环境DNA技术发展及其在长江流域水生生态学领域的应用研究进展

长江流域鱼类资源丰富、生物多样性高。近年来,受人为干扰、环境变化等因素影响,鱼类资源急剧衰退,全面了解该流域水生生态学信息、进行长江大保护迫在眉睫。随着分子生物学技术的发展,环境DNA技术应运而生,其相比于传统调查方式更加高效、灵敏,应用领域更广;该技术的灵敏性使其非常适合于检测濒危物种、低密度物种入侵、瞬时和隐秘物种的存在,特别是当检测低密度物种的采样工作难以控制时,其敏感性、简便性和降低危害性的优势愈加显现出来。因此,该技术已被广泛应用于食品微生物、生物监测、群落生态学、古环境、保护生物学和生物入侵等领域的研究。介绍了环境DNA定义、发展史、研究方法与优劣势,在此基础上概述了其在长江流域水生生态学领域的应用研究进展,最后展望了环境DNA技术与环境RNA技术相结合的技术革新以及新一代测序手段、大数据及机器智能技术多技术结合助力该领域研究的前景,以期为长江流域持续性生态学监测提供借鉴和参考。

海藻硫酸多糖对铜绿假单胞菌感染的凡纳滨对虾抗氧化防御系统的影响

为了研究海藻硫酸多糖对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗氧化防御系统的影响,试验先采用磷钼络合物法测定5种海藻硫酸多糖(PE-Ⅰ、PE-Ⅱ、LJP-Ⅰ、LJP-Ⅱ、LJP-Ⅲ)总抗氧化活性[以二丁基羟基甲苯(BHT)为阳性对照],采用滤纸片法测定5种海藻硫酸多糖的抑菌圈直径,同时测定PA对凡纳滨对虾的半数致死浓度(LC_(50))。将健康的对虾随机分为3组,分别为模型组、试验组及对照组,每组20尾,对照组与模型组饲喂基础日粮,试验组饲喂添加抑菌效果最好的海藻硫酸多糖的基础日粮,饲喂14 d后模型组和试验组腹腔注射PA菌悬液(浓度为攻毒48 h后的LC_(50))30μL,对照组不做任何处理。攻毒后第24小时、48小时、7天、14天统计死亡率,收集攻毒48 h后各组对虾肠道内容物,计数PA的菌落总数。利用试剂盒测定血淋巴中血浆总蛋白(TP)质量浓度、酚氧化酶(PO)活性,肝胰腺组织中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化防御酶活性及丙二醛(MDA)含量;采集对虾肝胰腺组织用苏木精-伊红(H.E.)染色试剂盒染色进行组织病理学观察。结果表明:6种物质的总抗氧化活性大小为LJP-Ⅱ>LJP-Ⅰ>LJP-Ⅲ>BHT>PE-Ⅰ>PE-Ⅱ,其中LJP-Ⅱ、LJP-Ⅰ、LJP-Ⅲ总抗氧化活性显著高于BHT(P<0.05);海藻硫酸多糖LJP-Ⅱ在浓度150 mg/mL时对PA的抑菌圈直径最大,达到(15.05±0.04)mm,因此选取LJP-Ⅱ作为日粮添加物,研究其对PA感染的凡纳滨对虾抗氧化防御系统的影响。当攻毒剂量为30μL时,PA对凡纳滨对虾48 h的LC_(50)为7.96×10~(6)cfu/mL。与模型组相比,攻毒后第14天试验组的死亡率显著下降(P<0.05);血淋巴中TP质量浓度、PO活性,肝胰腺组织中SOD、CAT、GSH-Px活性均显著升高(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.05)。饲喂添加海藻硫酸多糖LJP-Ⅱ日粮可明显改善PA感染对虾肝胰腺组织、管腔和小管损伤程度,形态结构趋于正常。说明海藻硫酸多糖LJP-Ⅱ可显著提升抗氧化防御系统生化指标水平,减轻PA对肝胰腺组织的损伤。

鱼病检查流程及药物使用误区(三)

三、关于“药物滥用”的一些认识药物滥用主要包括超量、超期使用抗生素,多种抗生素联合使用,使用违禁药品如人用药、停用药、农药及未经允许使用的投入品等。在生产中,药物滥用的现象较普遍,是危害水产品质量安全的主要因素,也是渔业主管部门重点监控的“不法行为”之一。农业农村部提出了“水产养殖用药减量”等水产绿色健康养殖技术推广“五大行动”,在实施的过程中还存在着一些突出的矛盾。药物滥用的主要原因是病害高发.

