安徽部分地区鸡场鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体感染与垂直传播调查

为了解安徽部分地区规模鸡场鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)流行感染情况,试验采集21家鸡场鸡血液样品进行血清学调查,并对3家种鸡场的种鸡群及其后代雏鸡进行MG和MS的病原检测,分析种鸡及其后代雏鸡的感染情况。结果显示,MG和MS的鸡场血清阳性率分别为95.24%和90.48%,鸡群平均血清阳性率分别为75.08%和77.01%;商品蛋鸡和种鸡的MG和MS血清阳性率高于育雏育成鸡;鸡群日龄越大,MG和MS的血清阳性率越高,其中300日龄以上鸡群的血清阳性率均为100%。病原检测发现,种鸡场存在不同程度的MG和MS感染,其中MS感染率高于MG;种鸡感染率与其后代雏鸡的垂直感染存在显著正相关,并且在垂直感染的雏鸡关节组织检测出MS病原。结果表明,MG和MS在安徽鸡场中的感染较为严重,垂直传播是雏鸡早期感染的重要途径,并且MS在雏鸡垂直感染的早期即可侵入关节组织。

牛支原体能量耦合因子转运蛋白S组件Mb BioY摄取外源生物素的功能分析

牛支原体(M.bovis)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展M.bovis外源生物素摄取的机制研究,将对M.bovis防控具有极其重要的意义。通过对M.bovis PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选M.bovis PG45 Mb BioY突变株,比较PG45和PG45ΔMb BioY的生物素敏感性,异源构建Mb BioY功能性克隆验证其功能。结果表明,PG45染色体上存在一种崭新的生物素膜转运蛋白,全长996 bp,GC含量30.95%,蛋白长度为332个氨基酸,是由7个跨膜结构域组成的能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分Mb BioY。进一步验证后发现,当M.bovis缺失Mb BioY会影响其生长,表现出生物素代谢营养缺陷的表型。通过异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655,表明Mb BioY单独存在时,就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能。初步证明,Mb BioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分具有摄取外源生物素的能力,该研究结果将补充细菌生物素代谢调控的多样性和复杂性,为M.bovis的有效防控提供独特视角。

绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。

牛支原体NM001株单克隆抗体的制备与鉴定

为获得抗牛支原体NM001株单克隆抗体,并评价其特性,以牛支原体分离株NM001作为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELISA方法筛选到2株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞,命名为2C5和7G3。其细胞上清的间接ELISA抗体效价分别为6.4×10^(3)和1.2×10^(4)。经亚型测定,单抗2C5和7G3均属于IgG1类,轻链均是λ型。制备腹水并对单抗进行纯化和特性鉴定,两株单抗的间接ELISA抗体效价分别为1.02×10^(5)和4.09×10^(5),且两株单抗与无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、牛巴氏杆菌均无交叉反应。Western Blot结果显示,2株单抗均能特异性识别牛支原体全菌蛋白中的相应蛋白。试验表明,单抗2C5和7G3能够与牛支原体发生特异性反应,从而为牛支原体血清学检测提供一定的物质基础。

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

鸡滑液囊支原体DnaK基因体外表达、纯化及鉴定研

本试验通过对热休克蛋白(DnaK)的基因片段测序分析后,去除多余启动子、终止密码子等并进行修饰,将目的基因片段DnaK通过体外蛋白表达系统进行蛋白表达,结果得到了目的蛋白,并验证其来自上清液,大小为27.5 kDa,为下一步蛋白疫苗的制备提供理论依据和试验素材。

鸡毒支原体病诊断及疫苗研究进展

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)可引起鸡慢性呼吸系统疾病(CRD)且传播途径广泛,易与其他病原合并继发感染导致死亡率升高,给养禽业带来了严重的经济损失,因此鸡毒支原体病的早期诊断和免疫显得尤为重要。文章对鸡毒支原体病的临床症状、病原鉴定、血清学检测、分子生物学检测以及疫苗研发方面进行综述并分析其优缺点,为鸡毒支原体病的诊断及防控提供支持。

猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗体。试验通过分子克隆构建原核表达质粒pET21a-RuvA,经诱导表达和纯化获得RuvA M hp重组蛋白;免疫家兔制备抗RuvA M hp多克隆抗体,再利用间接ELISA和Western blot试验进行效价测定和特异性验证;利用凝胶迁移试验结合表面等离子共振技术分析RuvA M hp的DNA结合活性;利用凝胶迁移试验结合Western blot试验鉴定RuvA M hp的寡聚特性。结果显示:原核表达的RuvA M hp重组蛋白约为26 ku;制备的抗RuvA M hp多克隆抗体效价为1∶256000,且具有良好的特异性;RuvA M hp具有较强的DNA结合活性,对霍利迪连接体的亲和力高达624.4 pmol·L^(-1)(K D),并且主要以八聚体形式与其形成稳定复合物。通过RuvA M hp的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定,为后续探索RuvA调解同源重组介导猪肺炎支原体抗原变异的分子机制奠定了基础。

