花生茎源茉莉炭疽菌的分离鉴定及生物学特性研究

旨在探究首次从花生茎中分离出茉莉炭疽菌(Colletotrichum jasminigenum)的生物学特性。通过三点接种法,经马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基分离培养,分别用乳酸酚棉蓝染色和扫描电镜观察其形态,提取分离真菌DNA,用PCR方法扩增ITS区并测序,比对该基因同源性及遗传进化关系。将孢子悬液以5×10^(7) CFU·mL^(-1)剂量感染昆明小鼠,并观察小鼠的临床症状、血清生化指标和剖检病变。用K-B纸片法探究其耐药表型。结果显示,分离株分生孢子长29.6μm±0.87μm,呈月牙形;菌丝透明无性,有隔和分枝,无刚毛;附着孢呈棍棒状或者卵球形。PCR扩增得到该菌ITS区序列长度为586 bp,序列提交GenBank(OR472966)。根据形态学结合ITS区序列分析结果确定分离株为茉莉炭疽菌,命名为SLY01。用SLY01菌株攻毒小鼠14 d后导致血清碱性磷酸酶含量极显著升高(P<0.01),肝脏器指数显著下降(P<0.05),并从感染小鼠体内再次分离鉴定出茉莉炭疽菌。组织病理学结果显示,试验组小鼠肺泡壁水肿伴有大量淋巴细胞浸润;肝细胞出现大面积颗粒变性,肝小叶内见出血和肝细胞坏死;肾可见肾小管上皮发生颗粒变性。药敏试验显示,SLY01菌株对卡泊芬净和伏立康唑耐药,对两性霉素B敏感,对伊曲康唑中度敏感。本研究分离鉴定得到茉莉炭疽菌,感染小鼠主要损伤靶器官为肝、肺,并且对多种药物耐药。这为进一步研究茉莉炭疽菌的防治提供理论依据。

重组克柔念珠菌14-3-3蛋白诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制

旨在研究重组克柔念珠菌(Candida krusei)14-3-3蛋白(rCK14-3-3)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的分子机制,为系统研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供理论依据。采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH 1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定;CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间;Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响;ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-12相对表达量的影响。结果显示:成功构建了pET-21a-BMH1重组表达载体,经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,纯度达90%以上,浓度为0.2 mg·mL^(-1)。与空白对照组相比,采用50μg·mL^(-1)的rCK14-3-3作用MAC-T,TLR2、TLR4、MyD88在1、3 h时表达量极显著升高(P<0.01),6 h时,TLR4表达量显著降低(P<0.05),TLR2、MyD88表达量无显著变化;p-JNK在1 h时的表达量无显著变化,3、6 h时极显著降低(P<0.01);p-ERK在1、3、6 h时的表达量显著或极显著升高(P<0.05,P<0.01);p-p38在1 h时的表达水平极显著降低(P<0.01),3、6 h时极显著升高(P<0.01);p-IκB-α、p-p65在1、3、6 h时的表达量均极显著升高(P<0.01)。IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α在作用1、3、6 h后均呈现出显著或极显著的上调趋势(P<0.05,P<0.01);IL-6在作用1、3 h后极显著上升(P<0.01),6 h后显著降低(P<0.05);IL-12在作用1 h后极显著上升(P<0.01),3、6 h后极显著降低(P<0.01)。本研究成功表达具有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,该蛋白可通过TLR2/4-MAPK/NF-κB信号通路诱导MAC-T发生炎性反应,rCK14-3-3蛋白可作为引起MAC-T炎症的重要因子之一。

