牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

牛诺如病毒感染相关腹泻犊牛粪便菌群的特征分析

[目的]比较哺乳期健康犊牛和感染牛诺如病毒(Bovine norovirus,BNoV)的腹泻犊牛粪便菌群多样性和物种组成,初步揭示BNoV感染的腹泻犊牛粪便菌群特征。[方法]首先应用PCR和RT-PCR法对健康和腹泻犊牛粪便中的腹泻相关病原进行检测,然后采用16S rRNA扩增子测序技术对病原检测阴性的健康犊牛粪便(H组)和仅BNoV检测阳性的腹泻犊牛粪便(BNoV组)的微生物多样性、菌群组成和功能进行比较分析。[结果]与H组相比,BNoV组粪便菌群操作分类单元(OTUs)数量和Chao1指数显著升高(P<0.05),Shannon和Simpson指数极显著降低(P<0.01)。与H组相比,BNoV组粪便变形菌门、埃希-志贺属、丁酸球菌属丰度极显著升高(P<0.01),放线菌门、柯林斯菌属、巨球型菌属、厄氏菌属、双歧杆菌属、粪杆菌属等丰度极显著或显著降低(P<0.01;P<0.05)。双歧杆菌属、柯林斯菌属、巨球型菌属、厄氏菌属、粪杆菌属等在H组显著富集,而丁酸球菌属、埃希-志贺属、脆弱拟杆菌、梭菌属等在BNoV组显著富集。与H组相比,BNoV组粪便菌群胞内过程和信号传导、脂质代谢、新陈代谢、异生物质生物降解与代谢、萜类和聚酮类化合物代谢等显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),而膜转运、复制与修复、翻译、核苷酸代谢、遗传信息处理等显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01)。[结论]感染BNoV的腹泻犊牛粪便菌群丰富度、多样性、物种组成和功能与健康犊牛显著不同,提示BNoV感染犊牛处于肠道菌群紊乱状态。

河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85%(6/323)、BCoV阳性检出率14.24%(46/323)、BRV阳性检出率57.89%(187/323)、BoAstV阳性检出率0.31%(1/323)、BoNeV阳性检出率10.84%(35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48%(8/323)、BToV阳性检出率4.64%(15/323)、BKoV阳性检出率11.76%(38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。

我国3种犊牛腹泻病原体调查汇总分析

为了解和掌握我国犊牛腹泻的病因,文章对2017—2022年涉及BVDV、BRV、BCoV 3种病原体引起犊牛腹泻的国内调查文献数据进行汇总分析,旨在找出这3种病原体在腹泻犊牛中的流行规律,用以指导犊牛腹泻的临床防治工作。结果表明,(1)犊牛BVDV的病原学阳性率为0~34.58%,平均阳性率为14.61%;血清学阳性率为18.75%~65.00%,平均阳性率为47.28%;分别累计不同类别样品(粪便或肛拭子、血液)、腹泻牛与非腹泻牛样品的BVDV病原学检测数据,免疫牛与非免疫牛的BVDV病原学与血清学检测数据,发现上述各组的检测数据均存在极显著差异。(2)犊牛BRV的病原学阳性率为0~56.74%,平均阳性率为10.42%;腹泻牛与非腹泻牛样品的累计检测数据存在极显著差异;犊牛BRV的血清学阳性率为0~25.00%,平均阳性率为15.15%(5/33);各组犊牛的BRV病原学和血清学累计的检测数据无显著差异。(3)犊牛BCoV的病原学阳性率为0~33.33%,平均阳性率为12.87%;血清学阳性率为0~25.00%,平均阳性率为9.09%;各组腹泻牛与非腹泻牛样品的BCoV病原学和血清学累计的检测数据无显著差异。

