稳定表达Cas9蛋白的C2C12细胞株构建

【目的】优化慢病毒包装体系并建立能稳定表达Cas9蛋白的小鼠成肌细胞系(C2C12),为基因编辑技术研究提供细胞模型和理论参考。【方法】以C2C12细胞为研究对象,设对照组和试验组,调整三质粒(pmd2.g、pspax2和Cas9)用量配比以优化慢病毒包装体系。利用优化后的慢病毒包装体系将表达Cas9蛋白的质粒(lenti-Cas9-puro和lenti-Cas9-Blast)包装成慢病毒感染C2C12细胞。采用药物筛选富集和单克隆分选获得稳定表达Cas9蛋白的C2C12单克隆细胞株。利用基因组鉴定、免疫荧光染色、sgRNA检测等试验验证细胞株构建情况。【结果】慢病毒包装体系优化后,试验组质粒转染效率达90%以上,极显著高于对照组(80%)(P<0.01);试验组慢病毒滴度提高至1.8×10^(7) TU/mL,极显著高于对照组(6.2×10^(6) TU/mL)(P<0.001)。PCR结果显示,C2C12-Cas9稳转细胞株成功扩增出Cas9、puro和BSD序列,外源Cas9序列成功整合到C2C12细胞基因组中,而野生型的C2C12细胞不存在Cas9序列。免疫荧光染色结果表明,C2C12-Cas9稳转细胞株能表达Cas9蛋白。T7E1酶切和Sanger测序结果表明,整合的Cas9蛋白具有切割活性。【结论】通过调整三质粒用量配比成功优化慢病毒包装体系,提高质粒转染效率和慢病毒滴度。成功构建能稳定表达Cas9蛋白的C2C12细胞株,建立了构建稳转细胞株的相对成熟体系。

Nesfatin-1对饥饿小鼠氧化应激及自噬的影响

为了研究在急性禁食状态下Nesfatin-1对机体氧化应激及自噬的影响,试验构建小鼠饥饿模型,将50只小鼠随机均分为阴性对照组、禁食24 h组、禁食48 h组、Nesfatin-1+禁食24 h组、Nesfatin-1+禁食48 h组。禁食24,48 h组小鼠分别禁食24 h及48 h;Nesfatin-1+禁食24 h组及Nesfatin-1+禁食48 h组分别在禁食24,48 h基础上按每20 g体重腹腔注射1.25 nmol/g Nesfatin-1 0.26 mL;阴性对照组腹腔注射同等剂量PBS。对各组小鼠进行眼球采血,处死后解剖取脑、肝脏组织。采用化学荧光法测定各组小鼠肝脏氧化基因指标活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光强度,采用ELISA方法测定各组小鼠血清丙二醛(malonaldehyde,MDA)和Nesfatin-1含量,运用实时荧光定量PCR方法测定各组自噬相关基因Beclin-1、LC3、P62 mRNA相对表达量。结果表明:与阴性对照组相比,禁食24 h组及禁食48 h组小鼠ROS荧光强度、MDA含量极显著升高(P<0.01),脑组织Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01),P62 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01);在禁食24,48 h后,小鼠血清Nesfatin-1含量显著降低(P<0.05),使用Nesfatin-1干预后,其含量极显著升高(P<0.01);与禁食24 h组相比,Nesfatin-1+禁食24 h组小鼠的ROS、MDA含量和Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01),P62 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与禁食48 h组相比,Nesfatin-1+禁食48 h组小鼠的ROS、MDA含量和Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01),P62 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)。说明急性禁食会使小鼠体内Nesfatin-1含量降低,氧化应激与自噬水平上调,Nesfatin-1能增强细胞活力,注射Nesfatin-1后可以降低小鼠体内的氧化应激水平,也能够降低小鼠在急性禁食状态下上调的自噬水平。