新疆紫泥泉草场绵羊面部湿疹病原真菌的分离鉴定及遗传进化分析

为了了解新疆紫泥泉草场绵羊面部湿疹感染的病原真菌及其遗传进化规律,试验利用R语言结合流行病学方法分析绵羊面部湿疹的世界流行情况,对该病高发地新疆紫泥泉草场中的主要病原真菌进行分离与鉴定、PCR-DGGE分析、序列比对、系统进化树构建和遗传进化分析。结果表明:绵羊面部湿疹主要在温带大陆性气候纬度带流行;样品经分离培养,共鉴定出4种分离率较高的真菌;该草场的优势菌属为皮司霉菌属(Pithomyces sp.)、链格孢菌属(Alternaria sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、曲霉菌属(Aspergillus sp.),分离率较高的菌株分别为纸皮司霉菌[Pithomyces chartarum(XJ-Znq)]、链格孢葡萄菌[Alternaria botrytis(XJ-Znq)]、尖孢镰刀菌[Fusarium oxysporum(XJ-Znq)]、黄曲霉菌[Aspergillu flavus(XJ-Znq)];该草场Pithomyces chartarum(XJ-Znq)分离株与同属皮司霉菌属真菌株的同源性高达100%;分离得到的Pithomyces chartarum(XJ-Znq)和Alternariabotrytis(XJ-Znq)序列保守性较好,Fusarium oxysporum(XJ-Znq)和Aspergilluflavus(XJ-Znq)序列单独分支,与同属真菌差异较大。说明新疆紫泥泉草场病原真菌存在一定变异,揭示了绵羊面部湿疹的发病原因。

微卫星引物PCR快速鉴定兔皮肤病原真菌方法的建立及应用

本研究旨在借助微卫星引物PCR和聚类分析软件,建立一种快速准确鉴定兔皮肤病原真菌的分子生物学方法。本试验以寡核苷酸重复序列(GACA)4为引物,首先对3种常见兔皮肤病原真菌(须癣毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌)标准菌株的DNA进行扩增,然后用NTSYS-pc2.10软件分析其DNA指纹的多态性,并根据其多态性的差异进行鉴定分析。最后,用上述方法对临床上的分离株进行鉴定分析,并与传统的形态学鉴定方法进行比较。结果表明,3种不同的兔皮肤病原真菌均呈现不同的DNA指纹,且条带差异明显;聚类分析图显示,同种病原真菌的DNA指纹有很高的相似性(90%～100%);该方法对分离株的鉴定结果与形态学鉴定结果一致。可见,通过微卫星引物PCR结合聚类分析软件可以准确、快速地鉴定兔皮肤病原真菌。

四种中药水提物对枝孢样枝孢霉的体外抗菌活性试验

为了找到对枝孢样枝孢霉有效的中药制剂,试验用纯化水对黄芩、黄柏、黄连和土槿皮四种中药进行提取及加热浓缩,并用96孔细胞培养板采用微量液体稀释法研究黄芩、黄柏、黄连和土槿皮四种中药对枝孢样枝孢霉的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明:黄芩、黄柏、黄连和土槿皮的水提物对枝孢样枝孢霉的体外MIC分别为60 mg/mL、40 mg/mL、15 mg/mL和2.5 mg/mL;MBC分别为60 mg/mL、50 mg/mL、15 mg/mL和2.5 mg/mL。黄芩和黄柏水提取物的抑菌和杀菌效果较差,对枝孢样枝孢霉的药用价值不大;黄连水提取物对枝孢样枝孢霉有一定的抑菌和杀菌作用,土槿皮水提取物的抑菌和杀菌效果均较好。说明黄连和土槿皮的水提取物可用于抑制和杀灭枝孢样枝孢霉。

犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

宠物浅表皮肤真菌病主要由犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌感染引起。本研究根据3种真菌基因内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)区域的序列差异设计4条引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重PCR,同时对其特异性、灵敏性、重复性进行分析。结果显示,建立的多重PCR方法对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌基因组DNA均可扩增出特异性预期片段,条带大小分别为286、596、188 bp;最低检测限(灵敏性)分别为12.6、8.8、13.6pg/μL;被检测的6份人工模拟样品扩增结果准确。应用该多重PCR方法检测27份人临床皮屑样品和43份宠物犬、猫毛发样品,结果显示阳性检出率分别为74.07%(20/27)和83.72%(36/43);采用常规真菌分离培养法从阳性样品中获得10株致病性真菌,分离率为17.86%(10/56);两种检测方法的种属鉴定结果表明多重PCR法优于常规方法。本研究建立的多重PCR检测方法简便、特异、灵敏,可同时对宠物浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。

