长角血蜱嗅觉相关分子NPC2基因的克隆与初步鉴定

NPC2蛋白是一种小分子的溶酶体蛋白,具有水溶性。在脊椎动物中,NPC2蛋白与胆固醇和脂质的结合和运输有关;在节肢动物中参与多种信息化学物质的结合和识别。为了进一步探究蜱体内NPC2蛋白的分子特性,本研究以长角血蜱为研究对象,对HL-NPC2基因进行了克隆和序列分析,构建了原核表达载体,表达后制备出鼠源多克隆抗体,同时利用实时荧光定量qPCR技术对NPC2在蜱的不同生长阶段及不同组织进行分析,后续做了嗅觉相关性试验。结果显示:HL-NPC2蛋白的ORF为468 bp,编码155个氨基酸;NPC2蛋白在长角血蜱体内以多聚体形式存在,在长角血蜱各个生长阶段和不同吸血阶段的各个组织中都有表达;嗅觉相关性试验表明NPC2蛋白可能与长角血蜱嗅觉相关。本次研究可为该蛋白的后续研究及新的基于嗅觉的蜱控制策略的设计提供理论基础。

林氏扇头蜱几丁质酶基因RLCht 1差异表达分析及酶活性检测

【目的】蜱的蜕皮发育过程与几丁质合成和水解紧密相关,而几丁质的降解主要是通过几丁质酶来完成。试验旨在分析林氏扇头蜱(Rhipicephalus linnaei)不同时期及各组织中几丁质酶RLCht 1基因序列表达差异、体外异源表达RLCht1蛋白并验证其几丁质酶活性,为开发安全高效的生物杀蜱剂提供新型靶标思路。【方法】收集不同吸血状态的各时期蜱及雌性饱血成蜱的不同组织样本用于基因差异表达分析,基于血红扇头蜱合神经节转录组中筛选出的推测的几丁质酶(putative chitinase)序列,在林氏扇头蜱中进行扩增并构建重组原核质粒,使用大肠杆菌系统表达林氏扇头蜱几丁质酶蛋白RLCht1,进行包涵体处理后使用镍柱纯化蛋白,预测RLCht1蛋白结构域;通过与3种不同荧光底物发生催化反应,检测纯化的几丁质酶RLCht1的催化活性大小及作用方式。【结果】RLCht 1基因在不同饱血状态下的各个时期及饱血雌成蜱的不同组织中均有表达,饱血若蜱阶段表达量极显著高于卵期(P<0.01),显著高于其他时期(P<0.05),并在饱血雌性成蜱中肠内有较高的表达量;构建了重组质粒RLCht1-pET-28a并成功表达RLCht1蛋白,经包涵体处理后在150 mmol/L咪唑洗脱下得到纯化的RLCht1蛋白,蛋白预测结果显示,RLCht1属于GH18家族几丁质酶;荧光底物酶活性检测表明,RLCht1包涵体溶解液、复性未纯化的原核蛋白、复性纯化浓缩后原核蛋白分别具有0.078与0.350 U/mL的几丁质外切酶活性及0.034 U/mLβ-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性。【结论】RLCht 1基因与若蜱至成蜱阶段的蜕皮活动相关,影响与免疫、消化、体液调节有关的生命活动过程。本研究在林氏扇头蜱中成功表达几丁质酶蛋白,证明了纯化的RLCht1蛋白具有几丁质催化功能,为林氏扇头蜱几丁质酶RLCht1蛋白在今后杀蜱剂开发中的应用提供了理论基础。

一只流浪犬体表寄生蜱的种类鉴定及其携带病原体的检测与分析

【目的】鉴定一只来自浙江嘉兴的流浪犬体表寄生的蜱种类及其携带病原体情况,了解血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)的生活史及其携带的病原体对人和动物的危害,为后续防治相关疾病提供措施。【方法】分别采用光学显微镜观察和PCR方法对蜱进行形态学和分子种类鉴定;同时分别针对梨形虫目和巴贝斯虫属的18S rRNA、斑点热群立克次氏体ompA、埃立希体dsb和伯氏疏螺旋体5S~23S rRNA基因进行PCR扩增,检测蜱携带病原体情况。【结果】从该流浪犬体表采集的82只蜱均为血红扇头蜱,其中24只蜱携带泰勒虫属,阳性率为29.27%(24/82);4只携带Colpodella sp.,阳性率为4.88%(4/82);2只携带巴贝斯虫属,阳性率为2.44%(2/82);21只携带斑点热群立克次氏体,阳性率为25.61%(21/82);15只携带埃立希体,阳性率为18.29%(15/82);未发现有蜱携带伯氏疏螺旋体。在单只蜱中检出的病原体数量和种类都各不同,其中有24只蜱仅携带1种病原体;12只蜱同时携带2种病原体;6只蜱同时携带3种病原体;有40只蜱未携带所检病原体。【结论】该流浪犬体表寄生的蜱为血红扇头蜱,其携带了泰勒虫属、巴贝斯虫属、斑点热群立克次氏体、埃立希体多种病原体,可对人和动物造成较大的威胁,应加强对该地区蜱的防控,尤其是加强对流浪犬的管理。

