猪瘟病毒E^(rns)蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)E^(rns)蛋白多克隆抗体,为进一步研究E^(rns)蛋白结构和功能及解析CSFV的致病机理提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法预测E^(rns)蛋白结构。以真核表达载体pCMV-HA-E^(rns)为模板,PCR克隆CSFV E^(rns)基因,构建原核表达载体pET-32a-E^(rns)。将pET-32a-E^(rns)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,添加IPTG诱导E^(rns)蛋白表达,确定Erns蛋白表达形式。利用Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,以获得高纯度的E^(rns)蛋白。采用背部皮下多点注射法免疫小鼠,经4次免疫后采集小鼠血液,分离血清制备获得Erns蛋白多克隆抗体,并检测其效价和特异性。【结果】E^(rns)蛋白不含信号肽和跨膜结构域,为亲水性蛋白,含有多个B细胞抗原表位;E^(rns)基因片段大小为681 bp,其重组蛋白主要以包涵体形式表达;E^(rns)蛋白多克隆抗体对原核表达的重组蛋白效价为1∶64000,对真核表达的重组蛋白效价为1∶1000,且能特异性识别CSFV。【结论】制备获得的E^(rns)蛋白多克隆抗体具有效价高和特异性强等特点,可用于ELISA和Western blotting检测细胞中E^(rns)蛋白水平。E^(rns)蛋白多克隆抗体的制备有助于更好地理解E^(rns)蛋白在CSFV感染和免疫过程中的作用,对深入研究E^(rns)蛋白功能、CSFV生物学特性及猪瘟的防治和诊断方法的开发具有重要意义。

基于16S rRNA基因及宏基因组测序解析藏猪肠道菌群组成特征

【目的】旨在通过分析藏猪肠道菌群组成及其功能注释,探讨藏猪肠道菌群与其耐粗饲和抗逆性能的关系。【方法】以66头藏猪粪便微生物为试验材料,提取DNA样本,利用16S rRNA基因测序技术分析在门水平和属水平藏猪的肠道菌群组成,构建共有核心菌的菌群互作网络,结合27头藏猪肠道微生物宏基因组测序数据,进行KEGG通路和碳水化合物代谢酶(CAZymes)数据库注释分析,以期阐明与藏猪纤维代谢能力强和抗病力等优良特性相关的功能通路。【结果】(1)16S rRNA测序分析结果显示,拟杆菌门(Bacteroidetes)(39.34%~60.72%)和厚壁菌门(Firmicutes)(24.65%~38.5%)在藏猪肠道微生物门水平上占优势,而在属水平则依次是普雷沃氏菌属(Prevotella)、密螺旋体属(Treponema)和琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)的丰度最高;(2)利用Cytoscape软件构建藏猪肠道样品中共有的26个核心菌属之间的互作网络,各菌群在网络中存在合作关系和竞争关系,证明藏猪肠道菌群结构比较稳定;(3)宏基因组鸟枪法测序结果显示,在KEGG功能注释中藏猪肠道主要富集营养物质合成代谢和遗传信息处理相关通路,包括氨基酸的生物合成、碳代谢、群体感应通路等。此外,使用CAZymes数据库注释显示藏猪肠道中的糖基转移酶(GTs)基因家族相对丰度最高,主要为GT2、GT4和GT41基因,其次是糖苷水解酶基因家族(GHs)的GH13、GH2和GH3基因。【结论】藏猪具有丰富且独特的微生物组成和功能通路,与免疫和抗病相关的疣微菌门(Verrucomicrobia)和阿克曼氏菌(Akkermansia)是藏猪肠道特有的高丰度菌属,可能与藏猪适应高海拔低氧低温的环境及其抗病性能有关;与粗纤维代谢相关的密螺旋体属Treponema、Sphaerochaeta、纤维杆菌属Fibrobacter在藏猪肠道中富集,能够帮助藏猪降解饲粮中的粗纤维,适应半放牧的饲养模式。研究结果有助于了解肠道微生物在藏猪耐粗饲和抗逆性中的作用机制,为今后对藏猪优良特性的开发利用提供新的思路。