鱼病检查流程及药物使用误区(四)

(三)药物滥用的后果1.致病菌耐药性增强长期、超量使用抗生素的直接后果就是致病菌的耐药性持续增强,养殖结束后不清塘或者清塘不彻底的情况越发普遍,导致致病菌的耐药性进一步增强。需要重点关注此问题的地区是海南、广东、四川,主要为罗非鱼、海鲈、加州鲈、斑点叉尾等品种。

鱼病检查流程及药物使用误区(二)

二、鳃丝镜检的标准化,鳃是鱼的主要呼吸器官,也是容易病变的组织,对鳃丝镜检是鱼体检查的重要工作之一。鳃丝镜检应做好两个标准化,分别是鳃丝水浸片制作的标准化和显微镜使用的标准化。(一)鳃丝水浸片制作步骤(鳃丝水浸片制作的标准化)首先准备好数片干净的载玻片、盖玻片;从图13中3部位处剪取适量鳃丝,放置于载玻片上.

鱼病检查流程及药物使用误区(一)

一、鱼体表的检查流程鱼体检查分为体表和体内的检查,可按照下列顺序进行:鳃丝的颜色(状况)→吻部→眼球→鳃盖→体表→鳍条→肛门→鳃丝(镜检)→内脏→消化道→血液。首先进行鱼体表的检查。(一)对鳃丝外观进行检查濒死鱼打捞后应第一时间打开鳃盖观察鳃丝颜色及鳃丝状态。

维氏气单胞菌拮抗菌株J2-2的筛选、鉴定与效果评价

为筛选对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)有潜在抑菌作用的菌株,本研究从湖北公安县泥鳅养殖池塘底泥中分离一株细菌J2-2,对其特性进行了研究,并对抑菌活性物质进行了初步分析。结果显示:菌株J2-2为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),具有抑菌广谱性,对米尔伊丽莎白菌(Elizabethella milieri)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)等6种水产病原菌的抑菌直径在9.6~29.5 mm。菌株J2-2的抑菌物质具有较好的酸碱稳定性、热稳定性和蛋白酶K处理的稳定性。电镜结果显示菌株J2-2的发酵产物对维氏气单胞菌的细胞膜结构具有破坏作用。通过LC-MC分析该拮抗细菌可产生至少15种不同的脂肽类化合物如杆菌霉素等。药敏试验结果显示,菌株J2-2对氨苄西林、青霉素具有耐药性,对克林霉素中度敏感,对大多数抗生素高度敏感。

患病异育银鲫中嗜冷黄杆菌的分离鉴定及组织病理学观察

为确定越冬期内江苏多地异育银鲫暴发性死亡的原因,本研究利用高通量测序比较了健康样品和患病样品的微生物群落多样性和结构组成的差异,分析了异育银鲫病害暴发过程中的细菌类型及特性。结果显示,在属水平上,患病样品中黄杆菌属丰度最高。在种水平上,患病样品中嗜冷黄杆菌的丰度最高,分别达到63.01%和61.31%,显著高于健康组的1.55%。根据微生物群落特征分析结果,从患病样品体表的病灶处分离出优势病原菌NJ01,通过细菌形态学、生理生化分析、16S rDNA序列比对确定NJ01菌株为嗜冷黄杆菌。人工感染NJ01菌株14 d后,1.7×10^(6)和1.7×10^(7) CFU/mL两组的死亡率达到100%,感染症状和自然发病症状一致。组织病理学观察发现,病鱼的肌细胞坏死,间质中充满了淋巴细胞;肝脏中细胞溶解坏死,细胞核消融;在脾脏中发现脾细胞散在坏死,伴随着充血的症状;肾小管上皮脱落,肾间质存在大量淋巴细胞。药物敏感实验结果显示,NJ01菌株对头孢西叮、头孢哌酮、庆大霉素和克拉霉素等敏感。研究表明,优势菌NJ01是致病菌,可通过扰乱机体正常的免疫和代谢功能导致疾病的发生。本研究首次报道了嗜冷黄杆菌在异育银鲫中的致病性,这将为大宗淡水鱼“越冬综合征”的药物防治及其致病机理研究提供参考依据。

寄生虫抗药性及其对水产动物寄生虫病药物防治的启示

抗药性是病原体在药物作用下发生生理变化和遗传变异而获得的能经受住药物毒性的一种能力。随着水产养殖集约化程度提高和药物长期大量使用,寄生虫抗药性越来越普遍和严重,不仅影响寄生虫病的防治效果,还带来环境污染和食品安全问题。文章通过对陆生动物抗寄生虫药物、寄生虫抗药性机制、抗药性主要测定方法、抗药性控制策略及水产动物寄生虫抗药性的研究现状进行综述,为我国水产养殖中寄生虫抗药性研究提供思路,同时为减缓寄生虫抗药性提供科学的防控策略。

