家蚕卵滞育人工解除方法及机制研究进展

卵滞育是家蚕应对周期性不利自然环境表现出的一种在胚胎形成早期发育停滞的生理现象。为满足蚕业生产需要,通常使用产后盐酸浸渍方法以快速解除滞育。由于使用盐酸存在一定的安全隐患,研究更加安全环保的新方法具有重要意义。此外,家蚕既是重要的经济昆虫,也是鳞翅目模式生物,研究其滞育解除的生理变化与分子调控机制,有望育成非滞育系家蚕新品种。本文综述分析了各种人工解除滞育方法的优势和缺陷,并总结了滞育解除的生理生化及分子机制,以期为研究人工解除蚕卵滞育提供参考。

家蚕雌蛹及其卵巢脂肪酸丰度分析

研究使用气相色谱分析了家蚕雌蛹蛹体和卵巢中的脂肪酸丰度.结果显示,蛹化后的第1 d至第6 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度小,第6 d至第9 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度大.蛹化期间,主要脂肪酸丰度总体呈下降趋势,微量脂肪酸丰度呈上升趋势.卵巢脂肪酸丰度的变化幅度随发育递减.不同主要脂肪酸的变化幅度和方向各异,其中不饱和脂肪酸丰度增加,饱和脂肪酸丰度下降.微量脂肪酸丰度随发育明显下降,这表明微量脂肪酸与雌性生殖关联较小.蛹体和卵巢脂肪酸丰度的差异随发育逐渐缩小,至蛹化第6 d,卵巢中绝大部分的脂肪酸丰度与刚蛹化时有很大差异,但整体上与蛹体丰度相似,说明卵巢脂肪酸的积累依赖蛹体脂肪酸.蛹化后期,卵巢中丰度最高的α-亚麻酸出现下降,丰度次高的油酸明显增加,这可能与卵壳生成和卵子成熟有关;亚油酸在蛹化第6 d丰度差异最大,其在卵巢中的丰度显著增加并明显高过蛹体,表明卵巢具有为其发育以及卵子发生积累脂肪酸的特性.研究结果可为深入研究脂肪酸在家蚕和其他昆虫雌性生殖中的作用机制提供重要线索.

过表达BmAbl1基因促进家蚕茧丝产量

在过去5000多年的驯化过程中,家蚕茧丝的产量是人们努力改进的重要指标之一。研究发现,在家蚕BmN细胞中过表达非受体酪氨酸蛋白激酶基因BmAbl1时,部分谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase)编码基因的表达水平显著上升。基于piggyBac转座系统构建了过表达BmAbl1的转基因家蚕品系,发现其与对照品系家蚕相比,5龄幼虫的体重显著增加,全茧量、蛹重、茧层量以及茧层率均显著上升。且后部丝腺中谷胱甘肽S转移酶编码基因的转录水平显著上调,丝素重链和丝素轻链基因表达量分别是对照品系的3.3倍和1.3倍。上述结果表明,过表达BmAbl1提高了家蚕的茧丝产量。

基于转录组测序分析家蚕中肠、脂肪体和血淋巴组织可变剪接事件

可变剪接(alternative splicing, AS)在家蚕基因组中普遍存在,在基因转录后调控和蛋白质多样性方面发挥重要作用。为揭示家蚕物质吸收、循环、合成和代谢相关组织AS事件的特征,分析家蚕品种间抗氧化水平差异的形成机制,本研究采集预蛹期的东肥和彩4这两个家蚕品种的中肠、脂肪体和血淋巴组织样品进行转录组测序(RNA sequencing, RNA-seq),将测序数据比对到参考基因组后,采用rMAT软件进行AS事件分析和发生AS事件的基因(AS基因)鉴定,进一步解析AS基因发生AS事件的数量、类型和组织分布的特征,并对全部AS基因和品种间差异表达AS基因进行GO和KEGG功能富集分析。结果表明,家蚕中肠、脂肪体和血淋巴中分别检测到13 525、7 419、6 965个AS事件,对应发生在4 118、3 109和2 975个AS基因中。3′端可变剪接位点(alternative 3′splice sites, A3SS)、5′端可变剪接位点(alternative 5′splice sites, A5SS)、互斥外显子(mutually exclusive exons, MXE)、内含子保留(retained introns, RI)、外显子跳跃(skipping exon, SE)5种类型AS事件中,SE数量占比最高,在每个组织中的发生比例均不低于64.95%,RI数量占比最低,均不高于1.79%。每个组织中发生1种类型AS事件≤3个的AS基因数量占基因总数的81.14%~100%,单个AS基因发生1种类型AS事件的数量最高为66个。发生A3SS、A5SS、RI事件的AS基因有高达53.19%~61.75%和16.56%~20.57%的3组织和2组织重叠比例,发生SE、MXE事件的AS基因组织特异性高,单一组织独有的比例为43.99%和70.96%。每个组织AS基因总数量里,发生1个单独类型AS事件的基因约占63.40%~69.96%,同时发生3、4、5个类型AS事件的基因合计占比低于7.00%。GO功能注释、KEGG通路富集分析全部AS基因的功能主要为物质的合成、代谢和转运,能量代谢,细胞对刺激的反应和信号转导,基因表达和翻译的调控,蛋白质的加工、修饰和水解,磷酸转移酶和激酶活性等。两个家蚕品种差异表达AS事件在中肠、脂肪体和血淋巴分别为302、176、244个,对应的AS基因数量为266、137和186个,差异AS基因可富集到氧化-还原过程和含核碱基的化合物、芳香族化合物、杂环、有机环状化合物、大分子的生物合成过程。可见,家蚕3个检测组织内存在数量可观的AS事件和AS基因,AS事件发生数量和类型具有组织特异性,高、低抗氧化水平家蚕品种差异AS基因参与抗氧化活性物质的合成,可以为家蚕机体物质利用和转化的研究提供重要功能候选基因。