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

牛支原体体外肺精准切片感染模型的建立

本研究旨在建立一种牛支原体体外感染模型-牛肺组织精准切片(precision-cut lung tissue slices,PCLS)感染模型。采集2月龄犊牛新鲜肺脏,经低熔点琼脂糖灌注、固定后,使用振动切片机制成厚度为250μm的牛PCLS,利用牛支原体野毒株HB0801(P1)及其传代致弱株P150以108 CFU·孔^(-1)的剂量进行体外感染,分别经qRT-PCR、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验、3D荧光显微镜全景扫描、免疫组化等技术评估牛支原体在PCLS中的感染效果。结果显示正常PCLS在体外培养72 h后,细胞活力可维持在60%以上,组织形态学观察PCLS边缘清晰,肺泡结构正常;qRT-PCR检测牛支原体强、弱菌株在PCLS中的基因拷贝数,发现二者均可存活和增殖,免疫组化观察牛支原体主要定位于PCLS的肺泡腔周围以及支气管间隙,LDH试验检测发现牛支原体强、弱菌株感染18 h出现细胞毒性反应,二者均可诱导PCLS产生促炎因子IL-1β和IL-8,且强毒株诱导水平显著高于弱毒株(P<0.05)。本研究初步建立了牛支原体PCLS体外感染模型,提供了一种可模拟牛支原体体内感染试验的离体模型,为今后研究牛支原体与宿主相互作用提供借鉴和参考。

广东规模化鸡场死鸡胚中鸡毒支原体的分离鉴定、致病性及药物敏感性

旨在从广东某规模化鸡场死鸡胚进行鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的分离,并进行遗传进化分析、致病性及药物敏感性研究。本研究从广东某规模化鸡场的带菌死胚卵黄组织中分离禽支原体,通过菌落观察、血清学试验、16S rRNA支原体通用引物序列鉴定等方法,对分离的菌株进行种属鉴定,同时将分离的毒株对鸡胚和SPF鸡进行攻毒试验及抗菌药物敏感性试验。结果显示:显微镜下菌落呈典型的“荷包蛋”状。平板凝集试验显示其与MG阳性血清有凝集反应,与MS阳性血清不反应;16S rRNA序列测序发现各分离株与MG相似性达99.9%,因此确定分离株为MG。将各分离株感染7日龄SPF鸡胚,结果显示感染鸡胚大多于临近出壳时死亡;感染3周龄的SPF鸡,3周后解剖发现鸡气囊发生显著病理变化,说明其具有较强致病力;药物敏感性试验结果显示,5株分离株对盐酸沃尼妙林、多西环素、泰万菌素及泰妙菌素有较高敏感性,对替米考星、泰乐菌素、恩诺沙星、红霉素、吉他霉素、林可霉素呈现出不同程度耐药性。综上,从广东某规模化鸡场死鸡胚中成功分离到5株MG分离株,各分离株均可引起红细胞凝集,导致鸡胚死亡,对SPF鸡可引起典型的气囊炎症状,且对多种药物存在不同程度耐药性。本研究为临床MG的分离鉴定及用药选择提供了可参考的技术方法及指导,为MG攻毒模型建立提供了研究基础。

滑液囊支原体GA组件蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】体外表达滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的GA组件蛋白(GA module-containing protein),建立一种MS抗体检测方法,用于血清学检测及MS抗体水平监测。【方法】分析、筛选MS的GA组件蛋白长链保守结构域,合成重组质粒pET30a-ΔGA-L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,并优化表达条件;通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达,纯化重组蛋白ΔGA-L并进行Western blotting鉴定;以纯化后的重组蛋白ΔGA-L作为包被抗原,建立MS抗体的间接ELISA检测方法,优化反应条件,确定临界值,对其特异性、敏感性、重复性进行检验,并进行临床样品检测。【结果】重组蛋白ΔGA-L的分子质量大小为45.7 ku,最佳表达条件为25℃、0.2 mmol/L IPTG诱导表达5 h,以包涵体形式表达。Western blotting结果表明,重组蛋白ΔGA-L能与MS抗体发生特异性反应。以ΔGA-L抗原包被浓度为0.5μg/mL,一抗稀释度为1∶400,二抗稀释度为1∶12 000为最佳条件,建立了MS抗体间接ELISA检测方法,其阴阳性临界值为0.283;所建立方法特异性强、灵敏度高,有较高稳定性;与商品化MS抗体检测试剂盒总符合率为96%。【结论】本研究成功表达了MS重组蛋白ΔGA-L,所建立的MS抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为MS抗体检测提供了有效快捷的方法。

鸡毒支原体 Taq Man实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R^(2)=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。

猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

牛支原体感染牛巨噬细胞对线粒体途径介导凋亡的影响

[目的]探究牛支原体石河子分离株感染牛巨噬细胞(BoMac)能否通过线粒体凋亡途径影响细胞增殖活力和凋亡。[方法]通过培养基培养及测定颜色变化单位(CCU)绘制牛支原体菌株生长曲线,确定其最高活力的培养时间;使用处于活力最高时的牛支原体以不同感染复数(MOI)和不同感染时间感染牛巨噬细胞,分别利用实时荧光定量PCR和Western blotting试验检测线粒体凋亡通路核心分子Bax和Bcl-2的表达情况,通过CCK8试验检测细胞增殖活力水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。[结果]生长曲线分析结果显示,牛支原体石河子分离株12~54 h处在对数生长期,54~84 h处在平台期(滴度为109 CCU/mL),因此,选用培养54 h的牛支原体石河子分离株感染细胞。实时荧光定量PCR与Western blotting检测结果一致,即随感染时间和MOI的增加,促凋亡蛋白Bax基因及其蛋白表达量呈现上升趋势,抑凋亡蛋白Bcl-2基因及其蛋白表达量呈现下降趋势,其中牛支原体石河子分离株感染24 h时,Bax基因表达量极显著增加(P<0.01),Bcl-2基因表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax显著下降(P<0.05);当MOI为1000时Bax蛋白表达量极显著增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax极显著下降(P<0.01)。CCK8试验结果显示,随着感染时间和MOI的增加,牛巨噬细胞活力极显著降低(P<0.01),增殖抑制率为35%~45%。流式细胞术检测结果显示,感染后,牛巨噬细胞凋亡率为25%~45%。[结论]随着感染时间和MOI的增加,牛支原体石河子分离株可通过线粒体凋亡途径标志因子Bax和Bcl-2的表达诱导牛巨噬细胞凋亡,为进一步解析牛支原体的致病机制提供理论基础。

鸡滑液囊支原体的分离鉴定及药敏试验

为弄清湖北省某蛋鸡场180日龄鸡群出现呼吸道症状和产蛋率下降的病原,采集病料进行病原的分离鉴定与药敏试验,用形态学观察方法和分子生物学方法对分离株进行了形态学观察和16S rRNA基因鉴定,并用鸡胚感染试验对分离株进行致病性试验。结果显示,病原分离鉴定结果仅滑液囊支原体阳性,镜检观察到典型的“煎蛋样”菌落;16S rRNA序列与已报道的滑液囊支原体的具有高度同源性;鸡胚感染试验显示,分离株导致鸡胚发育迟缓,胚体弱小,从弱小胚体内可再次分离出滑液囊支原体;药敏试验结果显示滑液囊支原体分离株对泰妙菌素、四环素和盐酸克林霉素敏感。结果表明,从产蛋下降的鸡群中成功分离到1株滑液囊支原体,为临床该病的防治提供了科学依据。

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

牛支原体可视化重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增(LFD-RPA)临床诊断方法,以牛支原体uvrc基因序列为靶基因,设计特异性引物和探针,通过筛选引物和探针、优化反应条件,并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证。结果显示,该试验建立的牛支原体LFD-RPA最佳引物为F2/R2,最佳反应条件为39℃、 25 min;检测灵敏度可达2.08 copies·μL^(-1),是普通PCR灵敏度的100倍;与滑液囊支原体、沙门氏菌、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌之间无交叉反应;重复性稳定;对50份鼻拭子样本进行检测,阳性率为26%,与我国行业标准PCR检测方法的符合率为89.6%。该试验成功建立了牛支原体LFD-RPA检测方法,该方法具有操作简便、快速、高效、敏感等优点,为牛支原体的临床快速诊断提供了技术支撑。

鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备及其免疫保护效果研究

为了研究鸡滑液囊支原体灭活疫苗在不同剂量下的免疫保护效果,该研究以40只20日龄健康海蓝褐雏鸡为研究对象,将鸡滑液囊支原体Q5-2菌株制成的灭活疫苗分3个剂量组对其进行免疫,共免疫3次。利用ELISA检测每组鸡的血清抗体效价,免疫结束后将全部蛋鸡经滴鼻、滴眼途径进行攻毒,检验疫苗的保护效力。结果表明:(1)与对照组相比,3个剂量组2次加强免疫后抗体效价迅速升高,其中低剂量组抗体效价持续上升,达到峰值时的抗体效价也最高为1∶158000,3个剂量组之间差异显著(P<0.05);(2)疫苗接种后对强毒攻击的保护率,低剂量组为100%,中、高剂量组为80%,随着攻毒后时间的延长疫苗接种组从咽拭子中分离出支原体的概率明显低于对照组。表明制备的鸡滑液囊支原体灭活疫苗能刺激机体产生良好的免疫应答,对于强毒攻击具有较好的抵抗作用,并对强毒感染后动物的排毒起到一定抑制作用,从而为该病疫苗的开发及防控方面的研究提供参考依据。