表达IFN-α的重组猪繁殖与呼吸综合病毒的构建及生物学特性分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害我国生猪业的重要疫病之一,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),是一种免疫抑制性病毒。干扰素(IFN)是一类具有免疫调节功能和抗病毒作用的细胞因子。IFN-α除更直接的抗病毒作用外,还可以调节宿主的先天性和适应性免疫。论文构建表达IFN-α的重组PRRSV,分析重组病毒的生物学特性以及IFN-α的生物学活性。通过反向遗传操作方法将IFN-α插入到PRRSV ORF1b和ORF2a之间,重组质粒转染细胞后可以拯救出重组病毒(rGXAM-P-IFN-α)。插入到PRRSV基因组中的IFN-α可遗传稳定9代。重组病毒生长特性分析可发现rGXAM-P-IFN-α复制能力显著低于亲本病毒。rGXAM-P-IFN-α感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)可显著上调抗病毒基因(PKR,ISG15和ISG54)mRNA表达水平,为进一步研发新型PRRSV疫苗提供参考。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

鸽源禽腺病毒XY20株Hexon全基因克隆与序列分析

为了明确鸽源禽腺病毒主要致病性相关基因的分子特征,试验对Hexon基因分段进行PCR扩增,并在测序后拼接为完整的XY20株Hexon基因,通过DNAStar 7.1软件将其与从GenBank中选择的49株参考毒株的核苷酸和氨基酸进行序列比对,绘制系统进化树,分析氨基酸位点变异情况;通过SOPMA在线软件预测分析Hexon基因编码的Hexon蛋白的二级结构,通过http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/程序预测Hexon蛋白的N-糖基化位点。结果表明:XY20株Hexon基因序列全长为2814 bp,编码937个氨基酸;XY20株属于C群FAdV-4型,与各群代表毒株Hexon基因的核苷酸相似性在71.7%~100%之间,推导氨基酸序列相似性在76.8%~100%之间,与我国近几年禽腺病毒流行毒株GX-1、HB1510、HLJ 160826等的Hexon基因相似性为100%。与国外C群FAdV-4型毒株相比,XY20株的氨基酸中存在31个变异位点。XY20株Hexon蛋白的二级结构及11个N-糖基化位点与FAdV-4型早期毒株ON1相比没有发生明显变化。说明XY20株与早期FAdV-4型毒株Hexon蛋白抗原性一致,且极有可能源自鸡群FAdV-4型流行毒株。

CD44通过影响猪流行性腹泻病毒复制调节钠氢交换体3活性

本研究旨在研究CD44(cluster of differentiation 44)对感染猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中钠氢交换体3(NHE3)表达及膜转移的影响。以IPEC-J2为细胞模型,采用RT-qPCR和Western blot检测感染PEDV后不同时间点IPEC-J2细胞中NHE3和PEDV N表达量变化;转染质粒调控IPEC-J2中CD44表达后,采用TCID50和Western blot检测PEDV感染后不同时间点PEDV复制水平和NHE3蛋白表达变化,采用火焰原子吸收法检测IPEC-J2细胞内外Na^(+)浓度变化。转录组数据和细胞试验结果显示,与对照组相比,PEDV感染后IPEC-J2细胞中CD44蛋白表达水平和mRNA表达量均呈上调趋势,24~48 h内上升显著(P<0.05),而PEDV N蛋白表达水平在12~48 h内则呈显著下降趋势(P<0.05)。此外,CD44重组质粒转染试验结果显示,与PEDV感染组相比,过表达CD44后感染PEDV组细胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而干扰CD44后感染PEDV组细胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表达水平则显著上升(P<0.05)。以上结果表明,高表达CD44具有抑制PEDV复制的作用,干扰CD44后PEDV复制增多。同时,为研究PEDV感染情况下,CD44是否参与了IPEC-J2细胞中NHE3表达的调节,采用Western blot和火焰原子吸收法检测了调节CD44后膜NHE3蛋白的表达水平和细胞内外Na^(+)浓度。结果表明,过表达CD44显著促进了膜NHE3蛋白的表达和活性(P<0.05),细胞内外Na^(+)浓度逐渐恢复正常水平。相反,干扰CD44显著降低了膜NHE3蛋白的表达和活性(P<0.05),细胞内外Na^(+)浓度呈现失衡状态。结果提示,CD44可能是缓解PEDV引发仔猪腹泻的潜在治疗靶点,它通过抑制IPEC-J2细胞中PEDV的复制来增加转移至质膜上的NHE3数量,从而维持细胞内外Na^(+)运转平衡。

猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

猫冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立

猫冠状病毒(FCoV)在全球猫种群中广泛流行,隐形感染的猫导致病毒在猫群中持续传播。提高样本检测率、早预防、早治疗可减少种群中病毒流行率。为建立可以灵敏、准确检测FCoV的Taq Man荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的FCoV基因片段N保守区域设计了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应体系,建立了FCoV Taq Man荧光定量PCR检测方法,对75份临床样品进行检测。结果表明,该方法在1.49×10^(11)~1.49×10^(2) copies/μL之间具有良好的线性关系,特异性强,敏感性高,对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(0) copies/μL,而普通PCR对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(5) copies/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;75份临床样品,阳性率为37.33%。研究建立的FCoV检测方法扩增效率高、特异性强、敏感性好、稳定性高,且实用性好,可以用于FCoV的快速检测,可为流行病学调查提供有效的技术手段。

杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性

旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。

抗鸡传染性支气管炎病毒中药的筛选

【目的】对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)进行抗病毒中药的筛选,并验证其治疗效果,为临床用药提供一定参考。【方法】采用鸡胚培养法,通过预防和治疗2个角度对24味单一中药、6种市售复方中药进行抗IBV的有效成分或方剂筛选试验,即在SPF鸡胚中先注射中药2 h后再接种病毒和先接种病毒2 h后再注射中药。使用SPSS 20.0软件对鸡胚重量进行方差分析,利用实时荧光定量PCR法辅助判定治疗效果。【结果】对鸡胚净重进行方差分析显示,桔梗组与阳性对照组差异显著(P<0.05),与阴性对照组差异不显著(P>0.05),表明预防和治疗均有效果。实时荧光定量PCR检测鸡胚尿囊液病毒滴度结果显示,桔梗、鱼腥草、宣肺败毒方、绞股蓝、蒲公英、甘草对IBV增殖均有抑制作用,其中桔梗抑制效果最佳。【结论】桔梗对IBV有显著的预防及抑制效果,结果为深入研究桔梗作用机理提供了依据。

新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定

新疆许多规模化牛场存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染,且因病毒基因型具有多样性,给该病的防控、疫苗选择、净化带来了一定的困难,开展新疆地区规模化牛场BVDV基因分型鉴定,对BVDV防控具有重要的指导作用。采集BVDV胶体金抗原检测卡确定为阳性的犊牛抗凝血样品并分离淋巴细胞,在MDBK单层细胞上进行病毒分离,盲传5代,提取培养物RNA,以BVDV5′-UTR、N^_(pro)特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分析。结果显示,获得BL分离株1株,属于BVDV-1m亚型,研究结果丰富了新疆南疆地区规模牛场BVDV分子流行病学数据库。

黄芩苷体外抗IBV QX株的作用研究

为研究黄芩苷体外抗禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)QX株的效果,试验对IBV进行复壮与扩繁,制备原代鸡胚肾(CEK)细胞,并测定IBV对CEK细胞的TCID50和黄芩苷对CEK细胞的最大无毒浓度(MNTC);在MNTC基础上采用CCK法测定不同浓度黄芩苷对IBV的有效抑制率,观察不同浓度黄芩苷对IBV导致的CEK细胞的细胞病变效应(CPE)的抑制情况,并采用qPCR法测定不同浓度黄芩苷对IBV N基因相对表达量的影响。结果表明:成功复壮并扩繁了IBV,其未被其他病毒污染,对CEK细胞的TCID50为1×10^(-4.75)/0.1 mL;黄芩苷对CEK细胞的MNTC为9.75 mg/L;该浓度黄芩苷对IBV的有效抑制率最高,为64.03%,能有效减轻IBV对CEK细胞的CPE;各浓度黄芩苷均可以极显著降低CEK细胞中IBV N基因相对表达量(P<0.01)。说明黄芩苷对CEK细胞的MNTC为9.75 mg/L,该浓度黄芩苷具有较好的体外抗IBV QX株的作用。