两个奥利亚罗非鱼品系对无乳链球菌的耐受性研究

为探讨两个奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)品系对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的耐受性,研究以奥利亚罗非鱼埃及品系(AE品系)和“夏奥1号”(AX品系)为研究对象,人工腹腔注射无乳链球菌,并在感染后0、7h、24h、48h、72h、120h和168h采集罗非鱼血液和脾脏,比较感染后7d存活率差异,研究血清生化指标和脾脏促炎性细胞因子表达变化。结果显示,人工感染后AE奥利亚罗非鱼存活率显著高于AX奥利亚罗非鱼。感染后两种奥利亚罗非鱼血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、球蛋白(GLO)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和溶菌酶(LZM)含量在感染后都显著升高;甘油三酯(TG)和白蛋白/球蛋白(A/G)显著下降,呼吸暴发受抑制;且AE品系的血清GLO和SOD水平在感染后期显著高于AX品系。定量PCR结果显示两种奥利亚罗非鱼脾脏TNF-α、IL-1β和IL-6表达在感染后7h都显著升高,但AE品系在感染后期3种促炎性细胞因子的表达都显著低于AX品系。研究表明,AE品系对无乳链球菌的抗病力强于AX品系,在感染后期的抗氧化能力更强,炎症程度更轻,从而保持对无乳链球菌更大的耐受性。研究结果为培育抗链球菌病的奥尼罗非鱼提供抗性的亲本种质资源。

五品系尼罗罗非鱼对自然慢性低温胁迫的生理响应

为筛选出耐低温性能较好的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)品系,本研究以尼罗罗非鱼埃及品系(NE品系)、埃及尼罗抗逆品系(NER品系)、湘湖品系(NX品系)、新吉富(NNG品系)和吉富品系(NG品系)为研究对象,采用从最适生长温度28℃自然降温到死亡临界温度11℃的方法,分别测定它们在两个温度条件下血液生化和酶类指标的变化;当水温降到11℃后,连续观察一周,统计每种尼罗罗非鱼的存活率,绘制Kaplan-Meier曲线,比较5个品系尼罗罗非鱼的耐寒性能差异。结果显示,NER品系的存活率最高;NX品系和NER品系葡萄糖水平极显著升高,NER品系和NG品系总蛋白水平极显著降低,而白蛋白/球蛋白的值均没有显著性变化;超氧化物歧化酶、溶菌酶及乳酸脱氢酶活性均显著或极显著升高,但NER品系的乳酸脱氢酶活性升高程度最低;同时NX品系、NG品系、NE品系和NG品系的丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平均极显著增高,但NER品系的丙氨酸氨基转移酶水平没有显著性变化,其天门冬氨酸氨基转移酶水平只是显著增高。上述结果表明5个品系尼罗罗非鱼能一定程度抵御低温对机体带来的损伤,适应慢性自然降温,但NER品系存活率最高,肝功能和肌肉受损程度相对最小,在5个品系尼罗罗非鱼中耐寒性能最强。

鱼类白介素10的研究进展

白介素10(IL-10)是能够参与机体免疫的一种多功能细胞因子,由单核细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞分泌,在肿瘤、感染、免疫缺陷等多种疾病的发生发展过程中发挥着重要的调节作用。多种硬骨鱼IL-10基因被克隆表达,被证实具有免疫调节作用,目前已有不少关于鱼类IL-10的生物活性、作用机制、调节机制的研究。本文根据已有报道,从鱼类IL-10的基因结构、转录表达、来源与进化、生物学活性及功能、鱼类IL-10受体及信号通路等5个方面进行了综述,为鱼类IL-10的研究与应用提供依据。

鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用

为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行检测。结果表明:本研究中建立的实时荧光RAA检测方法的最佳反应温度为39℃,反应时间为20 min;实时荧光RAA检测方法的灵敏度、特异性及重复性评价显示,RAA检测AngHV的最低检测量为1×10^(2)copies/μL,可特异性地检测AngHV,与美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)、鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)和对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)均无交叉反应;实时荧光RAA检测方法的组内和组间变异系数均小于5%,表明实时荧光RAA检测方法灵敏度高、特异性强和重复性好;应用该方法对采集的25份临床样品进行检测显示,实时荧光RAA检测方法与qPCR方法的检出率一致,均为92%,高于普通PCR的检出率(76%)。研究表明,本研究中所建立的鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增RAA检测方法快速、灵敏、可靠、准确,可用于AngHV的临床快速检测和流行病学调查。

