基于Super-GBS简化基因组测序技术的柞蚕SNP位点挖掘

基于Super-GBS基因分型(super-genotyping-by-sequencing)技术开展柞蚕单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism,SNP)位点挖掘研究,旨在开发性状关联SNP分子标记,为柞蚕种质资源评价鉴定、遗传图谱构建、QTL定位提供数据支撑。以白体色小白蚕为母本、黄体色H04为父本,获得BC1M群体(110个)、F_(1)(3个)、P_(1)(1个)、P_(2)(1个)总计115个柞蚕材料,利用PstⅠ-HF/MspⅠ双酶切基因组构建Super-GBS文库并测序,使用BWA软件将过滤后的序列数据比对到柞蚕参考基因组,采用GATK软件开发SNP标记,使用SnpEff软件注释SNP位点及R语言分析遗传结构。测序共产生序列数据量为106.39 Gb,过滤后的平均读长为0.89 Gb,Q30测序质量值平均为90.11%,比对率平均为98.48%。共得到有效SNP位点141100个,主要位于基因间隔区、内含子区、基因下游、上游,其中C/T、A/G变异类型最多,转换与颠换的比例为1.296187∶1。SNP位点变异主要为同义突变和错义突变,产生修饰(MODIFIER)影响。主成分与聚类分析将115个样品分为4组(P_(1)、P_(2)、F_(1)、BC_(1)M),反映了样品的遗传背景及亲缘关系,群体遗传分化指数F_(ST)在0.0003777~0.8272间,群体遗传距离DR分布在0.0004~1.7556,F_(ST)与DR均表现出明显的遗传背景上的聚类。结果表明,Super-GBS技术能够获得大量柞蚕SNP位点信息,可用于SNP标记开发,且开发的SNP标记能够对115个样品的亲缘关系、体色演变进行解释,为今后柞蚕种质资源评价与鉴定、分子标记辅助育种工作奠定基础。

家蚕单羧酸转运蛋白基因家族的鉴定与表达模式分析

单羧酸转运蛋白(Monocarboxylate Transporter, MCT)是细胞膜上重要的跨膜转运蛋白,负责乳酸、丙酮酸等单羧酸类化合物的跨膜运输,参与机体代谢平衡调节。通过生物信息学方法对家蚕MCT家族基因成员进行了鉴定分析,并利用qRT-PCR技术对其表达模式进行了检测。结果显示,家蚕基因组中存在21个MCT家族基因,其编码氨基酸长度为438~791 aa,等电点为5.47~9.69。分析发现家蚕MCT家族基因分布于7条染色体上,其中在第5号、7号、13号和23号染色体上存在串联重复现象。该家族基因均编码含有6个以上的保守基序的蛋白质,其中MCT9蛋白含有12个跨膜结构域,与人类、果蝇、蜜蜂、赤拟谷盗、非洲爪蟾中的同源蛋白相似。聚类分析结果显示,21个成员中有15个与果蝇、蜜蜂、赤拟谷盗等昆虫中的MCT蛋白成员聚在一支,而人类只有4个MCT蛋白序列同昆虫聚在一起,其余10个单独聚为一支。进一步对这些基因在家蚕不同组织中的表达模式进行检测,结果显示,BmMCT5基因在家蚕5龄第3天幼虫的中肠组织特异性高量表达,BmMCT1、BmMCT7、BmMCT9-2、BmMCT14-2、BmMCT18基因在马氏管特异性高量表达,推测它们在家蚕的消化、排泄等基础代谢中发挥重要作用。研究结果为深入探讨家蚕MCT家族基因的生物学功能提供了理论依据和数据支持。

家蚕泛基因组研究成果及影响

泛基因组是动植物基因组研究的前沿,其特点是全面揭示物种的基因组多样性及其演化特征,包括前期技术不能很好识别的大片段结构变异等。泛基因组研究为系统解析表型多样性的形成和现代育种提供最全面的基因组信息,意义重大。2022年,本研究团队在世界上率先完成了家蚕泛基因组构建,一次性完成545个样本的三代长读长测序和1 078个样本的深度二代测序,取得一系列重要新发现。家蚕泛基因组为规模化高效解析家蚕重要性状遗传基础和有效开展分子育种奠定了坚实基础,推动蚕学研究进入新的历史阶段,进一步巩固了我国在本领域的引领地位,对蚕业科学的发展具有深远影响。近2年来,在泛基因组的有力支撑下,我们在家蚕的多组学数据库构建、W染色体完整序列解析、重要性状遗传基础解析等方面取得多项突破性进展,并大力推动泛基因组在基因组选择、分子设计育种等方面的应用。在家蚕泛基因组论文发表2周年之际,特撰文对该计划的研究成果、影响和相关后续工作进行了梳理及展望。