不同控食方式对小鼠体重及代谢的影响

为探讨不同控食方式对小鼠体重及糖脂代谢的影响,将24只2月龄的雄性小鼠随机分为4个组,即对照组、周期性控食组、隔日禁食组和限制采食组,每组6只。每天测定体重,喂养8天后,每组任取3只,采血处死,取心、肝、脾、肾称重;其余按正常采食量继续喂养4天后同上述操作。结果:采用3种控食方式的小鼠与对照组小鼠相比,体重均有不同程度的降低,其中周期性控食组的降低幅度最大,限制采食组其次,隔日禁食组最小,并且3组小鼠恢复正常饮食后体重都有所反弹;血糖、血清胆固醇及甘油三酯也有不同程度的降低,其中隔日禁食组的变化幅度最小,周期性控食组变化幅度最大;周期性控食组对内脏的影响较大,其他两种控食方式影响较小。

小鼠精原干细胞的形态结构及其细胞化学和免疫组化特性

应用光镜、电镜观察了 ７～８ ｄ 小鼠精原干细胞的形态结构特点；应用细胞化学、免疫组织化学方法研究了体外培养小鼠精原干细胞的细胞化学和免疫组织化学特性。结果显示，精原干细胞呈圆形，直径（９±１） μｍ ，核大，呈圆形或轻微卵圆形，胞质较少；核内常染色质占绝对优势，异染色质极少；胞质内核糖体、线粒体较丰富，其他细胞器不发达；精原干细胞 Ａ Ｋ Ｐ染色呈阳性或强阳性，胞质内脂滴很少或没有；精原干细胞表达特异的 ｃｋｉｔ 受体；体外培养的小鼠精原干细胞常呈不完全的胞质分裂，细胞间由细胞间桥相连而呈链状或团状的细胞群丛，细胞群常由偶数细胞组成。

Dkk2基因对雌性小鼠卵泡发育过程的功能探究

卵巢颗粒细胞的生长对哺乳动物卵泡发育至关重要,本研究旨在探究Dkk2对雌性小鼠卵泡发育的影响,并对其潜在的调控机制进行分析。运用Crispr-cas9的方法构建Dkk2基因敲除C57BL/6小鼠,通过免疫荧光、免疫组化和蛋白免疫印迹等实验探究了Dkk2基因敲除对小鼠卵泡发育的影响及其作用机制。结果显示:相比野生型小鼠,Dkk2基因敲除小鼠的产仔数和原始卵泡显著减少,卵泡闭锁显著升高;抑制Dkk2的表达会显著促进小鼠卵巢颗粒细胞凋亡,抑制细胞增殖;对8周龄Dkk2基因敲除小鼠的卵巢组织进行转录组测序发现,Dkk2可能通过Wnt信号通路调控卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡。本研究揭示了Dkk2在小鼠卵泡发育过程中的作用,可为哺乳动物繁殖性状的遗传改良提供新的靶基因。

不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

为探讨中药对小鼠乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取5种与泌乳相关的中药(王不留行、甲珠、通草、蒲公英、漏芦)研究其对体外培养的小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响。采用荧光定量RT-PCR及毛细管电泳技术分别对β-酪蛋白的mRNA和蛋白表达水平进行检测,并应用激光共聚焦显微镜技术检测泌乳信号转录因子Stat5的含量变化。结果表明,通草、蒲公英和漏芦能显著促进β-酪蛋白的表达,王不留行和甲珠能极显著促进小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达。提示王不留行、甲珠和通草可通过影响乳腺上皮细胞乳蛋白基因的表达而促进泌乳,其机理尚待进一步研究。

杠板归总黄酮对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

【目的】探究杠板归总黄酮的保肝药作用及其作用机理,为杠板归的深入研究提供活性物质基础和理论依据。【方法】随机将60只小鼠分为正常组、模型组、联苯双酯阳性组(150 mg/kg)及杠板归黄酮高剂量组(600 mg/kg)、中剂量组(400 mg/kg)、低剂量组(200 mg/kg),除正常组外,其余各组按16 m L/kg剂量灌胃56%vol白酒,1 h后各用药组按20 m L/kg剂量灌胃给药,正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水,连续给药14 d,然后通过计算肝脏指数(LI)、脾脏指数(SI)、胸腺指数(TI),生化测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD),ELISA检测肝组织中白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等,探究杠板归总黄酮对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。【结果】各杠板归总黄酮剂量组可有效降低因酒精性肝损伤引起小鼠升高的LI,并升高SI和TI;又能降低血清ALT、AST活性及MDA含量,升高SOD活性;还可降低酒精性损伤肝组织中的IL-4、IL-6和TNF-α含量,且对小鼠肝小叶结构、肝细胞坏死和变性及炎细胞浸润等方面均有改善作用,尤其以杠板归总黄酮高、中剂量组的效果最明显。【结论】杠板归总黄酮对小鼠急性酒精性肝损伤具有保护作用,其机理是通过抗脂质过氧化、抑制肝脏炎症反应来实现保肝作用。