抗菌肽CGA-N12对腹腔注射热带念珠菌小鼠的治疗作用

CGA-N12为嗜铬粒蛋白A的N端65-76位氨基酸组成的衍生肽,前期研究表明,CGA-N12具有特异性抗念珠菌活性,尤其对临床病原真菌热带念珠菌拮抗活性最强。为研究CGA-N12体内抗真菌活性,建立了热带念珠菌深部感染小鼠模型,分别用每日15mg/kg和30mg/kg的CGA-N12对小鼠进行治疗,并设每日15mg/kg伊曲康唑治疗对照组和感染对照组。通过测定治疗后小鼠存活率、体重变化、肾脏载菌量,以及组织器官病理变化,判断CGA-N12对小鼠的治疗效果。结果表明,每日15 mg/kg和30mg/kg的CGA-N12治疗14d后与感染对照组相比,小鼠肾脏载菌量分别降低97.6%和99.1%,小鼠存活率分别提高40%和45%,体重分别增加1.3g和5.9g,免疫器官指数均显著增加,而与治疗对照组差异不显著。病理切片观察,每日15mg/kg和30mg/kg的CGA-N12对组织器官的病变均有明显改善,并且没有出现伊曲康唑治疗后产生的肝小叶血管内皮细胞增生和肾出血现象。结果表明,CGA-N12对热带念珠菌深部感染小鼠具有治疗作用。

抗菌肽CGA-N46对皮肤感染克柔念珠菌小鼠的治疗作用

为研究抗菌肽CGA-N46对皮肤感染克柔念珠菌小鼠的治疗效果,用克柔念珠菌感染免疫抑制小鼠制备感染模型,采取皮肤病变观察、皮下脓疱液和痂皮分离真菌,确定建模是否成功。对克柔念珠菌感染小鼠模型分别涂抹4 mg/mL和8 mg/mL CGA-N46进行治疗,以成活率、有效率和组织病理变化判断CGA-N46治疗效果。结果表明,以2×108 CFU/mL克柔念珠菌菌悬液感染表皮可建立感染模型;4 mg/mL和8mg/mL CGA-N46均能提高克柔念珠菌感染小鼠成活率,对克柔念珠菌皮肤感染有缓解作用,其中8mg/mL CGA-N46治疗效果更好。结果证实,CGA-N46对克柔念珠菌临床感染有治疗效果,具有开发成新型抗真菌药物的潜力。

奶牛疣状毛癣菌的分离鉴定及其耐药性分析

为了解奶牛皮肤真菌病的病原及其对常见抗真菌药物的敏感性,给临床治疗提供依据,从具有皮肤真菌病症状奶牛病灶处的皮屑样品中,使用沙氏培养基分离病原真菌,通过核糖体r DNA ITS序列对其分析鉴定。使用ATB FUNGUS 3真菌药敏试纸条测定5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑及伏立康唑对所分离病原真菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果表明,在沙氏培养基上分离到的10株中心蜡状成堆、边缘"杉树状"的真菌,经ITS序列分析,鉴定为人兽共患性致病真菌——疣状毛癣菌;所分离的疣状毛癣菌对伏立康唑、伊曲康唑均为敏感,对氟康唑均为中介,而对两性霉素B及5氟胞嘧啶均为耐药;ITS序列分析可实现对真菌的快速、准确鉴定;伏立康唑、伊曲康唑对本研究中分离的疣状毛癣菌具有良好的体外抗菌活性。

