型载体pKSV7,构建了定点整合载体pKTF12。并利用pKTF12质粒将cry1Ac基因定点整合入XBU001染色体上。【结果】利用载体pKTF12将cry1Ac定点插入triggerfactor位点,对宿主菌XBU001的正常生长没有影响。重组菌株KCTF12中的cry1Ac基因能够稳定遗传、表达并形成菱形晶体。与携带高拷贝外源质粒的Bt菌株HTX42相比较,KCTF12具有芽孢数量增多、芽孢形成期提前的优势。【结论】定点整合法是一种构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因Bt工程菌的有效方法。

芒果主要病原菌拮抗微生物的分离筛选

研究了19株拮抗菌对芒果炭疽病菌和蒂腐病菌的拮抗作用,其中以X-98-2对2种病原菌拮抗作用最强,其发酵液可大大降低芒果炭疽病和蒂腐病的发病率,提高芒果贮藏期的果品质量,经初步鉴定该菌为芽孢杆菌属。采用GC／MS对其发酵上清液分析表明,其抑菌活性成分为氨基糖苷类抗生素。

枯草芽孢杆菌抗菌物质对镰刀菌抑制机理的镜下研究

将枯草芽孢杆菌B－903菌株液体培养72h后，将培养滤液高温灭菌，以不同比例将培养滤液加入镰刀菌孢子悬浮液中，置于扫描电镜和光学显微镜下定时观察。在处理12h后，镰刀菌孢子芽管顶端、菌丝末端及菌丝中央的多处细胞均可发生畸形的球状结构，这种畸变结构随处理时间延长而增加，致使菌丝变成捻珠状。处理36h后，畸变球形细胞及菌丝纷纷断裂离解，细胞内含物渗出，致使大部分细胞成为空泡。到处理48h后，镜下几乎无完整菌丝，均成单个的球状细胞空泡，这些空泡最终胞壁崩裂，不复存在。笔者认为正是枯草芽孢杆菌在生活过程中分泌到体外的抗高温代谢物对镰刀菌孢子和菌丝细胞的这种畸变作用造成拖子和菌丝失活，侵染能力丧失。

内生细菌与木霉复合处理诱导甜瓜对枯萎病的抗性

在对甜瓜枯萎病温室防效试验的研究中发现,内生枯草芽孢杆菌B6菌株与绿色木霉T23菌株复合处理的相对防效达82.22%,比B6和T23的单独处理分别提高32.8%和146.7%。分析比较了B6和T23单独和复合处理甜瓜幼苗后,甜瓜根部防御反应相关酶系苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、-β1,3-葡聚糖酶比活性的变化趋势。结果表明:内生细菌B6和木霉T23复合接种,其苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶和-β1,3-葡聚糖酶比活性比单独接种有不同程度的增强,这种变化在挑战接种甜瓜枯萎病菌之后更加明显。

嗜线虫致病杆菌杀虫毒素对棉铃虫的中肠组织病理学研究

嗜线虫致病杆菌HB310菌株与小卷蛾斯氏线虫HB310共生,对多种昆虫均具有较高生物活性。本实验通过盐析和非变性凝胶电泳等方法从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化出具胃毒活性的蛋白毒素Ⅱ。经毒素Ⅱ处理的棉铃虫幼虫,中肠组织的病理学变化类似于发光杆菌Tca毒素和Btδ-内毒素。棉铃虫4龄幼虫口服毒素Ⅱ6h后中肠组织开始发生变化:首先围食膜前端破碎,中肠柱状细胞伸长;随着时间推移,12h后整个围食膜被破坏消失,中肠组织病变加重,肠壁细胞排列疏松混乱;随着毒素作用的逐渐减弱,处理72h后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。毒素Ⅱ离体处理棉铃虫围食膜,同样可以导致围食膜破碎。

HcNPV和Bt复配对美国白蛾的致病性

采用室内生物测定法,研究了美国白蛾核多角体病毒和苏云金杆菌复配对寄主美国白蛾的致病性。结果表明,Bt浓度为10或25mg/L对美国白蛾核多角体病毒的毒力有增效作用;美国白蛾核多角体病毒浓度为1.6×10^5、1.6×10^6、1.6×10^7PIBs/ml对Bt的毒力有增效作用,两病原相互增效作用明显。二者复合感染与美国白蛾核多角体病毒单独使用相比,合剂使LT50缩短0.5-2.1d,缩短了美国白蛾幼虫死亡时间,加快美国白蛾核多角体病毒致死速度。并对混合感染中病原的相互作用做了初步研究。