基于转录组测序的巴马香猪和杜洛克猪骨骼肌差异lncRNA分析

【目的】通过对巴马香猪和杜洛克猪背最长肌组织进行转录组测序鉴定差异表达lncRNA,筛选与骨骼肌发育形成相关的候选基因,为明确lncRNA对骨骼肌生长发育的调控机制提供理论基础。【方法】采集12月龄的巴马香猪和杜洛克猪背最长肌组织进行转录组测序,以错误发现率(FDR)<0.05且|log2Fold Change|>1为标准筛选差异表达基因(DEGs)和差异表达lncRNA,并进行实时荧光定量PCR验证,预测差异表达lncRNA靶基因并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,选取表达差异最大的lncRNA构建其与靶基因互作网络。【结果】在巴马香猪和杜洛克猪背肌间共鉴定出6316个DEGs和675个差异表达lncRNA;GO功能注释分析结果表明,差异表达lncRNA靶基因主要涉及代谢过程、肌肉组织发育及骨骼肌细胞增殖和分化等生物过程;KEGG信号通路富集分析结果表明,差异表达lncRNA靶基因在Hippo和Wnt信号通路显著富集(P<0.05),说明差异表达lncRNA与骨骼肌细胞的增殖、自噬和分化相关;对表达差异最大的lncRNA-MSTRG.16703进行实时荧光定量PCR验证,发现其在巴马香猪中的相对表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),与转录组测序结果一致。lncRNA-MSTRG.16703与靶基因互作网络分析结果表明,上调靶基因包括QKI、MBNL1和YBX2,QKI和MBNL1在均与可变剪接相关。【结论】在巴马香猪和杜洛克猪间发现的差异表达lncRNA是调控骨骼肌发育的候选基因,其靶基因主要富集在Hippo和Wnt等骨骼肌发育相关信号通路。lncRNA-MSTRG.16703的表达差异最大且在巴马香猪中上调,其靶基因在骨骼肌细胞增殖分化和肌纤维形成中有重要调控作用。

广西巴马小型猪内脏器官生长发育及血清生化指标研究

本研究旨在分析广西巴马小型猪不同生长阶段内脏器官、肠道组织形态发育以及血清生化指标的变化,为保护广西地方小型猪品种、医学动物模型的开发提供参考。实验猪由广西大学巴马小型猪繁育中心实验牧场培育,在0、30、60、90、120、180日龄时分别选择4头健康且体重相近的母猪进行屠宰,采集血液、心、肝、脾、肺、肾、空肠和回肠,测定不同日龄下广西巴马小型猪内脏器官的重量和血清生化指标,测定30、90、180日龄的空肠、回肠肠绒毛长度、数量和小肠腺平均直径、数量。结果表明:在所测日龄内,广西巴马小型猪内脏器官的生长强度顺序依次为肝脏、肺脏、肾脏、心脏、脾脏,其相对生长速度由快到慢依次为脾脏、肝脏、肺脏、心脏、肾脏。90日龄和180日龄广西巴马小型猪的空肠绒毛长度显著高于30日龄;180日龄的空肠绒毛数量显著高于30日龄;180日龄的空肠肠腺直径显著高于90日龄与30日龄;90日龄空肠肠腺数量达到最高后下降,180日龄的空肠肠腺数量显著低于90日龄。90日龄和180日龄广西巴马小型猪的回肠绒毛长度显著高于30日龄;30日龄的回肠绒毛数量显著高于180日龄;180与90日龄的回肠肠腺直径显著高于30日龄;随着日龄的增加,回肠肠腺数量呈上升趋势,但每个时期差异均不显著。本实验结果说明,广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏与肾脏的生长速度在0~30日龄最大;广西巴马小型猪肝脏发育的基本结构单位肝小叶在30日龄左右时基本形成,其肝脏组织结构发育的稳定期推测可能在210~240日龄,由于样本有限,具体发育稳定期有待后续研究;随着日龄增长,广西巴马小型猪空肠、回肠的肠绒毛和肠腺发育不断完善,但是空肠肠绒毛与肠腺的生长发育比回肠更好,推测空肠是饲料消化吸收的主要场所。

香苏杂交猪KAT2B基因多态性与其生长性状的关联分析

【目的】了解香苏杂交猪组蛋白乙酰转移酶P300/CBP结合因子(KAT2B)基因在组织中的表达量,筛选其单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,并分析基因多态性与生长性状的关联性,为香苏杂交猪新品系培育提供参考依据。【方法】以香苏杂交猪为研究对象,采用实时荧光定量PCR检测KAT2B基因在3日龄和6月龄不同组织中的相对表达量,通过直接测序检测KAT2B基因的SNP位点,统计SNP位点等位基因频率、基因型频率、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)及平均多肽信息含量(PIC)等,以卡方(χ^(2))检验分析基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡状态,分析不同基因型与香苏杂交猪生长性状的关联性。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,KAT2B基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌6个组织中均有表达,与3日龄相比,6月龄KAT2B基因相对表达量在肝脏和脾脏组织中极显著升高(P<0.01,下同),在肺脏中极显著降低。KAT2B基因Exon-2、Exon-14和Exon-15区域均分别存在1个外显子突变,分别为g.36682G>A、g.104540G>T和g.106651A>G,3个SNPs位点PIC均处于中度多态性水平且Hardy-Weinberg平衡。g.36682G>A位点优势基因型为GA型,等位基因频率G>A;g.104540G>T位点优势基因型为GG型,等位基因频率G>T;g.106651A>G位点优势基因型为AA型,等位基因频率A>G。关联分析结果表明,g.36682G>A位点各基因型生长性状之间无显著差异(P>0.05),g.106651A>G位点AA基因型与AG基因型胸深存在显著差异(P<0.05)。【结论】香苏杂交猪KAT2B基因在各组织中均有表达且存在3个SNPs位点(g.36682G>A、g.104540G>T和g.106651A>G),KAT2B基因可作为与香苏杂交猪生长性状相关的候选基因。