兔须癣毛癣菌分类研究进展

须癣毛癣菌可引起兔皮肤真菌病,也是人兽共患病的病原。近年来,研究证明须癣毛癣菌为复合体,因此,对其进行正确分类,准确的鉴定,在兔皮肤真菌病控制和公共卫生方面均具有重要意义。对于须癣毛癣菌的鉴定,过去主要以形态学和配对试验为主,随着分子生物学的发展,现在开始采用基因序列比对的方法,较理想的方法是形态学和分子生物学相结合。

医院感染多重耐药菌的回顾性分析

目的为了解细菌耐药性变化趋势,对某医院近5年住院病人多重耐药菌感染率及耐药菌的变迁进行回顾性调查分析。方法进行细菌培养,共分离3 564株多重耐药菌,药敏结果判断依据NCCLS2002年标准,并排除同一患者的重复菌株。结果住院病人多重耐药菌感染率为1.87%,耐甲氧西啉金黄色葡萄球菌平均感染率为0.38%,耐甲氧西啉凝固酶阴性葡萄球菌平均感染率为1.17%,产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯氏菌平均感染率为0.09%,肺炎克雷伯氏菌之外的产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌平均感染率为0.23%,未发现耐万古霉素的肠球菌。2003-2007年的MRSA、MRCNS的构成比有显著的变化,ESBLKp和ESBLE构成比变化不明显。结论结果显示五年内MRSA、MRCNS的感染率逐年升高;ESBLKp、ESBLE感染率变化小,但均无明显差异。

家畜粪便中捕食线虫性真菌分布情况的研究

分别采集马属动物 (马、骡 )、反刍动物 (牛、羊 )的新鲜粪便 ,进行捕食线虫性真菌的分离培养 ,调查了捕食线虫性真菌在家畜粪便中的分布情况 ;并对分离到的捕食线虫性真菌做了详细的形态学观察 ,进行种属鉴定。结果表明 :从上述家畜新鲜粪便中均分离出捕食线虫性真菌——梨形指环菌 (Dactylaria pyriformis) ,但该菌株在不同家畜粪便中的分布情况不同 ,马属动物粪便的分出率为 10 .0 % (骡粪 :13 .3 % ,马粪 :6.7% ) ;反刍动物粪便的分出率为 2 6.7% (牛粪 :2 3 .3 % ,羊粪 :3 0 .0 % ) ;总分出率为 18.3 %。

绿僵菌Marho2基因功能初步分析

绿僵菌广泛应用于农林害虫的防治,成功侵染寄主昆虫的过程中均伴随着细胞形态的变化,是细胞极性建立和骨架重排的结果。Rho家族中Rho2基因在参与调控细胞极性生长和正常的形态建成中发挥着重要作用。为了探究Marho2基因在绿僵菌生长发育与侵染致病过程中的功能,采用同源重组的技术构建Marho2基因的敲除载体,利用农杆菌介导转化法获得Marho2基因的敲除菌株(ΔMarho2),并对其进行分析。结果表明:与野生型菌株相比,Marho2基因调控绿僵菌的生长发育和致病力,Marho2基因的缺失降低了绿僵菌的毒力、产孢量及孢子萌发延迟,抑制了绿僵菌的湿热耐热性和抗紫外能力。

嗜盐枝芽孢菌A355的分离及种属鉴定

通过高盐选择性培养基平板分离法,从陕西定边盐湖土壤样品中分离筛选极端嗜盐菌株,并通过传统的表型特征(包括形态学观察、生长因子实验、生理生化特征)和系统发育学16S rDNA序列分析鉴定嗜盐菌株的分类学地位。结果表明,分离筛选出1株最适生长盐浓度在10%-15%的细菌菌株A355,初步鉴定其为中度嗜盐菌,属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌科(Bacillaceae)枝芽孢菌属(Virgibacillus salarius sp.)。