刻点血蜱成蜱中肠菌群结构的分析

旨在探明雌、雄刻点血蜱中肠菌群结构特征及其差异。从新疆沙湾市绵羊体表采集刻点血蜱雌、雄蜱,无菌条件下收集雌、雄蜱中肠内容物,提取各样本细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3-V4区,运用Illiumina NovaSeq高通量双末端测序,对数据进行拼接和过滤,扩增子序列变异(ASVs)降噪与物种注释后,对比分析雌、雄蜱中肠菌群结构的组成及差异。结果:雌蜱中肠菌群多样性高于雄蜱;在门水平上,变形菌门、厚壁菌门、异常球菌门、拟杆菌门、放线菌门在雌、雄蜱中肠内相对丰度较高,其中变形菌门相对丰度最高,为2个样本的优势菌门,且变形菌门在雄蜱中肠内的含量大于雌蜱;在属水平上,Schlegelella、不动杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、短波单胞菌属、罗姆布茨菌属等在雌、雄蜱中肠内的相对丰度较高,其中Schlegelella的丰度最高,且在雌蜱(41.7%)中的含量高于雄蜱(0.8%);注释到种水平且2个样本共有的菌种包括:西尔瓦诺斯亚栖热菌、鲍曼不动杆菌、柯克斯氏体共生菌、肠乳杆菌、长双歧杆菌、巴氏杆菌拟杆菌等。本研究表明,刻点血蜱雌、雄蜱中肠菌群结构较为相似,但各细菌在不同分类级别上的相对丰度差异较大,这可能与雌、雄蜱吸血及生理特性不同有关。

原核表达的褐黄血蜱唾液腺蛋白和铁蛋白1的免疫保护效果评价

旨在获得褐黄血蜱重组蛋白(rHfFer1和rHfAV422)并评价其作为抗蜱疫苗的免疫保护效果。通过原核表达获得rHfFer1和rHfAV422,然后将22只新西兰兔随机分为3组(皂素对照组和两个免疫组),其中皂素对照组6只,两个免疫组各8只,所有兔均免疫两次,首免14 d后同等剂量进行二免,二免后一周感染幼蜱,根据蜱的饱血率和蜕皮率为指标评估抗蜱效果。结果显示,rHfFer1和rHfAV422免疫组的饱血率和蜕皮率与对照组均存在显著差异(P<0.05),计算得出rHfFer1和rHfAV422的抗蜱效果分别为68.06%和50.00%。研究结果表明,rHfFer1和rHfAV422可以作为抗蜱疫苗研发的候选抗原。

不同地区长角血蜱的单倍型多样性、遗传分化及种群扩张研究

【目的】探究浏阳、信阳两地区长角血蜱的单倍型多样性(Hd)、遗传分化及种群扩张状况,为后续长角血蜱的种群遗传结构研究提供数据支撑和理论依据。【方法】试验以采集于两地区的30只长角血蜱为样品,对其线粒体cox 1、nad 5基因进行PCR扩增及测序,运用Clustal X、Dnasp 5.0和Network 4.6软件对两地区长角血蜱的单倍型多样性进行分析;运用Dnasp 5.0和Arlequin version 3.0软件探究两地区长角血蜱的遗传分化及种群扩张状况。【结果】长角血蜱cox 1基因序列(776 bp)中共存在4个碱基突变位点,含5个单倍型(A1~A5,Hd=0.3609),其基因分化系数(Gst)、遗传分化系数(Fst)、基因流(Nm)分别为―0.0154、―0.019和―26.82;长角血蜱nad 5基因序列(519 bp)中共存在33个碱基突变位点,含17个单倍型(B1~B17,Hd=0.9402),Gst、Fst、Nm分别为0.0316、0.0503和9.44;长角血蜱cox 1+nad 5基因序列(1295 bp)中共存在37个碱基突变位点,含20个单倍型(C1~C20,Hd=0.9563),Gst、Fst、Nm分别为0.0184、0.0451和10.59。表明两地区的长角血蜱之间尚未出现遗传分化。cox 1、nad 5及cox 1+nad 5基因的种群扩张分析结果显示,来自于浏阳、信阳两地区的长角血蜱均经历了多次种群扩张事件。【结论】来自于浏阳、信阳两地区的长角血蜱之间虽存在低水平的遗传变异和单倍型多样性,但它们之间却存在较高频率的基因交流,无明显的遗传分化,且浏阳、信阳两地区的长角血蜱经历了多次种群扩张事件。