不同猪源受体菌表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原S1诱导免疫应答的比较研究

旨在比较猪源副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)作为口服疫苗载体,表达外源蛋白刺激仔猪产生免疫能力的强弱,以期选取合适乳酸菌作为受体菌载体。本研究首先体外鉴定表达PEDV S1蛋白的重组猪源副干酪乳酪杆菌(pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2)、猪源罗伊氏黏液乳杆菌(pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31)、猪源约氏乳酸杆菌(pPG-T7g10-S1/L.johnsonii 6332)的耐酸耐胆盐能力,考察3株重组菌的抗逆性。结果表明,3株重组菌均能够耐受酸和胆盐环境,且与其野生型菌株没有显著差异。接下来为比较3株重组菌的免疫效果,口服免疫初生仔猪后,利用间接ELISA和中和试验检测仔猪产生的特异性抗体水平及其中和活性;并测定免疫后仔猪血清和肠黏膜中各细胞因子水平。结果显示,口服免疫后,与对照组相比,3株免疫组仔猪血清IgG抗体和鼻拭子、肛拭子、肠黏液中SIgA抗体水平均显著升高,且可持续至第28天左右,其中pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组诱导产生的抗体水平显著高于其他两组免疫组(P<0.05);仔猪产生特异性的IgG和SIgA对PEDV均具有中和活性。仔猪血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平和对照组相比显著升高(P<0.05),但3株重组菌组间细胞因子水平未见明显差异;仔猪空肠黏膜中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17、IL-21、TGF-β、APRIL和BALL水平与对照组相比有所升高,且pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组IL-4、IL-5、IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21和BALL相比其他组显著升高(P<0.05)。综上所述,本研究分别将质粒组成型表达PEDV主要保护性抗原S1的重组猪源副干酪乳酪杆菌、猪源罗伊氏黏液乳杆菌和猪源约氏乳酸杆菌口服免疫仔猪,结果显示能够刺激机体产生针对PEDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫,且相较于其他2株重组菌,重组猪源副干酪乳酪杆菌pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2的口服免疫效果最好。该试验结果为构建更为有效的乳酸菌口服疫苗提供了科学数据。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

C8orf4基因编码蛋白对猪流行性腹泻病毒体外复制的抑制效应

C8orf4,也称为甲状腺癌1(thyroid carcinoma 1,TC1),最初是从甲状腺癌及其周围正常甲状腺组织克隆而来,在脊椎动物中普遍表达,具有跨物种的序列保守性。研究表明,C8orf4在肿瘤中高表达,参与各种癌细胞间信息通讯,是一种与癌症和炎症有关的新型调节因子,并通过调节NF-κB的转录增强炎症反应,但对病毒的影响知之甚少。为研究C8orf4编码蛋白对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)复制的影响,将PEDV接种于Vero细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测不同时间点PEDV对C8orf4表达的影响;设计并合成表达C8orf4基因的真核表达载体pcDNA3.1-C8orf44-His和特异性siRNA,通过过表达和抑制C8orf4表达,利用qRT-PCR和Western blot检测C8orf4对PEDV复制的影响;进一步,通过过表达C8orf4编码蛋白,明确C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期各阶段的增殖变化。随着PEDV感染时间的增长,细胞中C8orf4表达呈上升趋势;过表达C8orf4显著抑制PEDV复制,而干扰C8orf4表达促进PEDV复制,并且C8orf4编码蛋白主要作用于PEDV复制周期的生物合成阶段。本研究表明C8orf4编码蛋白具有抑制PEDV复制的作用,为C8orf4的功能研究提供参考,为抗PEDV复制机制研究提供基础。

三株新型鸭源微RNA病毒分离毒株的全基因组序列分析

分离新型鸭源微RNA病毒进行全基因组测序并进行遗传进化分析。对本实验室2021年不同来源的种鸭和肉鸭病料进行PCR检测,初步确定存在一种未知分类的新型微RNA病毒感染。取病死鸭病料组织处理后接种SPF鸡胚分离病毒,设计引物对分离到的病毒进行PCR检测,通过重叠PCR方法进行全基因组扩增测序。将分离病毒各蛋白氨基酸序列两两比对,同时选取GenBank数据库中微RNA病毒代表毒株序列绘制系统进化树,并对主要蛋白P1、2C、3D序列比对分析。结果显示:共分离到三株微RNA病毒,分别命名为21101株、21016株和21075株(GenBank登录号:OQ927377~OQ927379)。基因组长度分别为7445、7445和7447 bp,均包含一个编码2141个氨基酸的开放阅读框(ORF),可划分为P1、P2、P3三个部分,符合微RNA病毒序列特征。基于全基因组序列遗传进化分析发现,三株分离病毒与本实验室前期分离的Duck/FC22/China/2017(GenBank登录号:MN102111)毒株及上海兽医研究所分离的Duck/AH15/CHN/2015(GenBank登录号:MT681985)位于同一分支,与鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)遗传距离最近。分离的三株鸭源微RNA病毒进行全基因组测序及遗传进化分析发现,与目前已知的两株微RNA毒株为同一类新型鸭源微RNA病毒。

牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P<0.01);若以中和试验为标准,ELISA的敏感性为100.00%(31/31),特异性为88.89%(8/9),与血清中和试验具有很强的一致性(κ=0.925,P<0.01)。采用该方法对303份牛血清进行检测,BCoV阳性率为74.91%。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白多克隆抗体,建立检测PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法,通过PCR扩增N蛋白基因,将N蛋白基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导N蛋白表达,将纯化后的重组N蛋白免疫小鼠,获得N蛋白多克隆抗体。将纯化后的N蛋白作为抗原,建立检测PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法,并评估该方法的特异性、重复性和准确性。结果表明,表达的重组N蛋白呈可溶性,制备的N蛋白多克隆抗体ELISA效价能达到1∶2048000,IFA和Western blot结果表明制备的鼠多克隆抗体能特异性识别PRRSV N蛋白。建立的间接ELISA方法特异性良好,重复性试验变异系数均小于10%,且与同类型商品化试剂盒结果比较,符合率达到91.10%,可为PRRSV N蛋白的免疫学检测和结构功能的研究提供参考。

我国部分省份牛冠状病毒HE基因遗传变异分析

2020-2023年收集我国14个省份78个临床发病牛群的肛拭子、粪便、组织等样品1819份,用实时荧光RT-PCR方法进行牛冠状病毒(BCoV)检测,并选取部分核酸阳性样品进行HE基因全长的扩增、测序与遗传变异分析。78个发病牛群中,BCoV阳性场占56.41%,共获得35条HE基因全长序列,与参考序列相比,核苷酸同源性为97.0%~100.0%,氨基酸同源性为97.0%~99.8%。系统进化分析表明,BCoV毒株HE基因在进化上呈现典型的地域性特点,亚洲毒株和美国毒株进化上较为接近,而欧洲毒株位于另一个分支,所测毒株与中国参考毒株处于亚-美型毒株分支中,位置相对较为集中。所测35个HE序列中,有34个没有发生插入或缺失突变,来自宁夏的BCoV/NX13/CHN/2023毒株其HE基因存在12个核苷酸的插入突变,证实了BCoV HE基因插入变异株在我国的存在。基因重组分析显示,该毒株与BCoV/HeB120/CHN/2021的HE基因可能发生了重组,预测重组值分别为0.797和0.759。说明了我国部分省份临床发病牛群BCoV感染及BCoV HE基因的遗传变异,为明晰我国BCoV流行毒株分子特征提供参考。

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在体外原核表达猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV)SH2021株核衣壳蛋白(nucleocapsid,N),制备兔源多克隆抗体。根据FIPV SH2021株N基因序列设计引物,构建pCold-I-N重组表达质粒。随后,将重组质粒转化至表达感受态细胞BL21(DE3),在终浓度为1.0 mmol·L^(-1)的IPTG和16℃的诱导条件下进行表达。最后,利用His层析柱进行纯化,纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果表明,纯化获得重组N蛋白大小约为45 ku,制备的N蛋白兔多克隆抗体效价可达1∶512000,该抗体对N蛋白具有良好的反应原性。本研究成功所制备了FIPV N蛋白兔多克隆抗体,该抗体具有良好的反应原性和特异性,为FIPV抗原抗体检测以及研究N蛋白生物学功能研究提供重要工具。

塞内卡病毒A完整病毒和空衣壳的分离及抗体应答分析

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)在复制过程中可形成完整病毒和空衣壳,它们的分离条件和抗体应答差异目前还是未知的。本研究利用盐酸胍形成SVA空衣壳,通过优化不同的密度梯度、介质、转速、时间条件进行超速离心,获得分离SVA完整病毒和空衣壳的最佳条件,并按SVA完整病毒12.5μg·只-1,空衣壳12.5μg·只^(-1)肌肉注射免疫BALB/c小鼠,免疫后1~7周检测特异性抗体和中和抗体。结果显示,SVA的MOI=1时感染细胞2 h加入100 mmol·L^(-1)盐酸胍可以使SVA完整病毒全部形成空衣壳;在10%~50%氯化铯,36000 r·min^(-1),离心2.5 h是区分SVA完整病毒和空衣壳的最佳条件;而且SVA完整病毒与空衣壳诱导小鼠的特异性抗体和中和抗体水平无显著差异(P=ns)。本研究为塞内卡病毒A完整病毒和空衣壳的分离纯化、重组SVA病毒样颗粒疫苗的开发提供参考。