血清4型禽腺病毒胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立对血清4型禽腺病毒(FAdV-4)进行快速检测的胶体金免疫层析法,将FAdV-4的hexon-L1蛋白进行原核表达,免疫兔制备多克隆抗体,将多抗包被在检测(T)线,将羊抗兔IgG包被在质控(C)线,用胶体金标记的多抗作为示踪剂,制备胶体金免疫层析检测卡,用于检测FAdV-4抗原,并对其敏感性和特异性进行评价,用其检测临床样本并与PCR检测结果相比较。结果显示,制备的胶体金检测卡可检出FAdV-4含量为10^(2.094)^(5)EID_(50),FAdV-8、新城疫病毒、禽白血病病毒等均不出现特异性条带,对临床样本的检测与PCR检测的符合率达98%。建立的胶体金检测方法可用于FAdV-4感染的快速检测。

副猪嗜血杆菌AfuA-ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种特异性强、灵敏度高的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)ELISA抗体检测方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断及免疫抗体检测提供技术支撑,首先重组表达了HPS 2个具有免疫原性的蛋白(HbpA、AfuA),随后对HbpA、AfuA进行初筛,选择AfuA作为最佳包被蛋白。通过优化AfuA-ELISA反应条件,确定了最佳抗原包被质量浓度为5μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂乳溶液,最佳样品稀释液为2%BSA溶液,最佳样品孵育时间为30 min,最佳样品稀释度为1:25,最佳酶标二抗稀释度为1:20000,最佳酶标二抗孵育时间为30 min,最佳底物孵育时间为10 min。特异性试验显示,建立的AfuA-ELISA方法对猪其他常见病原阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良较好的特异性。对300份临床样品进行检测,AfuA-ELISA方法分别检出阳性、阴性血清177、123份,与商业化试剂盒的阳性、阴性符合率分别为90.0%、87.5%,总体符合率为89.0%。结果表明,本研究建立的AfuA-ELISA方法具有特异性强、灵敏度高,与商业化试剂盒符合率高的优点,可以用于临床HPS抗体检测。

猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),用于猪圆环病毒2型血清抗体检测,通过对IPMA反应条件的优化,组装了诊断试剂盒。研究结果表明,用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清,于感染后3周抗体阳转,第3周～10周抗体阳性检出率为92.8%(52/56),对照组猪血清抗体检测均为阴性(33/33)。试剂盒在-20℃稳定保存18个月与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应,与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测,抗体检出率分别为91.7%和79.2%,表明我国猪群中猪圆环病毒2型污染相当严重。该试剂盒的研制为我国PCV2流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

仔猪腹泻源大肠杆菌的PCR快速检测

仔猪腹泻是危害养猪业的重要疾病,尽管导致仔猪腹泻的原因非常复杂,但大肠杆菌是其主要病原已经明确。本研究根据GenBank登录的肠毒素ST1、ST2、LT1以及耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的基因序列分别设计特异性引物,建立了检测相应毒力因子的PCR方法。通过对已知毒力型参考菌株的扩增,证明了所建立的PCR方法能够特异鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和HPI+大肠杆菌。采集临床110例仔猪腹泻病例的直肠棉拭子样品,接种LB肉汤于37℃增菌培养4h～6h后,运用所建立的PCR方法进行检测,结果表明有55例(50%)为HPI+大肠杆菌感染,9例(8.18%)为HPI+大肠杆菌与ETEC混合感染,7例(6.37%)为ETEC感染。通过与细菌分离后鉴定的比较,证明该诊断方法具有速度快、检出率高的特点,适合于临床活体检测。

北京地区鸡群网状内皮组织增殖病感染的血清学调查研究

本文通过制备纯化的禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）和ＳＰＦ鸡抗ＲＥＶ的特异血清，成功地建立了间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），首次对北京地区种鸡群ＲＥＶ的感染情况进行了血清学调查。对有疑似临床症状的鸡作重点采样，从７个鸡场１１２份血清样品中检出５４只阳性鸡，阳性率为４８．２％。从１１个鸡场随机抽样２０４份，检出阳性鸡２８只，阳性率为１３．７％。结果发现，雏鸡、中鸡的感染率较成鸡低，祖代鸡的感染率较父母代低。感染情况似乎与鸡的品种无关。大多数感染鸡群显示不出该病的临床症状或明显的生产障碍。试验结果表明，间接ＥＬＩＳＡ方法检测ＲＥＶ血清抗体，具有简便易行、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。

牛羊布鲁氏菌病四种血清学检测方法对比分析

[目的 ]对布鲁氏菌病的几种检测方法进行比对分析,为国家标准修订提供参考。[方法 ]对收集到的669份血清样本用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法进行检测,比较四种检测方法的一致性、敏感性与特异性。[结果 ]RBT、SAT、CFT、ELISA四种牛羊布鲁菌病的血清学检测方法一致率较高,Kappa值均大于或等于0.75。RBT敏感性较高,CFT特异性好,而SAT有一定的假阳性和假阴性,ELISA的敏感性和特异性都比较理想。[结论 ]用RBT初筛,用CFT和ELISA联合诊断结果较为理想。