柯乐猪XDH基因多态性鉴定及其对繁殖性状的影响

【目的】明确黄嘌呤脱氢酶基因(XDH)单核苷酸多态性(SNP)位点与柯乐猪繁殖性状的关联性,为加速柯乐猪的育种进程提供理论依据。【方法】选取87头健康经产柯乐母猪为研究对象,采用Sanger测序法筛查出XDH基因SNP位点,利用SPSS 22.0中的一般线性模型(GLM)分析SNP位点与柯乐猪繁殖性状指标(产活仔数、初生窝重、平均初生重、断奶仔猪数、断奶窝重及平均断奶重)的关联性,并通过RNAfold web server、ExPASy-ProtParam、NovoPro和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析。【结果】在柯乐猪XDH基因上共筛选获得12个SNPs位点,分别是第33内含子上的g.108047658C>G和g.108047680C>A位点,第34内含子上的g.108048009C>T、g.108048044T>C、g.108048046T>C、g.108048047C>T、g.108048054C>T、g.108048153A>T、g.108048208A>G、g.108048212T>C和g.108048242C>T位点,第34外显子上的g.108047915G>A位点。12个SNPs位点均存在3种基因型,属于中度多态位点(0.25<PIC<0.50);g.108048047C>T、g.108048208A>G、g.108048242C>T、g.108048044T>C、g.108048046T>C和g.108048212T>C位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE>0.05),其余6个SNPs位点的基因型分布则显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(PHWE<0.05)。除g.108047658C>G位点与g.108047680C>A位点、g.108048044T>C位点与g.108048046T>C位点、g.108048046T>C位点与g.108048047C>T位点间存在强连锁不平衡关系外,其余各SNP位点间均不存在强连锁不平衡关系。g.108047658C>G和g.108047915G>A位点对柯乐猪产活仔数的影响达显著水平(P<0.05,下同),g.108047658C>G位点表现为CG基因型个体的产活仔数显著高于GG基因型个体,g.108047915G>A位点表现为AG基因型个体的产活仔数显著高于AA基因型个体。g.108047915G>A位点突变导致柯乐猪XDH基因mRNA二级结构发生改变,最小自由能由-1508.90 kcal/mol上升到-1507.80 kcal/mol;且XDH基因等位基因G的突变还导致其编码蛋白分子式、相对分子量、理论等电点(pI)、不稳定系数及蛋白高级结构发生改变。【结论】柯乐猪XDH基因第33内含子g.108047658C>G位点和第34外显子g.108047915G>A位点对其产活仔数的影响达显著水平,可作为柯乐猪繁殖性状改良的潜在分子辅助标记。

味觉受体T1R1和T1R3在从江香猪附睾不同区段的差异表达

【目的】明确从江香猪附睾中不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况,为揭示猪附睾不同区段形成特殊微环境保障精子成熟的作用机制提供参考依据。【方法】采集初情期(30d)和性成熟期(180d)从江香猪附睾组织样品,分别采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学、蛋白免疫印迹(Western blotting)等检测从江香猪附睾不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况。【结果】味觉受体T1R1/T1R3的编码基因TAS1R1/TAS1R3均表现为附睾Ⅳ区的相对表达量显著高于其他区段(P<0.05,下同),而Ⅰ区的相对表达量显著低于其他区段,具体排序为Ⅳ区>Ⅴ区>Ⅱ区>Ⅲ区>Ⅰ区。免疫组织化学定位分析结果显示,在从江香猪附睾不同区段均检测到T1R1/T1R3不同程度的免疫阳性信号。其中,T1R1在附睾Ⅰ区主要定位于肌样细胞层与基细胞核;在附睾Ⅱ区主要定位于附睾上皮细胞、肌样细胞和精子细胞;在附睾Ⅲ区强烈定位于附睾管腔和微绒毛根部;附睾Ⅳ区为5个区段中表达最强烈的部位,定位于附睾管腔精子、管腔内缘和狭窄细胞膜上;在附睾Ⅴ区主要定位于附睾间质组织和狭窄细胞膜上。T1R3定位于附睾Ⅰ区血管内皮细胞、脱落生精细胞和附睾上皮细胞(尤其是基细胞);在附睾II区的精子、晕细胞和狭窄细胞上有较强表达;在附睾Ⅲ区和Ⅳ区主要定位于空泡化的附睾上皮细胞;在附睾Ⅴ区定位于附睾管不规则处和空泡化附睾上皮细胞,其表达强度仅次于Ⅲ区。Western blotting检测结果显示,从江香猪附睾Ⅳ区的T1R1/T1R3表达水平最高,其次是Ⅱ区,二者显著高于其他区段。【结论】初情期从江香猪附睾T1R1和T1R3的表达具有区段特异性和细胞特异性,以Ⅳ区的表达水平最高,且主要定位于附睾上皮细胞顶端、狭窄细胞和微绒毛根部,提示T1R1/T1R3在建立促进猪附睾精子成熟和储存的特殊腔内微环境中发挥重要作用。