山东地区1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解并掌握山东地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)流行毒株的生物学特性和遗传变异情况,为BVDV防控提供理论依据和技术支持。【方法】采集养牛场疑似BVDV感染样品制备组织上清液,利用RT-PCR方法进行病原鉴定,接种MDBK细胞进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察对分离毒株进行鉴定,对分离毒株全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并采用Lasergene等软件分别对全基因组序列、N^(pro)和E2基因进行比对和遗传演化分析。【结果】病料样品BVDV特异性引物RT-PCR扩增得到大小约504 bp的目的条带,与预期大小一致。IFA结果显示特异性绿色荧光;电镜下可见直径约50 nm的病毒粒子,表明分离到1株非致细胞病变型BVDV毒株,命名为SDNF9株。分离株基因组全长为12232 nt,与BVDV参考毒株的全基因组核苷酸相似性为79.1%~93.8%,其中,与中国分离毒株22AH-1和澳大利亚毒株Bega-like的相似性最高,为93.8%;N^(pro)和E2蛋白氨基酸存在多个位点变异;SDNF9分离毒株与BVDV2型毒株和BVDV3型毒株处于遗传演化的不同分支,而与BVDV 1型毒株处于同一分支,属于BVDV 1c基因型。【结论】本研究成功分离到1株BVDV 1c流行毒株,并进行基因组和遗传演化分析,与中国分离毒株22AH-1亲缘关系最近,为山东地区牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供数据和材料支持。

广西地区1株牛细小病毒1型分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广西地区牛细小病毒1型(Bovine parvovirus 1,BPV1)的生物学特性及遗传变异情况,为BPV1的防控提供理论依据和支撑。【方法】试验从广西地区养牛场采集409份犊牛腹泻粪便样本,通过BPV1特异引物进行PCR检测,使用牛鼻甲骨细胞(BT)对阳性样品进行病毒分离。收集产生细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)的BT细胞上清液,通过PCR扩增、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、电镜观察等方法进行病毒鉴定。测定BPV1分离株感染BT细胞后不同时间病毒半数组织培养感染剂量(median tissue culture infectious dose,TCID_(50)),绘制病毒多步生长曲线。利用高通量测序获得病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】409份粪便样本检测到1例BPV1阳性,阳性率为0.24%。病料接种BT细胞盲传至第3代,可观察到细胞圆缩、弯曲、形成细胞团块、溶解等现象。PCR扩增结果显示,产生CPE细胞上清经PCR扩增可出现特异性条带;电镜可观察到圆形、无囊膜、直径约24 nm的病毒粒子;IFA结果显示,接种分离株的BT细胞内可观察到特异性绿色荧光,成功分离到1株BPV1,命名为GXBS2209。第6代分离株病毒滴度为10^(5.75)TCID_(50)/mL,多步生长曲线显示分离株感染BT细胞后病毒滴度在120 h达到峰值,随后逐渐下降。测序结果显示,分离株基因组全长为5515 bp(GenBank登录号:PP158225),与美国Bovine parvovirus株全基因组序列相似性最高,为98.7%。遗传进化分析结果显示,分离株与Bovine parvovirus株处于同一分支,亲缘关系最近。分离株与参考毒株NS1、VP2基因核苷酸序列相似性分别为98.8%~99.4%、94.4%~98.1%,氨基酸序列相似性分别为98.8%~99.5%、90.3%~99.4%;NS1和VP2序列中各有2和3个氨基酸位点替换。【结论】本研究成功分离到1株BPV1,并对其全基因序列进行分析,为后续BPV1的致病机理、疫苗研究以及疾病防控奠定了基础。