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因，然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点，将它们连接成为完整的Ｅ２基因，并克隆到ｐＵＣ１９质粒中，获得重组质粒ｐＨＣＥ２。另设计一对引物，以ｐＨＣＥ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因，然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８ａ（＋）中，获得重组质粒ｐＢＶＥ２和ｐＥＴＥ２，用酶切、ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插入位置、方向和读码框架的正确性。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和直接ＥＬＩＳＡ检测表明重组质粒ｐＢＶＥ２和ｐＥＴＥ２转化、诱导的受体菌均能表达Ｅ２抗原。

犬瘟热病毒抗体检测方法的比较研究

用犬瘟热（ＣＤ）弱毒和自制的高免犬血清，建立了检测犬瘟热病毒（ＣＤＶ）抗体的中和（ＳＮ）试验、间接荧光抗体技术（ＩＦＡＴ）和间接免疫酶染色法。这３种方法对３８份ＣＤ弱毒疫苗免疫犬血清抗体效价的测定结果表明，当被检血清稀释度为１∶１００时，ＳＮ试验、ＩＦＡＴ和间接免疫酶染色法测定时的阳性血清数分别为２９，７和３１份，ＩＦＡＴ和间接免疫酶染色法测定结果相对于ＳＮ试验结果的符合率分别为４２．１％和９４．７％。同时发现，当ＳＮ试验测定的血清效价在１∶１００以上时，ＩＦＡＴ测定结果总是在１∶２５以上，间接免疫酶染色法测定结果总是在１∶１００以上。３种方法以各自初步确定的ＣＤＶ血清抗体效价完全保护值指标计算所测血清的完全保护率，ＳＮ试验为７６．３％，ＩＦＡＴ为７８．９％，间接免疫酶染色法为８１．６％。据此认为，ＩＦＡＴ和间接免疫酶染色法均可部分代替ＳＮ试验用于ＣＤ疫苗免疫效果的评价。

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA检测方法的标准化研究

用纯化牛病毒性腹泻病毒免疫蛋鸡制备出的卵黄抗体作为包被抗体,采用自制的单抗为一抗,建立牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法。通过试验确定,抗牛病毒性腹泻病毒卵黄抗体最佳包被浓度为1:50;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。通过引入牛病毒性腹泻病毒质控血清进行质控检验,该方法所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。标准化的抗原捕获ELISA方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国牛病毒性腹泻病毒监测提供了行之有效的技术手段。

应用斑点免疫金渗滤法检测羊东毕吸虫病的研究

:应用自行研制的胶体金探针标记SPA ,建立了诊断羊东毕吸虫病的新方法———斑点免疫金渗滤法 (DIGFA) ,该法与ELISA法具有良好的相符性 ,将抗原、待检血清滴加于膜上进行反应 。

鸭病毒性肝炎实验室诊断方法的研究

将鸭病毒性肝炎病毒 (duckhepatitisvirusDHV) (ATCC株 )用鸡胚传一代后 ,测出此病毒的鸡胚半数致死量 (ELD50 )为10 -5.5。通过多次重复试验 ,建立了利用鸡胚中和试验和雏鸭中和试验检测鸭病毒性肝炎 (DVH)的诊断方法。 7株DHV毒株在鸡胚中和试验中的结果是 :胚传一代尿囊液死亡率为 2 / 8～ 5 / 8,1∶10血清中和保护率为 8/ 8,1∶10 0 0肝病料死亡率为 3/ 8～8/ 8,1∶10血清中和保护率为 8/ 8,正常对照全部存活。雏鸭中和试验的结果是 :2 4小时内 1∶10肝病料死亡率为 3/ 8～ 8/ 8,1∶5血清中和保护率为 8/ 8。

2型猪链球菌的血清学鉴定

本试验首次证实了２型猪链球菌在我国的存在。采用玻片凝集、琼脂扩散及毛细管沉淀等３项试验，对１９９０年以来广东某猪场断奶仔猪暴发流行的败血症、脑膜炎及关节炎病猪中分离的１５株链球菌进行了血清学鉴定。结果表明：１５株链球菌均为２型猪链球菌；用高压法提取抗原进行沉淀反应，其结果比酸热法提取抗原具有简便、敏感、特异性强的特点。

鱼类病原性弧菌血清学诊断芯片技术构建

针对鱼类致病性肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),制备了牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗血清,提取了各弧菌的外膜蛋白、胞外产物、鞭毛蛋白和全菌蛋白,分析了牙鲆抗血清与各抗原蛋白的免疫反应,发现各弧菌抗血清与各自的抗原反应最强,与其他弧菌抗原有不同程度的交叉反应。将6种弧菌的抗原组分固定于芯片载体形成微阵列,构建了其血清学诊断抗原芯片,使用辣根过氧化物酶标记的抗牙鲆IgM单抗2D8作为检测抗体,确定了检测结果判读方法;将抗原芯片应用于牙鲆和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的弧菌病诊断,并利用ELISA技术,验证了该抗原芯片用于弧菌病诊断的准确性。本研究为鱼类弧菌病的血清学诊断提供了有力工具。