家蚕分子遗传操作技术研究进展

家蚕的分子遗传操作是鉴定基因功能、开展分子育种和种质材料创新等研究的重要平台技术,对于推动家蚕实验动物模式化,推进蚕业科学深度融入生命科学和促进传统蚕丝业高质量发展具有重要支撑作用。近年来,家蚕分子遗传操作技术取得了显著进展,包括转基因技术、基因组靶向编辑技术、时空特异性表达技术及其他辅助分子遗传操作技术均得到了广泛地应用,使得家蚕在农业、纺织业以及医学与材料科学等学科领域的基础和应用研究取得了一系列重要成果。本文综述了家蚕分子遗传操作技术的建立、发展现状和面临的问题,旨在为家蚕分子遗传操作技术在现代分子育种及生物材料开发等研究中的应用提供参考和指导。

家蚕及鳞翅目W染色体基因组及其起源

家蚕作为重要经济昆虫,基因组学研究已取得了一系列重要成果,最近家蚕W染色体基因组研究也获得了突破。昆虫中W染色体为鳞翅目特有,其起源长期是进化生物学研究的热点问题,随着近年基因组学研究的高速发展,关于鳞翅目W染色体起源问题也有了较为明晰的认识。本文重点介绍家蚕W染色体的研究历程和具体特征,并详细描述鳞翅目W染色体起源的研究进展,以期为家蚕性别调控和基于W染色体的分子育种研究,以及其他物种性染色体起源研究提供理论参考。

家蚕茧丝数量性状的分子遗传基础研究进展

家蚕品种选育的目标经济性状多属于典型的数量性状,其遗传基础研究是家蚕育种发展的重要基础。由于茧丝产量与品质直接关系到养蚕业和丝绸工业的效益,故近百年来茧质相关性状是家蚕数量遗传研究的重点。21世纪以来,随着基因组学的发展和功能基因研究体系的日臻完善,家蚕数量性状遗传研究进入一个新的阶段。近年来,家蚕茧丝产量和茧丝纤度主效基因的鉴定先后获突破,家蚕泛基因组计划研究成果为该领域的发展奠定了更加坚实的基础。本文着重对家蚕茧丝数量性状的分子遗传基础研究最新进展进行综述,以期为针对家蚕茧丝性状的分子改良提供参考。

家蚕泛基因组及多组学数据库SilkMeta

家蚕是重要的经济昆虫,也是研究鳞翅目的模式物种。本团队2022年公布的家蚕泛基因组数据集是育种和规模化高效解析家蚕基因型-表型关系的重要组学信息资源。本文介绍了以该数据集为主体,整合其他多组学数据构建而成的一个家蚕泛基因组和多组学数据库——SilkMeta(http://silkmeta.org.cn)。该数据库主要包括546个高质量基因组、1 082个样本的超过5 000万个基因组变异(SNP、InDel、SV)、1 168个转录组、非编码RNA、全长转录本、人工选择信号、遗传连锁图谱、群体结构、表型及常用生物信息分析工具等,为开展家蚕功能基因组学研究提供了一个可交互式访问、用户友好的组学数据共享分析平台。该平台在家蚕种质资源遗传评价、性状基因解析、精准分子改良和基因组选择育种及昆虫发育、适应性进化等研究方面将发挥重要的支撑作用。

家蚕突变基因的分子解析研究进展

家蚕属于完全驯化的昆虫,不仅是有超过5 000年养殖历史的重要经济动物,而且是遗传学等领域研究的优良材料。突变体是遗传研究的重要资源,在揭示遗传规律、基因功能、代谢通路、调控网络、分子机制等方面具有重要作用。家蚕突变类型丰富,已有超过600个孟德尔突变被描述。至今,已在分子水平鉴定了90余个突变基因,主要涉及卵色、体色、斑纹、体形、附肢、茧色及有关生理变异等。这些研究不乏具有独特而重要的科学发现,为蚕学、昆虫学及生命科学的发展作出了积极贡献。本文综述了家蚕突变基因的分子解析研究进展,以飨读者。

云南野桑蚕线粒体基因组特征及系统发育分析

[目的]明确云南野桑蚕资源的进化地位,为云南野桑蚕资源的利用与有效保护提供遗传背景资料和理论依据。[方法]对云南野桑蚕的mtDNA进行测序,并与已报道的鳞翅目昆虫mtDNA进行系统发育分析。[结果]云南野桑蚕mtDNA长度为15688 bp,包含37个基因和1个A+T丰富区,基因重叠区域共7处,基因间隔区域共21处,基因片段存在不同程度的插入和缺失。基因组拥有鳞翅目昆虫典型mtDNA的基因组成和顺序,A+T含量高达81.40%;基因组AT偏度为正值。系统发育分析发现:云南野桑蚕同家蚕和中国野桑蚕的亲缘关系较近。[结论]云南野桑蚕起源于中国北方野桑蚕。