热应激对从江香猪十二指肠黏膜结构、HIF-1及其相关蛋白表达的影响

旨在研究热应激(heat stress,HS)对从江香猪十二指肠黏膜屏障结构的影响,同时跟踪检测低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的表达特征及调控机制。试验选取24头育肥期从江香猪,随机分为6组,除对照组(Con),其余5组进行不同时间热应激处理(6、12、24、48、72 h),试验过程中检测从江香猪直肠温度和呼吸频率,试验结束时采集各组从江香猪十二指肠。苏木精-伊红染色(HE)和阿利新蓝-过碘酸雪夫反应(AB-PAS)观察各组十二指肠组织结构和杯状细胞数量变化;TUNEL染色检测十二指肠细胞凋亡率;实时荧光定量(qRTPCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学分别检测紧密连接相关蛋白、HIF-1及其上游调控因子HSP90和PHD-2的表达变化。结果显示,与对照组相比,热应激可使从江香猪直肠温度和呼吸频率明显升高,肠绒毛高度下降,隐窝深度增加,绒腺比降低,闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白1(ZO-1)表达水平呈时间依赖性下降,杯状细胞数量增多。TUNEL检测结果显示,HS处理72 h后,十二指肠上皮细胞凋亡率显著上升(P<0.001)。免疫组织化学、qRT-PCR和Western blot对HIF-1α、HSP90和PHD-2的表达进行检测,结果显示,相较于对照组,HS处理72 h后十二指肠黏膜上皮HIF-1αmRNA和蛋白表达量随HS时间延长而增加;HSP90阳性细胞在对照组和热应激组中均集中于黏膜上皮,其表达趋势与HIF-1α一致;PHD-2表达特征与HSP90相反,其表达强度在HS组中明显减弱,且随HS时间增加,PHD-2 mRNA和蛋白水平均呈时间依赖性下降。以上结果说明,HS可引起十二指肠上皮细胞凋亡,损伤十二指肠黏膜屏障;HIF-1的表达升高与十二指肠细胞凋亡密切相关,且可能同时受HSP90和PHD-2调控。

基于转录组测序的藏猪睾丸组织性成熟相关基因鉴定

【目的】基于转录组测序分析筛选出藏猪睾丸组织中的性成熟相关基因,为提高藏猪的繁殖育种性能提供参考依据。【方法】以性成熟前(2月龄)和性成熟后(24月龄)的藏公猪为研究对象,通过人工阉割法采集藏猪睾丸组织进行转录组测序,依据错误发现率(FDR)<0.05且|log_(2)FoldChange|>1的标准筛选差异表达基因(DEGs),综合GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析筛选出藏公猪性成熟相关候选基因,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序结果的准确性。【结果】经转录组测序,从性成熟前后藏猪睾丸组织样品中筛选出5929个DEGs,其中有3822个DEGs呈上调表达、2107个DEGs呈下调表达。筛选获得的5929个DEGs主要注释到生精过程、纤毛运动、鞭毛精子运动、运动纤毛、精子主块、精子顶囊、动力蛋白轻链结合、动态蛋白中间链结合等与精子发生和精子运动等有关的GO功能条目;KEGG信号通路富集分析发现,DEGs主要富集于受体相互作用通路、轴突引导通路、神经活性配体—受体相互作用通路、钙信号通路等;综合DEGs的GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析结果,共筛选出9个与藏公猪性成熟相关的基因,分别是BAX、DMRT1、FSHR、IGF1R、IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3和TNP2。实时荧光定量PCR检测结果显示,BAX、DMRT1、FSHR、IGF1R等4个基因在性成熟后藏猪睾丸组织中的相对表达量较性成熟前呈明显的下降趋势,且下降幅度均在50%以上;IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3、TNP2等5个基因的相对表达量较性成熟前上升了1.07~30.25倍,其中IZUMO1、LYZL4和LYZL6基因的上升倍数达极显著水平(P<0.01),与转录组测序结果基本一致。【结论】基于转录组测序分析从藏猪睾丸组织中筛选获得9个与性成熟相关的DEGs,即BAX、DMRT1、FSHR、IGF1R、IZUMO1、LYZL4、LYZL6、SYCP3和TNP2,可作为研究藏猪繁殖育种能力的主要候选基因。