内蒙古牛冠状病毒全基因组测序与遗传进化分析

【目的】了解内蒙古地区牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)流行毒株的全基因组特征和遗传进化情况,为有效防控BCoV感染提供参考。【方法】本研究对疑似感染BCoV的犊牛脾脏进行宏病毒组测序和步移RT-PCR扩增,获得BCoV全基因组序列,并对其进行生物信息和遗传进化分析。利用Oligo 7.0软件设计特异性引物扩增S基因,并对其进行遗传进化、氨基酸序列变异、抗原表位预测及三级结构预测分析。【结果】本研究从疑似感染BCoV的犊牛脾脏中成功获得大小为30971 bp的BCoV全基因组序列,NCBI登录号为PP352170.1,该全基因组核苷酸序列与BCoV爱尔兰株ABGEB0-62相似性最高,为99.2%,并与该株亲缘关系最近,同时与BCoV法国株BCoV_2014_13和挪威株Nes_2012-01-03属于同一进化分支;扩增出的S基因核苷酸长度为4092 bp,与BCoV爱尔兰株ABGEB0-62 S基因序列亲缘关系最近,处于同一进化分支,但核苷酸序列与BCoV内蒙古株NMG1 S基因相似性最高,为99.4%;S基因编码的氨基酸与Mebus株比对发现,有15个氨基酸变异位点(S1亚基12个,S2亚基有3个),其中变异的氨基酸残基154、260、499-520、718、1192、1344位氨基酸处于抗原表位区,并导致S蛋白三级结构发生改变。【结论】本研究利用宏病毒组测序和基因组5′-端步移RT-PCR法获得内蒙古BCoV株全基因组序列,其S蛋白抗原表位区氨基酸位点发生变异和三级结构改变,预示S蛋白抗原性发生了改变;S1亚基的多态性区域氨基酸位点的变异预示S蛋白的致病性发生变化。

牛环曲病毒云南株纤突蛋白基因分子特征及进化分析

【目的】了解牛环曲病毒(Bovine torovirus,BToV)在云南部分地区牛群中的流行及其S基因遗传进化情况。【方法】采集云南省内13个地区15个牛场不同年龄牛的粪便样品655份,利用RT-PCR方法检测BToV,并对其中6株BToV阳性样品进行S基因扩增、克隆、测序及遗传进化分析。【结果】RT-PCR检测结果显示,655份牛粪便样品检出71份BToV阳性,总阳性率为10.8%;其中腹泻样品阳性率为21.2%(59/278),非腹泻样品阳性率为3.2%(12/377);1周龄、1周龄~1月龄、1~6月龄和1岁及上样品的阳性率分别为15.0%(3/20)、17.7%(20/113)、14.0%(45/321)和1.5%(3/201)。相似性分析结果显示,6条BToV S基因序列相似性为96.0%~99.8%,且与原始毒株Breda1的相似性为94.7%~96.0%,与国内流行毒株的相似性为95.2%~99.7%。遗传进化分析结果显示,6条S基因均与原始毒株Breda1不在同一大分支,与国内四川、河南毒株及土耳其毒株形成一个大分支,表明云南省BToV毒株与目前国内流行毒株一致,亲缘关系近。氨基酸突变位点分析结果显示,S基因存在少量独特的氨基酸突变位点。重组分析结果显示,BTOV-China/YN03-2021、BTOV-China/YN01-2021和BTOV-China/YN06-2022为重组序列,其中重组序列BTOV-China/YN06-2022得分最高,重组区域为1438~1609 bp区间,主要亲本为BTOV-China/YN05-2021;重组序列BTOV-China/YN03-2021,重组区域位于1668~3569 bp区域,主要亲本为土耳其毒株BToV-HT2-TUR(MG957146.1);重组序列BTOV-China/YN01-2021,重组区域位于261~2552 bp,主要亲本为土耳其毒株BToV-HT2-TUR(MG957146.1)。基因选择压力分析结果显示,BToV S基因的进化方式主要以中性选择为主,但同时也存在净化选择和正向选择的压力影响。【结论】本研究揭示了BToV已存在于云南省部分地区牛群体中且防控形势较严峻,可为中国研究BToV流行病学和BToV S基因遗传进化关系提供参考,同时也为云南地区制定BToV感染的防控措施提供理论依据。