RAPD标记构建家蚕分子连锁图

以大造、Ｃ１０８及其Ｆ２群体构建了１个家蚕的ＲＡＰＤ连锁框架图，该图含ＲＡＰＤ标记位点１８２个，来自大造的１０３个标记分属前２３个连锁群，来自Ｃ１０８的７９个标记分属后１６个连锁群，覆盖基因组的总长度为１１４８．３ｃＭ（ｃｅｎｔｉｍｏｒｇａｎ），它能与本室用同一群体构建的ＳＡＤＦ图谱相整合，亦可与相应的ＲＦＬＰ图谱相互补充。

不同溶解体系的丝素蛋白分子质量及对再生丝素膜性能的影响

为了便于根据不同丝素蛋白制品开发要求控制丝素蛋白的分子质量,用SDS-PAGE电泳方法检测不同溶解体系制取丝素蛋白的分子质量,并对不同分子质量丝素蛋白制备的再生丝素膜进行傅里叶红外光谱(FTIR)、热重(TGA)、微商热重(DTG)和热水溶失率等结构与性能的测试。SDS-PAGE检测结果显示,在LiBr-CH3CH2OH-H2O、Ca(NO3)2-CH3OH-H2O和Na-SCN-H2O溶解体系中的丝素蛋白分子质量较高且分布广;在CaCl2-CH3CH2OH-H2O和LiBr-H2O溶解体系中的丝素蛋白分子质量较低。FTIR、TGA、DTG和热水溶失率测试结果显示,低分子质量丝素蛋白溶液在成膜时较难形成α-结构和β折叠结构;而高分子质量丝素蛋白溶液在成膜时则较容易转变形成这2种结构。

利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性鉴定动物种类

目的:建立一种精确可靠的鉴定常见的10种动物(猪、狗、牛、山羊、绵羊、马、鸡、鼠、三文鱼和鹿)的方法。方法:利用12SrRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)鉴别动物种类。将线粒体12S rRNA基因通过引物的5'端用FAM荧光标记,从基因组DNA中扩增450bp的目的片段。引物对1(下游引物FAM标记,上游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶AluⅠ酶切。引物对2(上游引物FAM标记,下游引物不标记)扩增的PCR产物用限制性内切酶Tru9Ⅰ酶切。得到的酶切产物分别在遗传分析仪ABI3100上进行毛细管电泳,片段大小用Peak Scanner 1.0软件分析。结果:根据AluⅠ酶切图谱能够区分鸡、马、猪和三文鱼,而鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗因酶切图谱相同无法分开。根据Tru9Ⅰ酶切图谱,能够进一步将鹿和牛、山羊和绵羊、鼠和狗分开。同一种动物不同个体的酶切图谱完全相同,结果具有可重复性。没有出现物种内多态的现象。大多数情况下,实际得到的末端片段长度与理论值非常接近,只存在2～5bp的差异。结论:该方法操作简单、结果精确,适用于鉴定动物种类。

家蚕抗浓核病毒分子标记筛选及分析

在抗DNV的品种秋丰、高感品种华八 35及其近等基因系BC6 中,通过 495个RAPD随机引物在各个品种的DNA混合物中进行PCR扩增,获得了一个与家蚕抗DNV基因相关的分子标记S366,对这个标记进行了克隆、测序,并且根据序列设计特异引物转换成SCAR标记,在多个敏感性和抗性品种中进行了验证,证明此分子标记真实可靠。通过生物信息学对测序片段进行分析,发现该片段序列与黄嘌呤脱氢酶基因有 91%的同源性。