家蚕AFLP连锁框架图谱的构建

利用改进的AFLP分子标记方法 ,对家蚕Bombyxmori回交一代BC1群体进行连锁图谱的构建。经 17组AFLP引物的选择性扩增 ,共得到 4 30个多态位点 ,卡方检验后有 2 5 3个为有效位点。利用Mapmaker Exp (Version 3 0b)软件作连锁分析 ,其中 16 3个标记分属 2 8个连锁群 ,连锁群标记数变化范围是 2～ 2 8个 ,平均每个连锁群标记数为 5 8个 ,该图覆盖的基因组长度为 2 998 9cM(图距单位 ) ,连锁群长度变化范围为 4 5～ 6 5 2 8cM ,连锁群的平均长度为 10 7 1cM ,平均图距为4 5～ 36 7cM。

利用精子介导法向蚕卵导入外源基因的研究

为建立家蚕转基因中切实可行、操作简便的外源基因导入方法 ,进行了精子介导法探索 ,以精子介导法的三种方式向家蚕导入所构建质粒 pFbGFP ,并通过PCR扩增和DNA印迹等手段 ,已连续两代从基因组DNA检测到导入外源基因GFP的存在 ,其中的一种导入方式到第二代阳性率约 30 % .结果表明该法可有效进行家蚕转基因的外源基因导入 .

结合SADF与RAPD标记构建家蚕连锁图

用 4 0个选择性扩增多态性引物和 137个随机性扩增多态性引物对家蚕BombyxmoriF2 群体进行分子标记的筛选。获得 5 4 4个符合遗传分离比的多态性位点 ,并用Mapmaker软件进行连锁分析。在最小LOD值为 4 ,最大重组值为 0 2条件下拆分连锁群 ,并对处于同一连锁群的位点进行合理排序 ,计算出位点间的重组值后转换为图谱距离 ,构建了一个家蚕的分子连锁图。

基于RAPD分析的中国野桑蚕和家蚕遗传多样性和系统发育关系研究

对具代表性的中国 11个地区的野桑蚕Bombyxmandarina进行了随机引物扩增多态性DNA (RAPD)分析 ,结果表明 :不同地区的野桑蚕的遗传距离较大 ,最大为 0 46 5 (安康 镇江 ) ,最小的也有 0 2 0 9(武汉 合肥 ) ;同一地区不同个体野桑蚕的遗传距离也较大 ,最大为 0 318,最小的为 0 144。它们均远大于家蚕B .mori品种内个体间的遗传距离 (最大为0 0 6 8、最小为 0 0 15 ) ,甚至超过了家蚕品种间的遗传距离 (最大为 0 2 5 8、最小为 0 197)。这表明中国野桑蚕是一个十分混杂的、遗传多样性非常丰富的群体。另外 ,在大多数情况下野桑蚕的遗传距离表现出与空间距离正相关。遗传距离和系统发育分析结果显示陕西一带的野桑蚕成分复杂 ,有重要的演化意义。

结合SSR标记和STS标记对家蚕无鳞毛翅基因的定位

家蚕突变表型无鳞毛翅(non-lepis wing,nlw)由隐性基因nlw控制。由于家蚕雌性不发生交换,文章采用有鳞毛翅品系P50和无鳞毛翅品系U06两个品系组配F1代及BC1回交群体,(U06×P50)×U06和U06×(U06×P50)分别记作BC1F和BC1M,根据已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱及已经发表的有关序列对nlw基因进行了连锁及定位分析。得到8个与nlw基因连锁的SSR(Simple sequence repeat)标记和1个STS(Sequence-tagged sites)标记。BC1F群中的所有正常翅个体均表现出与(U06×P50)F1相同的杂合带型;而所有无鳞毛个体带型与亲本U06一致,为纯合型。利用BC1M群体构建了关于nlw基因的遗传连锁图,连锁图的遗传距离为125.7cM,与nlw基因最近的引物为STS标记cash2p,图距为11.4cM。