宿主蛋白Rab11a对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)后,对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株,设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体,采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白表达情况;使用实时荧光定量qPCR、免疫荧光染色试验、Reed-Muench法等技术检测BVDV感染Rab11a KO细胞后病毒RNA水平、双链RNA(dsRNA)积累水平、病毒滴度及致细胞病变(CPE)情况等。Western blot检测结果显示,成功构建出Rab11a基因敲除的细胞Rab11a KO;Rab11a基因敲除显著抑制BVDV 5'UTR mRNA和dsRNA水平的积累,感染36 h后,Scramble细胞明显有大量细胞病变,出现皱缩、碎裂、形成空泡后脱落等现象,Rab11a KO细胞的CPE现象明显低于Scramble细胞;在BVDV感染细胞12 h后,与Scramble细胞相比,Rab11a KO细胞的病毒滴度显著性降低,结果证明了敲除MDBK细胞的Rab11a基因对BVDV在胞内复制起到抑制作用。本研究结果为了解宿主蛋白Rab11a与BVDV的相互作用,以及Rab11a对病毒的复制增殖的作用提供了新的科学依据。

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p20的原核表达

牛病毒性腹泻是由黄病毒科、瘟病毒属中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染牛引起的一种传染病,是一种全球性牛传染病。为了在原核表达系统表达BVDV非结构蛋白p20,并分离纯化蛋白进行晶体学研究。首先对BVDV-1 p20蛋白基因进行密码子优化,合成后克隆到pET30表达载体上。测序鉴定成功的pET30-p20表达质粒转化大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导获得的p20蛋白经过Ni柱、分子筛纯化。最终,经过多重缓冲溶液的筛选,p20蛋白可以稳定存在于含有5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5%甘油、150 mmol/L氯化钠(pH8.0)的Tris-HCl缓冲液中。高纯度均一性的p20蛋白获得,为后续p20晶体学研究以及单克隆抗体的制备提供原核表达纯化方案。

牛轮状病毒多克隆抗体制备及特性分析

旨在优化G6P[1]型牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)在MARC-145细胞中的培养条件,制备其兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。对G6P[1]型BRV毒株NCDV进行不同病毒接种量及收毒时间优化,确定病毒在MARC-145细胞中的最佳培养条件;以1×10^(7) TCID_(50) NCDV活毒作为免疫原免疫成年兔,制备兔源多克隆抗体;通过间接ELISA检测多抗效价,并通过间接免疫荧光试验(IFA)及中和试验鉴定其特异性。结果:NCDV毒株以感染比0.1、感染时间24 h为最佳培养条件,病毒滴度可至4.9×10^(6) TCID_(50)/mL;间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶51 200,表明NCDV具有良好的免疫原性;IFA及中和试验结果表明,NCDV多克隆抗体与G6P[1]型、G9P[1]型和G10P[11]型BRV毒株均能发生特异性反应,存在良好的交叉中和效应,表明制备的多抗具有良好的反应性。综上,本试验成功优化了NCDV毒株在MARC-145细胞中的增殖条件,并制备了高效价的兔源多克隆抗体,为后续BRV感染的血清学诊断及疫苗研发奠定了理论基础。

BVDV非结构蛋白NS4B的结构分析及其蛋白表达与鉴定

NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基酸组成、疏水性和空间结构。根据Genebank上公布的BVDVns4b基因序列设计引物,利用PCR方法获得ns4b基因片段,连接到p3×Flag-CMV10表达载体上,构建重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,经双酶切与测序鉴定正确后,将p3×FlagCMV10-ns4b转染到HEK-293T细胞中,利用Western blot检测NS4B蛋白的表达。结果表明BVDV NS4B蛋白分子量为38.4 kDa,不存在信号肽,有49个磷酸化位点和6个糖基化位点,是一种主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成的疏水性稳定蛋白。成功构建了重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,并且p3×Flag-CMV10-ns4b在HEK-293T细胞中成功表达,为今后研究NS4B蛋白在BVDV感染宿主细胞及其免疫逃逸机制奠定了基础。