酵母多糖对小鼠免疫功能影响的体外实验研究

[目的]研究酵母多糖对小鼠免疫功能的影响,为酵母多糖相关产品的开发利用提供可靠的实验依据。[方法]分离提取小鼠的脾细胞,分为添加酵母多糖组和不加酵母多糖的对照组,检测小鼠脾细胞的增殖活性;留取细胞上清液,测定白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)含量;用流式细胞术检测T淋巴细胞和B淋巴细胞的数量,观察酵母多糖对T、B细胞增殖的影响。[结果]酵母多糖组增殖活性明显高于对照组(P<0.01);在一定剂量范围内,该组IL-2、IFN-γ的含量与酵母多糖呈剂量依赖关系,另外酵母多糖对T、B细胞均有明显的增殖效果。[结论]酵母多糖可显著提高小鼠免疫系统的功能。

紫黑糯米皮层对促进小鼠骨髓祖细胞分化和脾淋巴细胞增殖的影响

紫黑糯米皮层对促进小鼠骨髓祖细胞分化和脾淋巴细胞增殖的影响顾德法，李军，易扬华，郑钦岳，沈有安（上海市农业科学院作物育种栽培研究所，上海２０１１０６）（中国人民解放军第二军医大学药学院，上海２００４３３）关键词：紫黑糯米，骨髓祖细胞分化，脾淋巴细胞增...

新生小鼠卵巢移植雄鼠肾囊下卵泡的生长发育

将1日龄小鼠卵巢移植入成年雄鼠肾囊下,分别于移植后18d、36d回收移植卵巢进行形态学、组织学观察,以评价卵巢移植体在成年雄性受体小鼠体内生长及卵泡发育潜能。结果表明:移植体生长增大,有各级生长卵泡发育;18日龄移植体平均直径为1881.1μm±204.7μm,与1日龄卵巢相比差异极显著(P<0.01),卵泡发育到有腔卵泡阶段;36日龄移植体平均直径达2575.3μm±466.4μm,显著大于18日龄移植体(P<0.01),有成熟卵泡出现,未观察到黄体;从移植体分离到GV期卵母细胞和卵丘卵母细胞复合体。研究表明1日龄小鼠卵巢移植体在雄性受体生理环境中具有正常生长发育和形成成熟卵泡的潜能。

不同剂量STZ诱导小鼠糖尿病模型及生殖能力的研究

目的:不同剂量链脲菌素(STZ)1次注射诱导小鼠糖尿病模型的建立,了解糖尿病发病机理,以及糖尿病小鼠的生殖能力。方法:ICR雌性小鼠随机分为正常对照组及200、150 mg.kg-1 STZ组。腹腔注射不同剂量STZ诱导小鼠糖尿病作为动物模型。葡萄糖测定试纸和尿液分析试纸条联合检测小鼠血糖和尿糖的变化,光镜观察胰岛的组织学改变情况,放射免疫方法检测小鼠血清中胰岛素的水平,并将制作的模型小鼠与正常雄鼠交配。结果:对照组血糖基本无变化,模型组血糖值随时间增加而增加,3周后稳定。高剂量组,血清葡萄糖浓度明显升高(P<0.001),血清胰岛素下降极显著(P<0.001);胰岛破坏严重。低剂量组分小鼠血清葡萄糖升高和未升高组,但血清胰岛素浓度均明显降低(P<0.01),胰岛内可见炎性细胞浸润。血糖升高小鼠交配能力下降,仅为46.9%,流产率73.9%,畸形率为9%,仔鼠出生死亡率20%。结论:不同剂量的STZ均能诱发糖尿病模型,且影响雌鼠的交配能力和子代的生长发育。