陕西部分地区长角血蜱的鉴定及其基因多态性

为比较陕西省渭南市和商洛市长角血蜱的核糖体基因差异,探讨长角血蜱的分子鉴定方法,先通过体式显微镜观察蜱的形态结构进行形态学鉴定确认。再对长角血蜱的18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S核糖体序列进行测定,比对与边缘革蜱等常见蜱种的基因的同源性并构建系统发育树,分析基因多态性,筛选有效标记。结果显示,核糖体5.8S序列不能区分不同种属的蜱虫,18S、28S、ITS1和ITS2序列可区分不同种属的蜱虫。虽然ITS1和ITS2多态性高于18S,但是18S不仅可以将国内和国外长角血蜱区分开,还可以区分国内不同地域的长角血蜱。18S序列区分不同长角血蜱地域株能力最强,可作为长角血蜱分子鉴定的有效标记。

新疆阿克苏地区羊体表硬蜱种属鉴定及进化分析

为探究阿克苏地区硬蜱的种类及遗传进化特征,从阿克苏地区4个县(市)的羊体表共采集到1016只硬蜱。用显微镜观察硬蜱的形态结构,用聚合酶链反应(PCR)方法鉴定蜱种,选择阳性样本进行测序,同源性比对并进行系统发育分析。结果表明,共3属5种蜱,分别为亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)509只,小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum)133只,图兰扇头蜱(Rhipicephalus turanicus)246只,血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)117只及边缘革蜱(Dermacentor marginatus)11只。亚洲璃眼蜱为优势蜱种(Dr=50.10%,509/1016)。基于16S rDNA基因测序比对发现,采集的5种蜱同种间的同源性均达100%。ITS-2测序的亚洲璃眼蜱、图兰扇头蜱、血红扇头蜱的同源性达99%以上。说明阿克苏地区是蜱虫流行区,建议加强蜱的防控。

贵州省蜱种调查及遗传进化分析

为了调查贵州省蜱虫的物种多样性及分布特征,阐明不同地理株蜱虫间的遗传进化关系,试验采用动物体表采集法与布旗法采集寄生蜱及游离蜱;使用超景深显微镜对蜱虫进行形态学鉴定。选取不同地域、种类及不能准确识别的蜱虫提取组织DNA,采用PCR法扩增蜱虫16S rDNA和COI基因片段并测序,通过BioEdit 7.0软件进行多序列比对确认蜱虫物种;使用MEGA 11.0软件对序列信息进行分析,构建基于16S rDNA和COI基因的系统进化树,对不同地理株蜱虫进行遗传进化分析。结果表明:在贵州省8个市州23个区县共采集到蜱虫2 420只,其中牛寄生蜱2 193只,羊寄生蜱92只,犬寄生蜱36只,游离蜱99只。形态学和分子生物学方法共鉴定出2种蜱虫,其中微小扇头蜱1 560只,长角血蜱860只。在系统发育进化中,微小扇头蜱、长角血蜱的16S rDNA和COI基因都分别与对应的参考基因序列聚集成一簇,贵州省大部分微小扇头蜱序列总体上聚于一个分支,只有黔东南州QDNZ1株在两个进化树中都形成了独立分支;多数长角血蜱序列也聚于同一分支,仅基于COI基因构建的系统进化树中毕节市BJS1株与其他省地理株聚在另一分支。说明贵州省家畜常见蜱种为微小扇头蜱和长角血蜱;在贵州省黔东南州存在一株微小扇头蜱特有株系,且在毕节市的长角血蜱存在省外输入的情况,这可能会增加蜱媒疾病在贵州省传播的风险。