湖北等六省(区)规模化猪场猪衣原体病的监测

用衣原体间接血凝试验（ＩＨＡ）对采自六省（区）部分大、中型猪场的１１０２份猪血清检测结果，猪群衣原体抗体阳性检出率河北省为５２．７１％，陕西省为４０．９１％，甘肃省为１６．５０％，宁夏回族自治区为２７．４４％，河南省为２８．００％，湖北省为３１．８８％；另外，对湖北省某地３个万头猪场中不同年龄猪群检测猪衣原体抗体，仔猪的平均检出率为９．２６％（６．６７％～１０．５３％），生长肥育猪为４５．２８％（３５．００％～６４．７１％），母猪为６４．９１％（４７．３７％～８５．７１％）；从母猪流产胎儿病料和哺乳期肺炎死亡仔猪肺中分离出３株鹦鹉热衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｓｉｔａｃｉ），其中２株流产株（ＨＢ１和ＨＢ２）的ＥＬＤ５０均为１×１０－１３，肺炎株（ＨＢ３）为１×１０－１２。

一种快速提纯兔抗鸡EDS-76病毒IgG的方法

本试验采用辛酸加硫酸铵沉淀二步法提纯兔抗ＥＤＳ－７６病毒血清中的ＩｇＧ。在０．０６Ｍ醋酸盐缓冲液（ｐＨ４．８）稀释的血清中，每ｍｌ血清滴入３３μｌ辛酸时，非ＩｇＧ类蛋白可被基本除去。利用本法提纯的ＩｇＧ，免疫活性和生物活性不发生改变。该方法简便、快速、节约试剂，所获ＩｇＧ纯度高、活性好，适用于从大批量样品中提纯ＩｇＧ。

猪萎缩性鼻炎凝集反应抗原的制备及应用

为快速地诊断猪萎缩性鼻炎及监测其免疫状况,本试验在对支气管败血波氏杆菌保存菌种进行复苏和全面鉴定的基础上,制备了猪萎缩性鼻炎凝集反应抗原,经凝集反应试验表明,该抗原在PBS中不发生自凝,与猪传染性胸膜肺炎、猪喘气病和猪瘟的阳性血清均无凝集反应,而对猪萎缩性鼻炎标准阳性血清的凝集效价高达1:10 240以上,具有较高的特异性和敏感性;对20份免疫母猪所产仔猪血清样本进行检测,检出率为95%。

布鲁菌病血清学诊断抗原研究进展

布鲁菌病的临床特征复杂而多变,病原的流行特点和免疫原性存在较大的差异,给人类及动物布鲁菌病诊断带了诸多的困难。目前常用的血清学诊断抗原如菌悬液,脂多糖等特异性差,敏感性低,制备涉及活菌的培养,不能广泛的应用,从而使患者和患畜得不到有效的治疗和预防。随着分子生物学技术的发展,基因重组蛋白可代替传统的抗原,为布鲁菌病的诊断带来了新的契机,文章从以上方面对可用于布鲁菌病诊断的抗原做了综述。

牛病毒性腹泻-黏膜病的血清学调查

采用竞争ELISA法,对188头牛血清进行了病毒性腹泻-黏膜病抗体检测。结果显示,170头牛抗体呈阳性,阳性率为90.4%,牛病毒性腹泻-黏膜病在调查该县不仅存在且感染率较高,对该病应引起高度重视并应积极采取预防控制措施。

基于^1H NMR技术的急性腐蹄病奶牛血清代谢组学分析

通过^1H核磁共振（^1H NMR）技术结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）,分别分析奶牛在患有急性腐蹄病时内源性代谢产物的变化,研究腐蹄病的发生对奶牛代谢过程的影响,寻找差异表达的代谢物。运用^1H NMR技术获得两组奶牛血清代谢谱。所采集的数据经过模式分析获得差异代谢物。结果急性腐蹄病组与健康对照组相比,奶牛血清内差异性代谢物为21个。结果显示,在奶牛发生腐蹄病时体内糖类、氨基酸、脂类和能量代谢均发生了改变。表明结合^1H NMR谱检测分析的急性腐蹄病组对照组比对的差异代谢物,全景式地揭示了腐蹄病发生过程中奶牛机体内发生了广泛的代谢紊乱,为今后深入探究腐蹄病的发病机理和新的防治策略奠定了基础。

检测禽霍乱抗体间接ELISA法的建立

以方阵滴定法选择出最适ＥＬＩＳＡ反应条件，用系列稀释法测定２１份血清样品的禽霍乱抗体ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ），并与相应血清样品１∶２００倍稀释的Ｐ／Ｎ值配对，作线性回归分析，得到回归方程ｙ＝２１９．６７３ａ－１８３．５７０（ｒ＝０．９４４）和标准曲线，从而建立起快速定量测定禽霍乱抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法——阳阴比值ＥＬＩＳＡ效价法（Ｐ／ＮＩ－ＥＴ法）。利用该法，血清样品只需作１∶２００倍稀释，测定其Ｐ／Ｎ值，通过回归方程（或标准曲线）即可求得ＥＴ．