酶解与膜法联用制备蚕蛹生物功能活性肽

目的:分离制备蚕蛹中的生物活性肽。方法:以蚕蛹为原料,经防褐变,除脂肪处理后,酶解与膜法联用,经胰蛋白酶解的蚕蛹蛋白水解液,通过截留分子量一万超滤膜,得到蚕蛹生物活性肽。培养酵母菌,测定蚕蛹生物活性肽对糖分解代谢的影响。结果:酶解与膜法联用分离制备的蚕蛹生物活性肽,对糖分解代谢丙酮酸生成有促进作用。

家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量的变化规律

用紫外分光光度法研究了家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量在品种、生长发育阶段、性别间的变化规律。家蚕幼虫体富含黄酮类化合物,其含量在蚕品种及杂交组合间存在显著差异,高低相差3.13倍;在性别间,雄蚕体高于雌蚕体;在龄期间,随龄期增大而逐渐增加;在5龄期,随生长而逐渐增加,至第3天达最高值,此后除第5天有一小波动外,随生长而逐渐下降,至成熟时又稍有上升。

蚕体黄酮类化合物的提取及不同家蚕品种间的含量差异

为了高效提取家蚕幼虫体内的黄酮类化合物及筛选富含黄酮类化合物的家蚕品种,通过正交试验优化提取工艺条件,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定分析16个黄血蚕品种和3个普通白血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量。家蚕幼虫粉经超声波预处理20 min后以80%乙醇溶解,当原料质量浓度为25 g/L,在60℃水浴中提取6 h的效果较佳,提取蚕体总黄酮的质量比达到0.473 mg/g。黄血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量极显著高于普通白血蚕品种,两类品种样品中的总黄酮平均质量比分别为0.560、0.513 mg/g。在16个黄血蚕品种中,以来源于东南亚地区的二化性品种幼虫体中的黄酮类化合物含量较高,是富含黄酮类化合物的家蚕品种资源。

雌雄家蚕血液中的保护酶差异研究

测定五龄家蚕血液中的过氧化氢酶、超氧化物岐化酶、羧酸酯酶活性,结果显示,过氧化氢酶、羧酸酯酶的活性均为雄蚕大于雌蚕,超氧化物岐化酶活性则为雌蚕大于雄蚕;比较分析血液中的羧酸酯酶同工酶、多酚氧化酶同工酶的电泳扫描图谱,表明家蚕性别间均存在明显差异。

基于ISSR标记的云南桑褐斑壳丰孢菌遗传多样性分析

为明确云南省桑褐斑病病原菌桑褐斑壳丰孢菌(Phloeospora maculans)的遗传多样性及亲缘关系,采用ISSR分子标记对分离自云南省不同县市的58株桑褐斑壳丰孢菌进行遗传多样性分析。结果显示,物种水平上,Nei’s多样性指数H为0.276 3,Shnanon信息指数I为0.421 0,表明云南桑褐斑病病原菌具有丰富的遗传多样性;遗传距离分析表明,保山和曲靖的菌株种群遗传相似系数最高为0.945 0,亲缘关系最近,保山和蒙自的菌株种群遗传相似系数最低为0.870 6,亲缘关系相对较远;居群每代迁移数N_(m)为1.889(>1),表明不同地理种群间存在一定的基因流动;利用NTSYS软件按UPGMA方法聚类分析,58株桑褐斑壳丰孢菌的遗传相似系数在0.69~1.00之间,当相似系数为0.73时,可将58个供试菌株分为4个类群,但菌株并没有按地理来源聚为不同的组,表明菌株之间的遗传多样性与其地理来源无明显的相关性。

柞蚕血液过氧化氢酶(CAT)活性的研究

本试验对柞蚕(Antheraeapernyi)血液过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性进行了研究。在幼虫期 ,CAT活性随龄递减。同一龄期内 ,CAT活性在龄初时较低 ,然后迅速上升 ,在盛食期前后保持较高水平 ,将眠时迅速降至该龄最低点 ,就眠后又上升。化蛹后 ,CAT活性迅速升高 ,至蛹中期达峰值 ,随后下降直至羽化。不同性别间CAT活性雄性高于雌性。不同品种间CAT活性存在较大差异 ,抗病2号高于青6号 ,显著高于三里丝。接种柞蚕核型多角体病毒(AntheraeapernyiNuclearPolyhedrosisVirus,ApNPV)后 ,血液CAT活性先下降 ,然后迅速上升 ,3个品种均出现两个活性峰 ,抗病2号的两个活性峰分别出现在接种后第3天和第6天 ,青6号则出现在第4天和第6天 ,而三里丝出现在第5天和第7天 ,且抗病2号的活性峰高于青6号 ,显著高于三里丝。研究认为 ,柞蚕血液CAT活性与蚕的生长发育、体内代谢、抗病性密切相关 ,其活性大小可作为衡量品种抗病性强弱的一个生理指标。