家兔真菌病垂直传播的研究

为了检测家兔真菌病是否存在垂直传播,试验选择健康大耳白孕兔16只,随机分成2组,试验组皮内注射0.5麦氏比浊度的须癣毛癣菌悬浊液,对照组皮内注射等量的生理盐水,第28天取孕兔静脉血、肝脏、子宫体、子宫颈、胚胎、胎盘,用Trizol法提取各组织的总RNA,然后再用RT-PCR法检测须癣毛癣菌。结果表明:在孕兔静脉血、肝脏、子宫颈、子宫体、胎盘和胚胎中均检出须癣毛癣菌。说明须癣毛癣菌可以通过胎盘屏障垂直传播。

酵母性乳腺炎病原分离及中药敏感试验

奶牛乳腺炎是奶牛常见重要疾病之一,直接影响着奶牛的产奶量和牛奶质量。其主要有葡萄球菌、链球菌等引起的细菌性乳腺炎和真菌引起的真菌性乳腺炎或细菌与真菌混合感染性乳腺炎。2009年7月,江西省吉安市某奶牛场暴发乳腺炎,西药治疗效果一直不佳,送检两个乳样到江西农业大学兽医院检查,结果经细菌分离鉴定初步诊断为酵母性乳腺炎。针对该酵母菌西药不敏感的情况,选用四味中药和七种抗生素进行了单味中药和西药的药物敏感试验,发现该菌对黄连高度敏感,对其他三味中药和七种抗生素耐药,为该场此次奶牛酵母性乳腺炎的有效防治提供用药依据。

石膏样小孢子菌感染小鼠的Dectin-1、TLR-2和TLR-4及细胞因子动态变化

本试验旨在研究石膏样小孢子菌经皮肤感染小鼠后皮肤损伤组织中模式识别受体Dectin-1、TLR-2和TLR-4及细胞因子动态变化规律。通过对C57BL/6小鼠皮下接种大熊猫源石膏样小孢子菌,分别在第3、7和14天取病变皮肤组织,经PAS染色和HE染色观察孢子定植部位和病理损伤;分别在第3、6和12小时取病变皮肤组织,用荧光定量PCR检测受体mRNA的转录表达量;分别在第1、3、7和14天取样,用荧光定量PCR检测细胞因子mRNA的转录表达量。结果表明:石膏样小孢子菌感染小鼠后导致皮下脓肿,大量的炎性细胞浸润,并伴有角质层增厚。试验中模式识别受体Dectin-1、TLR-2和TLR-4的转录表达量增加(P<0.01),细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、 TGF-β、IL-17A、IL-17F和IL-22的转录表达量增加(P<0.01)。模式识别受体通过识别病原菌表面模式识别分子而引发免疫反应。本研究表明,机体感染石膏样小孢子菌后,模式识别受体表达显著增加,并通过识别菌体表面模式识别分子从而激活Th17途径,分化成熟的Th17细胞分泌细胞因子IL-22、IL-17A和IL-17F,从而发挥抗菌作用。

白色念珠菌分子生物学分型方法研究进展

白色念珠菌是一种致病性酵母真菌,可引起人畜口腔、上呼吸道、阴道黏膜及全身性感染。随着抗真菌药物的长期大量使用,真菌的耐药性越来越严重。临床调查结果表明,白色念珠菌感染在真菌感染病例中跃居第2位。正确鉴定与分类有利于对白色念珠菌感染进行及时诊断、预防和治疗。文章主要对白色念珠菌的分子生物学分型方法进行综述。

瘤胃真菌研究进展

介绍了瘤胃真菌的特点,在饲料降解中的作用,与其他微生物的关系和影响瘤胃真菌的因素;提出了在该研究领域尚待解决的问题。

肉鸡饲养谨防曲霉菌感染

随着科学的不断进步，肉鸡长期的科学饲养管理和免疫程序的不断完善与实施，对家禽危害严重的烈性传染病已得到一定程度的控制，一些由于饲养不当等因素引起的疫病已日益突出，如曲霉菌病，由于此病经常与其他疾病混合感染，