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。

蜡质芽孢杆菌aiiA基因的克隆及融合表达

设计一对可扩增aiiA基因完整的开放阅读框的简并引物对aiiA1和aiiA2,通过PCR技术对3株蜡质芽孢杆菌(Bc)的aiiA基因进行检测.结果表明,它们均含有aiiA基因.利用pMD18-T克隆载体直接从GP7菌株的PCR产物中克隆了aiiA基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号:AY943831)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.该蛋白质推测的分子质量为28 ku,等电点约4.235.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为Bc组aiiA基因(87%-99%).在氨基酸序列多重比较的基础上,应用PHYLIP软件构建了A iiA蛋白的系统发育树.此外,利用原核融合表达载体pMXB10初步研究了A iiA、几丁质结合蛋白(CBD)及Inte in融合蛋白诱导表达的情况.

苏云金杆菌营养期杀虫蛋白的研究

营养期杀虫蛋白 (vegetativeinsecticidalproteins ,VIPs)是苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白。VIPs主要分为VIP1、VIP2和VIP3三种。VIP1和VIP2构成二元毒素 ,对鞘翅目叶甲科的昆虫具有杀虫特异性 ;而VIP3对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性。VIP1和VIP2的杀虫作用机理还不清楚 ;VIP3通过诱发细胞凋亡 ,最终导致昆虫死亡 ,这种作用机理与Bt杀虫晶体蛋白的作用机理完全不同 ,这为筛选新的杀虫活性物质提供了新的思路。vip基因现已被应用于转基因杀虫植物的构建 ,得到高效抗虫的多价转基因玉米。此外 ,VIPs嵌合蛋白的构建、vip及其融合基因导入其它许多宿主微生物等方面的研究也具有诱人的潜在应用前景。

生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)制剂是目前应用广泛而有效的一种微生物杀虫剂.本文介绍了苏云金芽孢杆菌的菌种优选、发酵过程及剂型研究进展,具体阐述了发酵过程中培养基和发酵条件的优化、各种发酵方式和发酵设备等.指出了目前发酵生产苏云金芽孢杆菌中存在的问题,提出了解决问题的建议并展望了其发展前景.

光肩星天牛刻槽中一种细菌及其对天牛幼虫的致病性

在分离光肩星天牛刻槽微生物时筛选出一种红色杆状细菌,经常规方法鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。室内试验显示该菌对天牛低龄幼虫有致死作用。用5个浓度梯度（7.8×10^10 - 2.0×10^7）接种低龄幼虫,结果显示,最高浓度剂量下幼虫死亡率可达80.6%,最低剂量下也有16.1%的死亡率。毒力回归方程为Y=0.6116x-0.6441,LD50=1.69×10^9个/ml。在野外试验中,将菌液喷于木段表面并将天牛成虫置于罩网木段上,使其产卵于木段,结果显示有皮下幼虫感染该菌致死,但防治效果仅有5.3%。

苏云金芽孢杆菌对松材线虫的杀线活性

在室内条件下,测定了17株苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis伴孢晶体蛋白对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的杀线活性。通过初筛,发现菌株020、RBT-200701的伴孢晶体蛋白对松材线虫有明显毒杀作用。在测试的浓度范围内（菌株020为6.37-203.9μg/ml;RBT-200701为13.7-438.8μg/ml）,菌株对松材线虫的校正死亡率随其浓度增大而提高;随时间延长杀虫效果提高。020菌株晶体蛋白24h、48h时对松材线虫的LC50、LC95分别为183.20、408.20μg/ml和80.132、25.29μg/ml;RBT-200701菌株伴孢晶体蛋白24、48h时对松材线虫的LC50、LC95分别为368.00、868.00μg/ml和82.73、382.73μg/ml。SDS-PAGE分析发现这2个菌株晶体蛋白的蛋白图谱不同。