家蚕抗菌肽对K562白血病细胞的杀伤作用及对细胞超微结构的影响

从家蚕蛹血淋巴中分离纯化的抗菌肽β组分与人髓样白血病细胞Ｋ５６２体外培养一段时间后，用ＭＴＴ法测定了抗菌肽对其杀伤作用，发现３６ｈ就可见到明显的杀伤效果。用扫描和透射电镜观察了细胞膜和细胞器的变化，发现细胞膜严重破损，线粒体空泡化，胞浆内容物外地，从而细胞死亡。

家蚕精巢中小热激蛋白在不同发育时期的蛋白质组学分析

【目的】研究家蚕不同发育时期精巢组织中小热激蛋白(sHSP)变化,为阐明其在家蚕精子发生中的重要作用提供理论参考。【方法】利用双向电泳技术建立家蚕5龄第5天、化蛹第1天和化蛾第1天3个时期的精巢电泳图谱,并用Imagemaster2D 6.0软件分析不同时期图谱中的差异蛋白,再用基质辅助激光解析离子质谱(MALDI-TOF-MS)对这些蛋白进行鉴定。【结果】鉴定出家蚕精巢中5个小热激蛋白,分别为sHSP23.7、sHSP20.8、sHSP 20.4、sHSP19.9和sHSP19.8,它们在化蛹第1天和化蛾第1天的蛋白合成量比5龄第5天显著降低。【结论】在家蚕精巢中,5龄第5天是形成有核精子的重要时期,有大量的微管蛋白(α微管蛋白、β微管蛋白),它是中心粒和纺锤体的重要组成成分,在减数分裂中有重要作用,这些小热激蛋白可能在有核精子形成时与微管蛋白相互作用,在促进鞭毛轴丝形成和鞭毛运动方面发挥重要作用。

氟化物对家蚕幼虫中肠(钙,镁)-三磷酸腺苷酶活性的影响

添食NaF抑制家蚕幼虫中肠(钙,镁)-三磷酸腺苷酶[(Ca^(2+),Mg^(2+))-ATPase]的活性。该抑制作用随添食NaF的浓度提高,或添食日数延长而增加,有累积效应。添食适量的CaCl_2或CaCl_2和Na_2ATP能降低NaF对(Ca^(2+),Mg^(2+))-ATPase活性的抑制。试验结果说明,应用Lee的(Ca^(2+),Mg^(2+))-ATPase动力学模型可获得满意的解释。氟化物抑制家蚕幼虫体内组织细胞膜上(Ca^(2+),Mg^(2+))-ATPasc活性,致使Ca^(2+)在蚕体内平衡失调,是家蚕氟中毒的一种重要的毒理学上的分子机制。

柞蚕卵黄原蛋白的合成与转运

本文用免疫扩散和脂蛋白染色方法证实柞蚕印黄原蛋白系雌性所特有.卵黄原蛋白的免疫学一致性也得到确定.柞蚕卵黄原蛋白在进人预蛹期开始出现于雌体血淋巴中.在整个蛹滞育期间.卵黄原蛋白含量约为血淋巴总蛋白的50%;在成虫发育期印黄原蛋白含量剧降,与此同时.卵黄蛋白含量则激增,约占卵黄总蛋白的80%.卵巢摘除导致血淋巴印黄原蛋白含量剧增.

家蚕感染微孢子虫其体内酶活性及血淋巴蛋白质含量的变化

家蚕感染微孢子虫其体内酶活性及血淋巴蛋白质含量的变化沈中元，徐莉，朱峰，黄可威（中国农业科学院蚕业研究所）谢伟东［１］曾报道蓖麻蚕被蓖麻蚕微孢子虫感染后，中肠碱性磷酸酶和谷丙转氨酶、脂肪体谷丙转氨酶活性以及血淋巴蛋白质浓度都受到不同程度的抑制。本试验...

家蚕丝素基因pFb2．9限制性片段长度多态性研究

本研究利用丝素Ｈ链基因的结构基因ｐＦｂ２．９为探针，对家蚕基因组ＤＮＡ进行了限制性片段长度多态性分析，并探讨了多态性与茧丝茸毛性状的关系。