嗜群血蜱和长角血蜱ITS-2、COⅠ和COⅡ基因序列变异与亲缘关系分析

本研究旨在阐明长角血蜱与嗜群血蜱间的亲缘关系。采用聚合酶链式反应(PCR)技术从长角血蜱和嗜群血蜱基因组DNA中扩增得到核糖体第二内部转录间隔区基因(ITS-2)片段、线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)片段和线粒体细胞色素氧化酶亚基II基因(COⅡ)片段,并进行测序,进而分析其基因变异与系统发育。结果表明,长角血蜱和嗜群血蜱的ITS-2、COⅠ和COⅡ基因片段的大小存在差异,长角血蜱3种基因分别为361、479和647bp,嗜群血蜱基因分别为354、474和661bp。长角血蜱与嗜群血蜱间ITS-2、COⅠ和COⅡ基因的相似性分别为84.2%、89.0%和88.4%。以3种基因构建的NJ进化树中,长角血蜱和嗜群血蜱均聚类。因此,认为长角血蜱和嗜群血蜱间ITS-2、COI和COII基因间变异较小,它们是血蜱属中亲缘关系较近的2个有效种,支持传统形态学的分类地位。

新疆革蜱源性绵羊无浆体病原DNA检测

【目的】探究新疆部分地区羊体表寄生的优势革蜱携带病原状况。【方法】采用形态学(借助显微镜)和分子生物学(革蜱种属特异性ITS-2F、ITS-2R引物进行扩增)方法,对采集于阿勒泰、巴音郭楞州等地州羊体表寄生的蜱虫(N=267)进行种属鉴定,对其携带的绵羊无浆体病原(MSP4基因为靶标)DNA进行PCR检测。【结果】当地羊体表寄生的优势种革蜱为草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.slivarum)和边缘革蜱(D.marginatus),均能携带病原MSP4基因,且这三种革蜱种特异基因扩增产物序列(820 bp)与已登录记载的同种革蜱的核苷酸同源性为99%。被革蜱叮咬的126份羊全血样品中34份为绵羊无浆体阳性,均能扩增出850 bp目的基因条带。【结论】新疆阿勒泰地区、巴音郭楞州等地州羊群感染了绵羊无浆体病,其阳性率为27%(34/126)。为进一步研究新疆革蜱的公害州及羊无浆体病的综合防治提供科学依据。

中国蜱传病主要流行趋势及防控科技对策

蜱是一种寄生在动物体表常见的吸血寄生虫,具有从宿主获得多种病原体的能力,是多种人畜共患传染病的重要传播媒介。随着近几年蜱传病的发生具有增加的趋势,蜱及蜱传病再次成为公众关注的焦点。综述了中国蜱传病的主要类型、发生流行因素和病原体危害特点、防控的主要技术手段以及目前防治蜱传病存在的主要科技问题和今后防控蜱传病的科技对策,以期使人们更深入地了解蜱传病,制定相应的防控措施以降低其危害性。

印楝油对兔疥螨幼虫的体外杀螨活性

将兔疥螨幼虫置于聚苯乙烯小平皿中,分别加入不同浓度的印楝油液体石蜡溶液,以天然除虫菊酯和阿维菌素为阳性对照,蒸馏水和液体石蜡为阴性对照,观察记录不同时间段的螨虫死亡数,以死亡率、半数致死时间(LT50)和半数致死浓度(LC50)为指标评价了印楝油对兔疥螨幼虫的离体杀螨活性。结果显示,未稀释的印楝油能在25 min内杀死所有幼螨,其杀螨活性显著强于500 g/L的天然除虫菊酯(825 min,P<0.01),而与25 g/L的阿维菌素无显著差异(19 min,P>0.05);500、250和125 mL/L印楝油对兔疥螨幼虫的LT50分别为1、2、5 h;24 h的LC50和LC95分别为2.908和12.018 mL/L。结果证实,印楝油对兔疥螨幼虫具有较好的离体杀螨活性。

实验室条件下长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生物学特性

在实验室条件下，对我国北方长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生活史进行了首次观察。研究发现，行孤雌生殖的长角血蜱为三宿主蜱；在兔体完成1个世代共需106～154d，饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重的差异不显著（P〉0．05），而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显著（P〈0．01）；雌蜱饱血体重可达吸血前的108．46±19．72倍，与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显著（P〈0．01）。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显著正相关r=0．8970（P〈0．01）；生殖效率指数REI=6．76，生殖适合度指数RFI=6．29；蜱发育时间在不同季节无明显变化。

非洲猪瘟的生物媒介

非洲猪瘟(ASF)存在多种传播途径,但其生物媒介——钝缘蜱是ASF病毒在疫源地传播、长期保存甚至发生变异的关键因素,也是ASF在很多地区和国家久控不绝的重要原因。为此作者将从钝缘蜱的生物学特性和生态学特性、与ASF的相互关系、该类蜱的防控及其在中国的分布现状等角度进行论述,为非洲猪瘟的有效防控奠定基础。