免疫磁珠富集水中鲤春病毒血症病毒的初步研究

为建立一种富集水中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的技术,本研究利用SVCV多克隆抗体制备免疫磁珠,通过对磁珠耦联抗体量的优化,确定该免疫磁珠有效富集SVCV的最低浓度,建立一种富集SVCV的免疫磁珠分离技术,并联合荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术对水中SVCV进行检测。结果显示,1 mg磁珠与75μg SVCV多克隆抗体耦联时,耦联的抗体量最大,耦联率为98.48%;耦联后的免疫磁珠对SVCV(200μL,浓度为1.54×10^(6)拷贝/μL)的富集效率最高为91.56%。以该多克隆抗体量制备的免疫磁珠富集10倍倍比稀释的SVCV(3.54×10^(6)拷贝/μL~3.54×10^(3)拷贝/μL),以确定其有效富集SVCV的最低浓度。结果显示,1 mg免疫磁珠能够使200μL病毒液(3.54×10^(3)拷贝/μL)富集率达到61.58%。表明该免疫磁珠能够有效富集SVCV。在免疫磁珠分离技术联合RT-qPCR技术检测水样品中SVCV(浓度约为1.16×10^(4)拷贝/μL)的结果显示,免疫磁珠组富集SVCV核酸量是裸磁珠组富集SVCV核酸量的1.77×10^(3)倍,是未处理组富集SVCV核酸量的1.68×10^(3)倍,免疫磁珠组富集SVCV均极显著高于裸磁珠组和未处理组(P<0.01),裸磁珠组富集的SVCV与未处理组则无显著差异(P>0.05)。本研究首次建立了一种能够有效富集水中SVCV的方法,为SVCV的监测提供了技术手段。

梨形环棱螺11个地理种群的几何形态学分析

为了摸清国内梨形环棱螺的种质资源现状,提供下一步选择育种的优质种质资源材料。通过采集江苏、安徽、上海、山东、湖南、广西、江西、贵州、湖北、浙江、广东典型分布省份的249个野生样本,对不同群体的每个个体自壳顶开始顺时针设置24个地标点,并在第11~12、12~13、13~14、14~15、15~11、15~16个地标点之间等距设置15个半地标点。基于地标点和半地标点设置结果进行普氏叠印,并删除超过上四分位的异常值。采用薄板样条曲线法进行缺失值检查,并利用主成分分析对形态学变异进行分析。对不同地理群体的普氏距离进行方差分析并根据不同群体之间的普氏距离进行聚类分析。梨形环棱螺11个地理种群外部形态的主要变异位置是壳顶及螺口上缘。不同地理种群形态特征变异的集中性较差,第1主成分和第2主成分不能显著区别区分不同的群体。11个群体大致可以划分为长江流域群体和长江以南群体两大类。不同群体的外形特征存在显著差异,这种外形差异可能与当地的生境有关。

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作便捷的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)检测方法,研究利用重组酶介导链置换核酸扩增技术(Recombinase-aid amplification,RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,构建了GCRV-Ⅱ病毒RAA结合CRISPR/Cas12a可视化“一步”快速检测方法。首先选择GCRV-Ⅱ毒株间序列保守,不同基因型GCRV间差异明显的s6基因(GQ896337)的保守区设计5对RAA候选引物和2对crRNA,合成并筛选出特异性引物和crRNA组合。其次测试反应的特异性、灵敏度和准确性。最后建立下层扩增相、上层检测相的“一步法”反应体系。该检测方法在37℃恒温下反应可检测出GCRV-Ⅱ,最低检测限为10^(2) copies/μL。对24份临床样本进行检测,该检测方法阳性检出率高于现行国标PCR法。研究建立的GCRV-Ⅱ检测方法操作便捷、特异性高、灵敏度好、可重复性强、与设备兼容性好、在蓝光灯下可通过肉眼判断检测结果。