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。

家蚕滞育生物钟蛋白质EA4基因的cDNA克隆和序列分析

家蚕滞育生物钟是依赖卵内酯酶A4(EA4)的倒计时型生物钟。EA4是具时间间隔测定酶(time interval measuring enzyme,TIME)功能的蛋白质。根据家蚕EA4测定的氨基酸序列,以第3天龄雌蛹脂肪体和卵巢总RNA为模板,利用简并引物RT-PCR方法,得到308 bp的部分ea4序列,其1-144 nt和145-308 nt分别与家蚕全基因组鸟枪序列(whole genome shotgun sequence,WGS)AADK01019126.1的5595-5738 nt及WGS AADK01014467.1的8636-8473 nt有95%和98%的一致性。根据获得的ea4基因片段序列,利用生物信息学方法和家蚕基因组数据预测了ea4基因的完整cDNA序列,设计特异引物,以雌蛹脂肪体和卵巢RNA为模板,进行RT-PCR得到完整的cDNA。ea4基因的cDNA全长519 bp,其中1-48 bp为信号肽序列,49-519 bp编码的氨基酸与蛋白质纯化后测序EA4部分的一致性为98%,C末端存在3个氨基酸的差异,其中第156位为新确定氨基酸。

家蚕核糖体18S RNA基因的序列分析及分子系统学研究

为研究家蚕18S DNA基因的特点及分子进化,以家蚕丝腺为材料提取家蚕基因组DNA,通过PCR扩增、测序鳞翅目家蚕(Bombyx mori)核糖体小亚基18S RNA基因(18S rDNA)的全序列,将该序列与等翅目、直翅目、衤责翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目、捻翅目、弹尾目、蜉蝣目各一种昆虫的18S rDNA进行了比较。用DNAstav软件分析并进行序列比对,结果表明,昆虫18S rDNA有4段序列较为保守,以18S rDNA比对的第2保守区段构建的分子系统发育树表明鳞翅目和双翅目、膜翅目、鞘翅目进化关系最近,等翅目、直翅目、衤责翅目进化上较为接近,捻翅目昆虫与弹尾目昆虫的亲缘关系较为接近,捻翅目在分类上应是一种古老的昆虫。

家蚕基因特异性CAPs标记获得及其分子系统学应用

选取家蚕attacin和alphaamylase基因序列,设计特异性引物,在家蚕品系P50、C108和子一代(F1)中扩增。分别采用4种不同的限制性内切酶对扩增产物酶切,最后每个基因都获得了一个CAPs分子标记。依据所得的两个CAPs分子标记对12个品系的家蚕遗传多样性进行了初步研究,构建了其分子系统树。

家蚕scaffold中新微卫星标记的获得与Dll基因的遗传连锁分析

在进行家蚕遗传连锁图谱的整合过程中,需要寻找两个作图群体中都有多态的共有标记,但这种共有标记数量较少。为此,利用已有的简单重复序列(SSR)与家蚕基因组进行比对,寻找到匹配的scaffold,再采用SS-RHunter1.3搜索其中的SSR区域,排除掉原有SSR序列,选择重复次数在6～23之间的微卫星区域设计引物,用BC1群体的亲本及F1进行多态性的筛选,选择有多态性的标记用7019×(F50B×7019)BC1群体进行基因型分析。结果显示:根据原家蚕第2连锁群上SSR位点新设计的邻近的7对引物中,有6对引物在BC1群体的亲本中有多态性,选择其中2个进行遗传连锁分析,作图结果与原有相应SSR标记的作图结果基本保持一致,其中根据S0207所在scaffold上开发的NS02071和NS02072之间的图距达到6.9 cM;根据家蚕大造和C108的回交一代初步定位的D ll基因的位置与后来在其所在scaffold上所设计的临近引物D ll1和D ll2的定位一致,且这两个标记在遗传连锁图上的图距为0.0 cM,表明这两个标记在遗传图上的位置重叠。由此,在较短的DNA区域内(在遗传连锁图上表现1个位点)便有多个SSR标记可供使用,将为定位家蚕重要经济性状基因、分子辅助育种及功能基因研究等提供更多有价值的信息。

家蚕不同茧色品种中cbp基因的结构和表达分析

类胡萝卜素结合蛋白(CBP)是唯一已被确认与家蚕黄色茧形成密切相关的主要蛋白质。文章选择12个有色茧和白茧蚕品种,调查了cbp基因结构、转录产物mRNA类型和丝腺类胡萝卜素紫外可见光吸收特征与其茧色的关系。结果表明:黄色茧蚕品种含有2种或3种cbp基因结构,同时转录具有CBP功能性的完整mRNA和缺少第2外显子的mRNA;绿茧品种间cbp基因结构存在差异,转录缺少第2外显子的mRNA;白茧蚕品种cbp基因只有1种结构,转录缺少第2外显子的mRNA。文章在黄茧品种中新发现的cbp基因第1内含子序列可能具有茧色品种特异性,家蚕黄茧品种丝腺的紫外可见吸收光谱特征显著区别于绿茧和白茧品种,cbp基因的结构和表达特征与家蚕茧色密切相关。