柯乐猪TAC3R基因SNP位点鉴定及其对繁殖性状的影响

【目的】探究速激肽受体3基因(TAC3R)单核苷酸多态性(SNP)位点与柯乐猪繁殖性能的关联性,筛选出与繁殖性状相关的遗传标记,为加速柯乐猪的品种改良提供技术支撑。【方法】选取195头2胎以上的健康经产柯乐猪为研究对象,运用Sanger直接测序法鉴定TAC3R基因SNP位点,利用SHEsisPlus计算各SNP位点的群体遗传参数,并以SPSS 22.0中的一般线性模型(GLM)分析SNP位点基因型和双倍型对柯乐猪5个繁殖指标的遗传效应。【结果】在柯乐猪TAC3R基因上共检测到5个SNPs位点:g.117686266T>C、g.117686381A>G、g.117686384A>G、g.117688503T>C和g.117688518T>C。g.117686381A>G位点与g.117686384A>G位点间完全连锁,g.117688503T>C位点与g.117686266T>C、g.117686381A>G和g.117686384A>G位点间不存在连锁关系,而其他各SNP位点间均存在强连锁不平衡关系。5个SNPs位点联合共检测到5种单倍型和10种双倍型,单倍型中以H5的频率最高(0.433)、H2的频率最低(0.059),双倍型中以H3H5的频率最高(0.221)、H1H4的频率最低(0.031)。5个SNPs位点在柯乐猪群体中均呈中度多态性(0.25<PIC<0.50),且其基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(χ^(2)-HWE<5.991)。g.117688503T>C位点显著影响窝均产仔数和断奶仔猪数,TT基因型个体的窝均产仔数和断奶仔猪数显著高于CC基因型个体;g.117688518T>C位点显著影响断奶仔猪数,CC基因型个体显著高于TT基因型个体。柯乐猪TAC3R基因SNP位点双倍型与其繁殖性状的关联分析发现,H2H4型为窝均产仔数、窝均产活仔数和窝断奶仔猪数3个指标的最优双倍型,H1H3型为平均断奶重指标的最优双倍型。【结论】在柯乐猪TAC3R基因上检测到5个SNPs位点,其中g.117688503T>C和g.117688518T>C位点对柯乐猪的繁殖性能有显著影响。TAC3R基因可作为柯乐猪繁殖性状的候选基因,双倍型H2H4可作为分子标记辅助选择的参考。

基于转录组测序的剑白香猪表皮颜色相关miRNA筛选与鉴定

【目的】对剑白香猪黑色和白色表皮组织进行转录组测序,筛选出对黑色素生成起调节作用的miRNA,为进一步研究miRNA对剑白香猪表皮颜色形成的调控机制提供理论依据。【方法】以剑白香猪黑色和白色表皮组织为试验材料进行转录组测序,以|log2FoldChange|≥1且错误发现率(FDR)≤0.05为标准,采用DESeq2筛选差异表达miRNA,使用miRanda和RNAhybrid预测差异表达miRNA靶基因并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,构建差异表达miRNA、靶基因和KEGG信号通路互作网络,利用实时荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证。【结果】从剑白香猪黑色和白色表皮中鉴定出280个已知miRNA和618个新miRNA,筛选出17个差异表达miRNA,白色表皮较黑色表皮有10个miRNA上调表达,7个miRNA下调表达。共预测获得1327个靶基因,GO功能注释分析结果显示,在生物学过程中,差异表达miRNA靶基因主要涉及上皮发育、细胞增殖和分解代谢过程等条目;在细胞组分和分子功能中,主要涉及细胞质、细胞质囊泡、ATP结合和催化活性等条目。KEGG信号通路富集结果显示,靶基因在磷脂酰肌醇信号系统、黑色素生成和细胞色素P450等信号通路富集,其中ssc-miR-615靶基因包括CALM3、CREBBP、FZD5和DVL2,其富集通路均与表皮色素沉着有关,ssc-miR-221-3p靶基因TYRP1和ssc-miR-224靶基因RAB23富集的通路与黑色素生成有关。选取7个差异表达miRNA与靶基因TYRP1和RAB23进行实时荧光定量PCR验证,结果表明差异表达miRNA的表达变化与转录组测序分析的变化趋势一致,TYRP1和RAB23在剑白香猪黑色表皮中的表达量极显著高于白色表皮(P<0.01)。【结论】ssc-miR-615、ssc-miR-221-3p和ssc-miR-224是影响剑白香猪表皮颜色的候选基因,可能对剑白香猪表皮的黑色素形成有重要影响。