河川沙塘鳢病原杀鲑气单胞菌致病性及感染后宿主免疫相关基因差异表达分析

为探明2021年3月常熟某养殖场河川沙塘鳢(Odontobutis potamophilus)疾病暴发的原因,本研究从患病鱼体内分离到优势菌株,通过形态观察、理化特性测定及gyrB基因同源性分析鉴定优势菌,同时通过人工感染试验、组织病理观察、毒力因子及毒力基因检测确定其致病性,并测定分离菌的耐药性和感染后河川沙塘鳢免疫相关基因表达变化。结果显示:引起河川沙塘鳢大量死亡的病原菌为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。代表菌株G2-4-1对河川沙塘鳢的LD 50为1.8×106 CFU/mL;该病原菌感染可引起河川沙塘鳢肝脏、脾脏、肾脏和鳃组织出现明显的变性、坏死和炎性细胞浸润;该菌株携带aer、hly、exu等毒力基因,且具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明胶酶和溶血素活性,但不具有DNA酶活性;耐药性分析发现,分离菌G2-4-1对青霉素G、氨苄西林、苯唑西林等8种药物耐药,对克拉霉素和大观霉素2种药物中介,对恩诺沙星、氟苯尼考等24类药物敏感;免疫相关基因表达分析显示,在感染初期MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD在鳃、脾脏和肾脏组织中都显著上调表达。

斑鳜肠道组织对嗜水气单胞菌感染早期的免疫响应

【目的】嗜水气单胞菌是危害斑鳜养殖生产的主要病原之一。研究斑鳜感染嗜水气单胞菌后,其肠道组织基因表达水平的变化,解析鱼体对细菌性感染的免疫应答分子机制,为防控淡水鱼类细菌性疾病提供依据。【方法】用嗜水气单胞菌感染斑鳜6 h后,利用Illumina Hiseq 6000测序平台对斑鳜肠道组织进行RNA-seq测序,并利用生物信息学方法对数据进行分析。【结果】感染组和未感染组斑鳜肠道组织存在1077个差异表达基因(DEGs),包括669个上调DEGs和408个下调DEGs。其中,与免疫相关的上调DEGs主要有基质金属蛋白酶3(MMP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-17F(IL-17F)、正五聚蛋白3(PTX3)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)含pyrin结构域蛋白6(NLRP6)、C型凝集素域家族4E(CLEC4E)、胆固醇-25-羟化酶(CH25H)和激活转录因子1(ATF1)等。基因本体(GO)富集分析显示,DEGs主要富集在免疫反应激活信号通路、免疫应答调节细胞表面受体信号通路、T细胞活化的正调控过程以及细胞修复和调节过程上。京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析显示,上调DEGs主要富集在多种疾病发生、发展过程和免疫代谢相关信号通路上。实时荧光定量PCR验证结果表明,7个随机选取的与免疫相关的DEGs的表达量与RNA-seq测序结果存在一致性。【结论】感染组与未感染组斑鳜肠道组织MMP3、IL-1β、PTX3、NLRP6、CLEC4E表达量的差异较为显著,可能是参与斑鳜肠炎发生的关键候选基因。

大口黑鲈幼鱼肝脏抗大口黑鲈弹状病毒应答的转录组分析

为探究大口黑鲈(Micropterus salmoides)对大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)的抗病反应和代谢调控网络,揭示其抗病的免疫分子机制并为后续大口黑鲈的分子生物学研究提供基础数据,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台,对MSRV感染的大口黑鲈易感组、抗病组和对照组的肝脏组织进行转录组测序分析,对所得基因的功能注释发现,被注释的差异基因主要与细胞过程、细胞、结合和催化活性等功能有关。KEGG通路富集分析结果显示,大口黑鲈肝脏组织在MSRV感染下高表达的差异基因富集在药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对外源性药物的代谢作用、蛋白酶体、抗坏血酸和醛酸盐代谢、脂肪酸降解等代谢相关通路;进一步筛选免疫相关基因进行通路分析发现,与抗MSRV免疫应答相关的通路主要为NOD样受体信号传导、C型凝集素受体信号、细胞溶质DNA传感途径、Toll样受体信号传导和RIG-I样受体信号传导等。最后,通过qRT-PCR验证了差异基因的变化趋势与转录组测序分析结果的一致性,证明了转录组数据的可靠性。获得的差异基因和调控通路可为大口黑鲈抗MSRV免疫的分子机制和疾病防控研究提供理论基础。

水生动物疾病快速检测技术应用情况研究

水生动物疾病快速检测技术能够实现现场筛查,减少带病流通和带病养殖等问题,是弥补实验室检测周期长、步骤复杂等短板的有效措施,对提升水生动物疾病防控能力、确保养殖生产安全具有重要意义。本研究通过数据调度和实地调研相结合的方式,重点就快速检测常用技术、产品基本情况、产品管理和应用情况、当前主要问题等进行分析,有针对性地提出推动优化审批流程、开展产品比对评价、健全完善标准技术、提升科技支撑能力等监管建议。