甘露寡糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响

[目的]探讨甘露寡糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响,为甘露寡糖相关产品的开发应用提供实验依据。[方法]通过环磷酰胺制造免疫功能低下小鼠模型,给予甘露寡糖11 d后观察小鼠体重、脾脏指数、胸腺指数、巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素滴度和迟发型变态反应强度变化。[结果]甘露寡糖组体重、脾脏指数、胸腺指数、巨噬细胞吞噬率、吞噬指数、抗体积数和左右后足重量差均较模型组提高(P<0.01)。[结论]适当剂量甘露寡糖可提高免疫低下小鼠免疫功能。

贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠肺中IFN-γ·TNF-α的影响

[目的]研究贯叶连翘提取物(HPE)对流感病毒感染小鼠肺组织中肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)等细胞因子的影响。[方法]以流感病毒滴鼻感染小鼠,分别灌胃给药(贯叶连翘提取物高剂量组100 mg/kg、低剂量组50 mg/kg和病毒唑组10 mg/kg),0.2ml/次,2次/d,5 d后摘眼球放血处死动物,摘出全肺,低温条件下制成肺匀浆,离心后取上清采用双抗体夹心ELISA法观察小鼠治疗前后肺组织中IFN-γ、TNF-α的变化。[结果]与模型对照组相比,贯叶连翘提取物流感病毒感染小鼠肺组织中TNF-α显著降低(P<0.05),IFN-γ极显著升高(P<0.01)。[结论]贯叶连翘提取物对机体抗感染免疫有一定调节作用。

炎毒热清及其微乳制剂小鼠急性毒性试验和体外抑菌作用

[目的]为评价炎毒热清（AEE）及其微乳制剂（AEE-ME）的安全性和抑菌活性。[方法]用灌胃法对小鼠进行急性毒性试验,并采用改良寇氏法计算半数致死量及其95%可信区间;采用杯碟法研究抑菌作用。[结果]AEE经小鼠口服LD50为10.937 g/kg,95%可信区间为9.309-12.850 g/kg;AEE-ME经小鼠口服LD50为5.357 g/kg,95%可信区间为4.388-6.566 g/kg。AEE对猪大肠杆菌O149、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌、无乳链球菌的MIC分别为10.00、20.00、20.00、10.00 mg/ml;AEE-ME对上述4种菌的MIC依次为5.00、10.00、5.00、5.00 mg/ml,对绿脓杆菌的MIC为20.00 mg/ml。[结论]AEE属实际无毒性物质,AEE-ME为低毒性物质,二者均有抑菌活性且AEE-ME抑菌作用强于AEE。

小茴香对小鼠免疫功能的影响

[目的]研究小茴香对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响。[方法]以环磷酰胺制备小鼠免疫低下模型并结合体外药理试验,测定灌胃给药后小鼠体内巨噬细胞吞噬率、血清溶血素抗体水平,并观察植物血凝素诱导T淋巴细胞的增殖反应。采用含药血清体外培养小鼠腹腔巨噬细胞,MTT法考察巨噬细胞的活性,并观察体外培养的巨噬细胞吞噬红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。[结果]小茴香提高免疫抑制小鼠碳粒廓清率,促进血清溶血素形成以及促进T淋巴细胞增殖。[结论]小茴香有提高小鼠免疫功能的作用。

花茶对被动吸烟小鼠耐缺氧能力的影响

30只小鼠随机分为3组(n=10),分别为对照组(CK)、被动吸烟级(B)、吸烟用茶组(C);B、C组每天2次被动吸烟,每次1 h(6支/h),C组每天饮用ST茶汤(30%),第31 d进行密闭耐氧试验,测定3组小鼠的缺氧耐受时间,然后取血测定血红蛋白、肝糖原含量,并剖取胸腺和脾脏,计算其指数。结果表明,C组小鼠的缺氧存活时间显著长于B组,肝糖原含量、胸腺指数显著高于B组(p<0.05),血红蛋白含量和脾指数与B组差异不显著(p>0.05)。说明ST能显著延长PS小鼠的耐缺氧时间,缓解PS对小鼠免疫器官的伤害。