柯乐猪BMP7基因SNP位点与繁殖性能的关联分析

【目的】明确骨形态发生蛋白7基因(BMP7)单核苷酸多态性(SNP)位点与柯乐猪繁殖性能的关联性,挖掘柯乐猪繁殖性状的分子辅助标记,为加速柯乐猪繁殖性能提升及推进其品种改良进程提供技术支撑。【方法】选取150头健康经产柯乐母猪为研究对象,采用Sanger测序法筛查鉴定BMP7基因SNP位点,计算各SNP位点的群体遗传参数,并通过SPSS 22.0中的一般线性模型(GLM)分析SNP位点与柯乐猪总产仔数、初生窝重、平均初生重、断奶仔猪数、断奶窝重及平均断奶重等6个繁殖性状指标的关联性。【结果】在柯乐猪BMP7基因上共发现5个SNPs位点:g.57602289C>T(第2外显子)、g.57602334C>T(第2外显子)、g.57602404C>T(第2内含子)、g.57602418C>T(第2内含子)和g.57602561G>T(第2内含子),均存在3种基因型;5个SNPs位点的优势基因型分别为CT、CT、CT、CT和GT,对应的多态信息含量(PIC)介于0.358~0.375,均表现为中度多态(0.25<PIC<0.50)。5个SNPs位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态(P_(HWE)>0.05),且各SNP位点间均存在强连锁不平衡关系[LD系数(Dʼ)>0.800,相关系数(R^(2))>0.330]。关联分析结果显示,g.57602289C>T、g.57602334C>T和g.57602418C>T等3个位点TT基因型个体的初生窝重均显著高于CC基因型个体(P<0.05),TT基因型个体的断奶仔猪数极显著高于CC基因型和CT基因型个体(P<0.01,下同);g.57602404C>T位点TT基因型个体的总产仔猪数极显著高于CC基因型个体;g.57602561G>T位点TT基因型个体的总产仔猪数极显著高于GG基因型个体。此外,双倍型H2H2和H3H3个体的总产仔数、初生窝重、断奶仔猪数和断奶窝重均高于其他双倍型个体,尤其是H2H2个体在断奶仔猪数和初生窝重方面表现出明显优势。【结论】在柯乐猪BMP7基因上发现的5个SNPs位点均与其繁殖性能存在较强的关联性,BMP7基因可作为柯乐猪繁殖性状的候选基因,而双倍型H2H2可作为繁殖性状分子标记辅助选择的参考。

基于转录组测序发掘大河猪背脂沉积的关键基因

【目的】筛选和识别大河猪背脂沉积相关的关键候选基因。【方法】对高背膘和低背膘各6头大河猪的背部脂肪组织进行转录组测序,筛选差异表达基因并对其GO功能和KEGG通路富集进行分析,结合蛋白质—蛋白质互作网络构建,对大河猪背脂沉积关键基因进行发掘与鉴定,再随机挑选3个关键基因进行RT-qPCR验证。【结果】共检测到214个差异表达基因,在高背膘组大河猪中有107个基因上调,107个基因下调。这些基因极显著富集于氧酸代谢、有机酸代谢、脂质代谢、羧酸代谢等生物学过程,以及过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路、丙酮酸代谢、三羧酸循环等脂肪沉积调控通路(P<0.01),其中,PCK1、ME1、ACLY、ACACA、FASN和SCD为背脂沉积的关键基因。随机挑选的3个关键基因(PCK1、ACLY和ME1)在高、低背膘组大河猪背部脂肪中的表达差异达到显著或极显著水平(P<0.05或P<0.01)。【结论】研究结果初步鉴定了大河猪背脂沉积的关键基因,为深入揭示猪背脂沉积的分子机制及促进瘦肉率等背脂相关性状的遗传改良提供了科学基础和依据。

基于动物模型BLUP的杜洛克猪生长及繁殖性状选择进展

【目的】揭示基于动物模型最佳线性无偏预测(animal model best linear unbiased prediction,AM-BLUP)的选择指数对杜洛克猪生长及繁殖性状的选育效果。【方法】在采用AM-BLUP方法估计个体目标性状育种值基础上,以达100 kg体质量日龄(相对权重0.7)和100 kg活体背膘厚(相对权重0.3)为主选性状构建选择指数,对1个闭锁的杜洛克猪群开展持续7年(2013—2019年)的选育,系统分析选育期间猪群6个生长及繁殖性状表型值、估计育种值(estimated breeding value,EBV)、选择指数及近交系数的变化。【结果】相较于2013年,2019年猪群达100 kg体质量日龄、100 kg活体背膘厚和30~100 kg料重比分别极显著缩短4.45 d、降低0.52 mm和降低0.05(P<0.01);初产和经产母猪的总产仔数分别提高0.99头(P<0.05)和1.02头(P>0.05),产活仔数分别提高0.72头和0.49头(P>0.05),21日龄窝重分别降低0.39 kg和提高6.20 kg(P>0.05);主选性状达100 kg体质量日龄和100 kg活体背膘厚的EBV分别极显著降低3.447和0.533(P<0.01),选择指数极显著提高23.62(P<0.01),除30~100 kg料重比外,其余辅选性状的EBV均获得了不同程度改进。选育结束时,群体平均近交系数为3.1973%,年均增量为0.4904%。【结论】基于AM-BLUP的指数选择可有效改良猪的生产性状,但不同性状的具体选择进展会因其遗传特性的不同而异。