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析

从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只,随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺。半饱血组于蜱吸血第5d采集,分离唾液腺。Trizol法提取总RNA,经第一链合成、LD-PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交(SSH)等步骤,获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT-Easy载体连接,转化DH5a,获得204个白色菌落。扩增检查表明,136个克隆含有插入片段,片段大小为250bp～850bp。测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT-PCR检查结果初步断定,本研究消减效果良好。由网上资源分析得:21个片段与其他蜱的基因,19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因,9个与果蝇的基因具有同源性。

新疆山区草原牦牛革蜱感染情况的调查

【目的】近几年来在新疆牦牛放牧区常发生由蜱虫传播的血液原虫病,对牦牛养殖造成严重的威胁。查清牦牛体表寄生的革蜱感染情况,能有效的对蜱传疾病进行综合防治。并为新疆媒介蜱虫及蜱媒病研究奠定基础。【方法】跟从当地兽医人员及畜主从牦牛体表采集蜱虫800只,带回学校实验室,借助组织解剖镜及光学显微镜对采集于牦牛体表寄生的蜱虫进行鉴定和感染情况调查。【结果】牦牛体表寄生的革蜱种为高山革蜱(20%)、巴氏革蜱(20%)、银盾革蜱(21%)、草原革蜱(20%)和森林革蜱(19%)。在观察分析其蜱种基本形态性状的同时,对其蜱种之间的气门板的形状,背突的大小,足第Ⅱ～Ⅳ胫节到前跗节是否有腹距等的"鉴别性"形态特征进行了描述。建立了新疆革蜱类优势分布种的检索表。【结论】经此次调查及鉴定发现其中高山革蜱、巴氏革蜱是首次发现寄生于牦牛体表的优势革蜱种,为进一步研究新疆革蜱类蜱虫的公害及其蜱媒病的综合防治提供科学依据和技术支撑。

准噶尔盆地硬蜱区系考察与名录记述

蜱类与人类疾病关系密切，可以携带和传播多种重要病原。准噶尔盆地是我国第二大盆地，地处新疆北部，是我国虫媒疫病的自然疫源地。2010年～2012年期间，通过对新疆准噶尔盆地硬蜱区系考察与分类研究，共采获硬蜱标本19466枚，隶属5属21种，以草原革蜱（Dermacentor nuttalli Olenev）、亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum asiaticum Schulze）和银盾革蜱（Dermacentor niveus Neumann）为优势种类，分别占总蜱数的27．76％、23．39％、19．96％。该考察结果填补了近十几年来准噶尔盆地蜱类缺乏系统考察的空缺，考察名录代表了噶尔盆地最新蜱类物种。

南疆部分散养户牛场梨形虫及其媒介蜱感染情况的调查

【目的】近几年来在南疆散养户的牛场常发生梨形虫病,此病是蜱虫传播的一种地方性血液原虫病,死亡率较高。查清部分散养户牛场的梨形虫感染及其媒介蜱的流行情况,更好地预防、控制梨形虫病,减少此病对基层散养奶牛户造成的损失。【方法】现场采集病料(蜱虫和采血),带回校实验室,借助显微镜和有关梨形虫病的资料,对所采集的传播蜱及病原进行虫种鉴定和分析。【结果】综合判断为牛环形泰勒虫病和牛巴贝斯虫病,其主要传播蜱是残缘璃眼蜱(Hyalomma detritum)、小亚璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)和微小牛蜱(Boophilus microplus)。血样检查结果为在所采样的50头牛当中,血液原虫的感染率为84%,其中牛的环形泰勒虫感染率为71.4%,双芽巴贝斯虫感染率约为40.5%,牛的巴贝斯虫感染率约为29%。【结论】基本查清了梨形虫病在部分散养户牛场发生、流行情况和当地媒介蜱虫的优势分布种类,发现在南疆部分散养户牛场存在几种梨形虫的交叉感染情况。研究为制定综合防治提供了科学依据。

中华硬蜱唾液腺抗原成分的分析研究

中华硬蜱唾液腺提取物（ＳＧＥ）经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出２４条蛋白带，其中主带有６条，分子量分别为１４２、１０５、９４、６６、６４和５６ＫＤ。用中华硬蜱叮刺家兔后兔血清做免疫印渍，特异性抗原带为１０５和９４ＫＤ。说明中华硬蜱１０５和９４ＫＤ的蜱唾液腺蛋白抗原能够有效地诱导宿生产生抗体。