不同强度游泳应激对小鼠血清ALT、AST和ALP活性的影响

为了探讨不同强度游泳应激对小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,试验选取40只昆明小鼠进行游泳试验,于游泳前和游泳15 min、30 min、50 min后分别随机选取10只小鼠,致死,眼眶采血并测定血清中ALT、AST和ALP活性。结果表明:15 min游泳应激使小鼠血清ALT和AST活性显著升高(P<0.05),应激30 min和50 min后ALT活性显著下降(P<0.05),但仍显著高于游泳前(P<0.05);而AST活性在应激30 min后继续维持高水平,50 min后又显著下降(P<0.05),但仍显著高于游泳前水平(P<0.05)。15 min游泳应激使小鼠ALP活性略有上升,但差异不显著(P>0.05);应激30 min后显著升高(P<0.05);应激50 min后继续维持较高水平。说明游泳应激可能造成小鼠肝脏、心脏、肌肉等组织器官损伤,血清ALT、AST和ALP活性可作为评价小鼠应对游泳应激的敏感指标。

沙枣多糖对免疫抑制小鼠的调节作用

[目的]研究沙枣多糖(EAPS)对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。[方法]以环磷酰胺(Cy)作免疫抑制剂建立小鼠免疫抑制模型,进行免疫脏器指数的检测、碳粒廓清试验、血清溶血素形成和迟发型超敏反应,探讨沙枣多糖对免疫功能低下小鼠的影响。[结果]沙枣多糖能明显提高正常小鼠脾脏指数、胸腺指数及免疫抑制小鼠脾脏指数;增强正常小鼠和免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能,恢复免疫抑制小鼠迟发型超敏反应,促进溶血素的生成。[结论]沙枣多糖可对抗Cy所致的免疫抑制,明显增强小鼠免疫功能。

枯草芽孢杆菌发酵红参药渣产物对小鼠生长和繁殖性能的影响

【目的】探索红参中药渣发酵产物对小鼠生长和繁殖性能的影响,为红参药渣发酵产物的再利用提供参考依据。【方法】将45只成年雌性小鼠随机分成3组,分别饲喂基础日粮,红参药渣+基础日粮,发酵后的红参药渣+基础日粮,连续饲喂一周,记录每日采食及增重情况。一周后进行配种,作繁殖性能测定,并用其所生仔鼠进行生长发育指标的测定。【结果】发酵药渣组的小鼠料重比相比空白组略低,相比药渣组则显著降低(P<0.05)。发酵药渣组产仔数相比药渣组、空白组分别增加了18只、16只。空白组、药渣组、发酵药渣组的初生平均重分别为1.07、0.90、1.29g,发酵药渣组相比空白组、药渣组有显著提高(P<0.05)。【结论】红参药渣发酵后对小鼠的繁殖性能具有一定的促进作用。

红车轴草总黄酮对小鼠免疫功能的影响

[目的]研究红车轴草总黄酮对小鼠免疫功能的影响。[方法]设计迟发变态反应试验、炭粒廓清试验、脏器指数试验,每个试验均用40只小鼠,随机分成4组,设对照组与高、中、低剂量3个试验组。3个试验组分别给予85mg/(kg.d)(高剂量组),53mg/(kg.d)(中剂量组),22mg/(kg.d)(低剂量组)红车轴草总黄酮灌胃,对照组以吐温-盐水液灌胃。[结果]3个试验组48h足跖增厚与对照组均有增加,以中剂量试验组增加显著(P<0.05);中剂量组与低剂量组的吞噬指数较对照组有显著增高(P<0.05);脏器指数试验结果表明,试验组与对照组均有增加,但没有显著的统计学意义。[结论]试验全面评价了红车轴草总黄酮的各种生理药理功能及其对免疫功能的影响,为其开发应用提供了可靠的参考资料。