基于背膘厚度构建民猪肌内脂肪含量的预测模型

为了探究不同统计模型预测猪肌内脂肪含量和眼肌面积的可行性,试验利用测定的312头民猪的体重、背膘厚和日龄数据,以岭回归最佳线性无偏估计(ridge regression best linear unbiased prediction,rrBLUP)、贝叶斯B (Bayes B)、随机森林算法(Random Forest,RF)三种模型来预测民猪肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量和眼肌面积(eye muscle area,EMA),每种模型均采用5倍交叉法和去一法进行验证,比较预测结果以得出预测准确率较好的一种模型。结果表明:两种验证方法中,去一法的预测准确率要明显高于5倍交叉法,但计算效率较慢。在预测肌内脂肪含量的模型中,rrBLUP、Bayes B、RF模型的预测准确率分别为0.639,0.595,0.631,其中rrBLUP模型预测效果较好。在预测眼肌面积的模型中,rrBLUP、Bayes B、RF模型的预测准确率分别为0.618,0.464,0.642,其中RF模型预测效果较好。说明基于体重、日龄和背膘厚测定数据预测民猪IMF和EMA是可行的。

莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物菌群结构组成和功能分析

旨在研究莱芜猪盲肠和结肠肠道微生物群落的结构组成、功能以及与杜长大猪的区别,为从肠道菌群层面深入理解莱芜猪高脂肪沉积、耐粗饲和抗逆等特性奠定基础。以12头莱芜猪和6头杜长大猪为试验动物,采用高通量测序技术测定盲肠和结肠微生物菌群16S rRNA V3-V4区序列,分析微生物菌群的组成、丰度和多样性,预测生物功能,通过对莱芜猪和杜长大猪菌群丰度比较分析、LEfSe物种差异判别分析、微生物菌属与背膘厚和血清生化指标相关性分析,鉴定影响莱芜猪品种特性的微生物菌属。结果发现:1)莱芜猪的背膘厚和血清总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、高密度脂蛋白胆固醇等指标与杜长大猪存在显著性差异(P<0.05)。2)莱芜猪具有与杜长大猪不同的盲肠和结肠微生物菌群多样性和相对丰度,莱芜猪盲肠微生物菌群的Simpson指数显著高于杜长大猪(P<0.05),盲肠的厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度显著低于杜长大猪(69.16%vs.89.59%,P<0.05)。3)盲肠和结肠中一些微生物菌属的丰度与背膘厚和部分血清生化指标具有显著相关性(P<0.05),且与这些表型指标相关的盲肠微生物菌属比结肠更多,相关系数也更高,表明盲肠微生物菌群对猪的表型起到了更大的作用。4)甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、活泼瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)、拟杆菌属(Bacteroides)等与脂肪沉积、耐粗饲和抗逆性强等有关,可能是影响莱芜猪特性的微生物菌属。本研究阐述了莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物菌群特征,加深了肠道菌群对莱芜猪品种特性影响机理的了解,为地方猪肠道微生物资源的开发与利用奠定基础。

藏猪心肌细胞对低氧环境的适应性特征

【目的】探究藏猪心肌细胞对低氧环境的适应性特征。【方法】分离、鉴定藏猪和长白猪的心肌细胞并置于低氧(2%O_(2))和常氧(21%O_(2))环境下培养,观察分析不同时间对心肌细胞形态和增殖率变化的影响趋势。【结果】通过优化心肌细胞培养方法发现,在胰酶消化20 min并且选用CMM培养基时细胞贴壁生长良好,排列均匀,悬浮细胞较少。低氧培养时,心肌细胞呈现明显的纤维化且出现凝集性变化特征;培养72 h时,长白猪的心肌细胞纤维化和凝集性变化较藏猪更明显。低氧环境下培养藏猪和长白猪心肌细胞6 h时,藏猪的增殖率高于长白猪(42%),有助于其更好地适应低氧环境。【结论】藏猪心肌细胞适应低氧环境的能力明显高于长白猪心肌细胞,并且藏猪的心肌细胞所受损伤相较于长白猪心肌细胞明显较小。研究可为进一步揭示藏猪心肌细胞响应低氧机制提供参考,并为平原猪种引入高原低氧地区提供理论支持。