牛冠状病毒S和HE蛋白研究进展

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犊牛腹泻、牛的呼吸道感染和成年牛冬痢的一种病原,主要通过粪-口感染和呼吸道气溶胶传播。研究表明,BCoV在亚临床感染的成年牛体内可持续存在,这可能是BCoV在牛群中广泛存在且能长期循环的原因。因此,BCoV的流行会对集约化牛场造成巨大的经济损失,BCoV的防控形势极其严峻。BCoV S蛋白包含主要的抗原位点,可与宿主表面的唾液酸(SA)结合,且S蛋白参与病毒与宿主细胞的吸附和膜融合过程,能促进宿主产生有效的中和抗体。BCoV HE蛋白具有乙酰酯酶活性和血凝活性,能与S蛋白协同附着于细胞表面并启动感染。S和HE蛋白均在病毒的组织或宿主嗜性及毒力等方面发挥重要作用,这些作用也为进一步开展BCoV病原研究及后续疫苗和药物的研制提供参考。笔者重点阐述了BCoV S和HE蛋白的分子结构及功能,以及BCoV基于S和HE蛋白的受体识别作用(包括利用N-乙酰-9-O-乙酰神经氨酸为糖结合受体,利用人类白细胞抗原Ⅰ类分子为蛋白结合受体)。受体识别是冠状病毒感染和致病的重要决定因素,也是宿主免疫监视和人类干预策略最重要的靶标之一。因此,充分了解BCoV S和HE蛋白的结构功能和受体识别作用对于了解病毒的致病机制及抗病毒药物、疫苗的研发具有重要意义。

1株牛源冠状病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】获得新疆地区牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)毒株,探究BCoV体外分离的最佳条件,了解BCoV新疆株的遗传进化情况,为BCoV疫苗候选株提供研究基础。【方法】通过RT-PCR对来自新疆地区7个牛场的腹泻犊牛小肠及其内容物(n=185)进行BCoV检测,将阳性样本经过处理后接种HCT-8细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和透射电镜对分离的病毒进一步鉴定,通过Reed-Muench法测定分离株的半数组织培养感染剂量(TCID50),将分离毒株进行全基因组测序,并对测序结果进行遗传进化分析。【结果】腹泻样品BCoV检出率为64.9%,接种HCT-8细胞后成功分离到1株BCoV,命名为XJ-SHZ-37(GenBank登录号:OR750853);IFA可观察到孵育病毒的细胞有绿色的特异性荧光,而对照组没有;Western blotting检测结果显示,该分离株与BCoV N蛋白多克隆抗体发生特异性反应;透射电镜可观察到呈皇冠状的病毒颗粒;Reed-Muench法测定分离株的TCID50为10-7.9/0.1 mL;基因组测序及遗传进化结果表明,XJ-SHZ-37与从牛中分离到的冠状病毒科冠状病毒属的BCoV分离株ZJNB2106相似性最高。【结论】新疆地区7个牛场有较高的BCoV检出率,成功分离出1株能稳定遗传且能与BCoV N蛋白多克隆抗体特异性结合的分离株,该分离株有较高的病毒滴度,且通过遗传进化关系表明与中国牛源毒株ZJNB2106株进化亲缘关系最近。