基于转录组测序的摘除卵巢藏姜母猪背最长肌脂代谢相关基因筛选与分析

【目的】探究摘除卵巢后藏姜母猪背最长肌脂肪沉积的动态规律,为揭示脂肪沉积的调控机制提供理论依据。【方法】于45日龄手术摘除藏姜母猪卵巢(试验组),对照组藏姜母猪在腹部相同部位进行创伤处理但不摘除卵巢。分别记录45、154和300日龄藏姜母猪的血清雌激素、甘油三酯和总胆固醇含量变化,300日龄屠宰采集背最长肌组织样品制作石蜡切片,并通过Illumina NovaSeq 6000测序平台完成测序。以|log2 Fold Change|>1且P<0.05为标准,采用DESeq2筛选出背最长肌组织中的差异表达基因(DEGs),通过GO和KEGG数据库分别进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析,找出可能参与脂代谢的基因,并以实时荧光定量PCR进行转录组测序结果验证。【结果】试验组藏姜母猪的血清甘油三酯含量显著高于对照组藏姜母猪(P<0.05,下同),总胆固醇含量极显著高于对照组藏姜母猪(P<0.01,下同),雌激素含量极显著低于对照组藏姜母猪,背最长肌脂肪含量显著低于对照组藏姜母猪。试验组与对照组藏姜母猪间存在278个DEGs,其中有33个DEGs与脂代谢相关。DEGs主要注释在胆汁酸分泌、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导、蛋白激酶B信号传导、G蛋白偶联受体结合、糖胺聚糖结合、趋化因子活性及趋化因子受体结合等GO功能条目上,且主要富集在糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、碳水化合物消化和吸收、MAP激酶丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、雌激素2-羟化酶活性及cGMP-PKG信号等KEGG信号通路中。实时荧光定量PCR检测到的目的基因表达趋势与转录组测序结果基本一致,表明转录组测序数据可靠。【结论】摘除卵巢后藏姜母猪血清雌激素水平降低,甘油三酯和总胆固醇水平升高,背最长肌的肌间脂肪含量降低,与CALML5、PLCZ1、PIK3C2G、IL6等33个参与脂代谢调控DEGs的差异表达有关,且涉及胆汁酸分泌、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导调控等功能条目及糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢等信号通路。

谷氨酸通过T1R1/T1R3-ERK1/2通路调节香猪睾丸间质细胞自噬相关基因表达

【目的】探究L-谷氨酸刺激对香猪睾丸间质细胞自噬的影响,为进一步研究味觉受体T1R1/T1R3通过雷帕霉素靶蛋白(mTOR)调控下自噬对雄性生殖的影响提供理论依据。【方法】选取30日龄的健康从江香猪分离培养睾丸间质细胞,采用不同浓度L-谷氨酸刺激睾丸间质细胞T1R1/T1R3,探究激活T1R1/T1R3对睾丸间质细胞自噬相关基因(TAS1R1、TAS1R3、ERK1、ERK2、mTOR、Beclin 1和MAP1LC3B)表达的影响。【结果】从江香猪睾丸间质细胞在培养72~96 h增殖最快,于培养96 h时达对数生长期。10 mmol/L是L-谷氨酸刺激睾丸间质细胞味觉受体T1R1/T1R3的有效浓度。经10 mmol/L的L-谷氨酸刺激后,睾丸间质细胞的mTOR、ERK1和ERK2基因相对表达量极显著高于对照组(P<0.01,下同),而Beclin 1基因相对表达量极显著低于对照组,MAP1LC3B基因相对表达量显著低于对照组(P<0.05,下同);ERK1/2和p-S6K1蛋白相对表达量显著高于对照组,而Beclin 1蛋白相对表达量显著低于对照组。单丹磺尸酰胺(MDC)染色结果显示,经10 mmol/L的L-谷氨酸刺激后,睾丸间质细胞内的酸性自噬泡荧光强度明显低于对照组,表明胞内自噬受抑制。【结论】10 mmol/L的L-谷氨酸可激活从江香猪睾丸间质细胞T1R1/T1R3,且自噬相关基因TAS1R1、TAS1R3、ERK1、ERK2和mTOR及相关蛋白T1R1、T1R3、ERK1/2、p-S6K1和p-mTOR表达升高,而Beclin 1和MAP1LC3B基因及Beclin 1蛋白表达降低,故推测谷氨酸可通过激活味觉受体T1R1/T1R3参与雄性生殖自噬的负调控。

互助八眉猪种质特性分析及产业发展模式思考

互助八眉猪是青海省唯一的地方猪种,具有适应性强、性早熟、遗传性状稳定、产仔多、母性好、肉质优等特性,但其日增重、瘦肉率和屠宰率低下的种质特性限制了它的推广利用,且在规模化、集约化养殖中存在育肥期过长、养殖投入大、效益不明显等缺点,因此,目前互助八眉猪不适宜规模化、集约化养殖,应以适度规模的生态养殖方式,走“品种、品牌、品质”的高端产业发展道路,重新构建八眉猪的产业体系、生产体系和经营体系应是今后互助八眉猪产业发展的重点。