牛冠状病毒感染新生犊牛肺上皮细胞模型的建立

[目的]牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是犊牛腹泻和上呼吸道疾病的主要病原,目前缺少敏感的适合BCoV体外培养的本动物细胞,限制了BCoV致病机制的深入研究。因此,本研究拟从犊牛肺脏组织中分离出牛肺上皮细胞(bovine lung epithelial cell,BLEC)建立BCoV体外感染本动物细胞模型。[方法]采用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原蛋白酶两步酶消化法对新生犊牛肺脏组织进行肺上皮细胞初步提取,再利用上皮细胞贴壁时间不同的差异贴壁法纯化BLEC。通过间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)检测纯化后细胞中标志细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK-18)的表达来鉴定BLEC,并通过PCR方法对细胞进行病原纯净性检测,包括牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)、BPIV5、牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、BCoV和支原体(Mycoplasma)。通过PCR和IFA检测BCoV对BLEC的易感情况,并绘制BCoV在BLEC上的一步生长曲线。[结果]分离纯化培养的BLEC形态均匀稳定、呈菱形或砖块状,无常见病原BRV、BVDV、BPIV3、BPIV5、IBRV、BCoV和支原体污染,上皮细胞标志CK-18呈阳性表达。犊牛腹泻来源的BCoV HLJ-325毒株感染BLEC 24 h后可观察到明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);PCR能扩增出BCoV N基因;IFA结果显示,BCoV感染BLEC呈现特异性红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测BCoV含量建立病毒生长曲线,BCoV在感染BLEC后20 h时病毒载量最高,为4.46×10^(5)拷贝/mL。[结论]本研究成功分离制备了BLEC,证明BCoV易感染BLEC,构建了BCoV体外感染BLEC模型,为研究BCoV引起牛呼吸道疾病的致病机制奠定基础。

猪流行性腹泻病毒Nsp7基因真核表达载体的构建及表达

PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA,并通过RT-PCR扩增获取PEDVNsp7基因,最终将其连接到pCMV-Myc载体上。试验结果显示,成功构建了pCMV-Myc-Nsp7的重组质粒,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证了其蛋白表达情况,为后续研究PEDV Nsp7的生物学功能奠定了良好的基础。

牛病毒性腹泻净化效果研究

为了解吉林省某规模牛场BVDV的流行情况,并制定净化方案,应用BVDV ELISA试剂盒对2022年3月—2023年10月采集吉林省某规模牛场的血液和粪便样本进行病原学调查。结果表明:该牛场全群BVDV抗体、抗原阳性率分别为2.72%、0.85%,抗原阳性5头(其中成年牛1头,后备牛1头,犊牛3头),抗体阳性16头(其中成年牛5头,后备牛5头,犊牛6头)。对检测为BVDV阳性的牛直接淘汰,并通过3次复检,筛选出BVDV持续性感染牛,对其进行淘汰,并对检测阴性牛免疫。经过长达1年的监测及淘汰,该规模牛场BVDV病原学检出率为0,取得了良好净化效果。

新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响

非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的功能奠定基础。

牛新发病毒性传染病及其诊断技术研究进展

近年来,牛多种新发病毒性传染病在国内外屡有报道,给世界养牛业带来较大损失。牛结节性皮肤病病毒(LSDV)感染牛可引发原发性和继发性肺炎及生产性能降低;施马伦贝格病毒(SBV)可侵害牛等反刍动物神经系统并导致怀孕母畜流产、胎儿畸形等。此外,某些牛新发病毒可能具备跨物种传播人类的潜在风险,给人类公共卫生安全带来潜在威胁。因此,明确牛新发病毒性传染病病原、流行病学,建立特异、敏感的快速诊断技术对牛新发传染病的防控尤为必要。论文重点从病原学、流行病学、诊断技术等方面对国内外牛新发病毒性传染病进行综述,以期为我国上述疫病的防控提供参考。

牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用

轮状病毒(rotavirus,RV)VP6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVVP6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931—1 338bp牦牛RVVP6基因片段。序列分析结果发现,与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)相比,牦牛RVVP6基因在931—1 110bp间出现多处点突变,而在1 100—1 338bp之间序列高度保守。据此设计检测引物,成功建立了检测牦牛RV的RTPCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段,对其他无关病原无扩增;检测下限为0.45pg·μL^(-1),灵敏性较好。所建立方法对牦牛RV的检出率明显优于现有检测BRV的RT-PCR方法,为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法;对BRV的检出也与其他方法具有很好的符合率,也可以用于BRV的检测。对234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率:西藏为60.00%(36/60)、青海为95.00%(57/60);四川为85.19%(46/54);云南为90.00%(54/60),证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。