鲑鳟鱼病毒性疫病现场快速检测发展现状与展望

鲑鳟鱼是鲑科家族所有鱼类的总称,是典型的冷水性鱼类,具有很高的营养价值和经济价值[1]。联合国粮食及农业组织在2022年水产养殖的报告中指出,近几十年来,鲑科鱼特别是养殖的大西洋鲑(Salmo salar)一直是全球渔业和水产养殖产品贸易增长的主要贡献者之一[2]。中国养殖鲑鳟鱼类已有50余年的历史,有大西洋鲑、白点鲑(Salvelinus leucomaenis)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、哲罗鲑(Hucho taimen)等10余个养殖品种[1]。据统计,2022年我国鲑鳟鱼养殖总产量约4.03万t[3]。随着我国水产养殖规模的逐渐扩大和相关产业及贸易的发展,水生动物疫病带来的风险和负面影响也愈发显著。2021年,我国水产养殖因病害造成的经济损失约为539亿元[4]。水产养殖病害也成为现阶段威胁我国鲑鳟鱼产业发展的重要因素。

2种抗生素对大黄鱼肠道组织及紧密连接蛋白基因表达的影响

为探究盐酸多西环素和恩诺沙星对大黄鱼肠道结构及肠道紧密连接蛋白相关基因表达的影响,在水温16.80~22.50℃下,将体质量(41.57±1.63)g的大黄鱼饲养在直径1 m、水深1.25 m的圆形塑料水槽中,投喂剂量0、0.2、1.0、2.0 g/kg的药饵5~7 d,停药后1、5、15 d,观察肠道组织形态变化,测定紧密连接蛋白基因Claudin-7、ZO-1和Occludin的相对表达量。试验结果显示:大黄鱼摄食2种药物后,肠道均出现肠绒毛萎缩,组织空泡化等病变,随着给药剂量的增加和给药时间的延长,肠道组织损伤程度逐渐加深,紧密连接蛋白基因表达量持续降低;肠黏膜损伤在停药15 d后仍未恢复至对照组水平,药物剂量越高恢复程度越低;与对照组相比,2种药物高剂量组紧密连接蛋白基因表达量在停药15 d后仍显著低于对照组(P<0.05),其余组无显著差异(P>0.05)。试验结果表明,盐酸多西环素和恩诺沙星以剂量时间依赖方式损伤大黄鱼肠道组织,降低肠道通透性,药物剂量越高,恢复周期越长,在15 d后仍未完全恢复。

三种植物精油对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的抑菌效果及其毒力基因表达的影响

为研究百里香精油、牛至精油和肉桂精油对海水养殖经济鱼类主要致病菌美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(PDD)的抑菌作用,实验采用二倍稀释法分别测定3种植物精油对6株不同致病力PDD菌株的最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)。采用分光光度计法检测添加精油后6株PDD生长曲线的变化;以2株高致病性PDD菌株为研究对象,分析不同浓度精油对PDD毒力基因表达量及胞外产物(ECP)活性的影响;分析了3种精油存储不同时间后以及在金属离子影响下的药效稳定性。结果显示,3种精油对6株PDD菌株均具有较好的抑菌和杀菌作用,MIC为32~128μg/mL,MBC为64~192μg/mL;3种精油对2株高致病性PDD菌株的毒力基因表达及ECP的磷脂酶活性和溶血活性均有抑制作用,其中低浓度精油对PDD主要毒力基因的抑制作用最明显。3种精油于室温下避光存储35 d,对实验菌株的杀菌率均大于99%,显示其良好的药物稳定性;水环境中不同浓度Na^(+)、Mg^(2+)、Ca^(2+)、K^(+)等对3种精油的杀菌效果无显著影响。研究表明,3种精油均适宜开发为防治水产动物细菌性疾病的新型渔药或饲料添加剂。本研究可为拓展芳香类植物精油在水产疾病防控上的应用提供借鉴与参考。

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.salmonicida)和杀日本鲑亚种(A.salmonicida subsp.masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5μL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64℃,10μmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/μL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5μL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检测方法,该检测方法为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的流行病调查和快速诊断提供了支撑。

聚维酮碘对池塘消毒效果研究

虽然聚维酮碘应用广泛,但是目前尚未有试验数据支撑聚维酮碘消毒养殖池塘水体时对水体的水层及其细菌作用时间的影响。因此,本试验拟通过对消毒前后的养殖池塘细菌进行计数,通过具体的试验数据明确聚维酮碘对养殖池塘水体的细菌具有杀菌作用或者抑菌作用。为此,本试验在正常养殖的塘中进行了聚维酮碘的杀菌试验,并对杀菌时间、水层对池塘养殖水体中的总菌、潜在病原菌气单胞菌和弧菌进行了计数.

大黄鱼肿大细胞病毒不同毒株的细胞培养及主要衣壳蛋白基因比较

为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法,明确其分类地位,用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料(FD201807和SA201808)肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系(mandarin fish fry cell line-1,MFF-1)并连续传代,从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA,克隆病毒主要衣壳蛋白基因(mcp),测序后与NCBI GenBank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示,病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变,细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强;感染时间越长脱壁细胞越多,同时培养液中的颗粒增加;透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130~150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短,第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d,第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7~8 d。mcp序列比对和聚类分析发现,SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异,二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(largeyellowcroakeriridovirus,LYCIV)LYCIVZhoushan(GenBank:MW139932.1)和花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV)(GenBank:MH577517.1)相近。15株从大黄鱼病料检出的肿大细胞病毒中,12株的mcp序列与SA201808株聚类;3株与FD201807聚类。本研究利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒,揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异,为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。

二氧化氯对水产动物致病菌的杀菌效果及安全性评价

为了评价二氧化氯在水产养殖中应用的安全性 ,达到合理用药的目的 ,对二氧化氯的杀菌效果、急性毒性等方面进行了一系列的试验。结果表明二氧化氯对鱼类致病菌具有很好的杀菌效果 ,对鲢、草鱼、鲤、鲫、大口鲶及中华鳖等水产养殖动物安全。

敌百虫对虾池生物的毒性

研究了敌百虫对青岛大扁藻、三角褐指藻、球等鞭金藻和海洋原甲藻等4种海洋微藻及天津厚蟹、脊尾白虾和克氏纺锤水蚤等3种野生甲壳类 ,以及中国对虾、缢蛏和台湾红罗非鱼等3种养殖生物的毒性。研究结果表明 :敌百虫在低浓度下对海洋微藻的生长没有明显影响 ,在一定浓度范围内甚至有促进作用 ,但超过一定浓度范围能完全抑制海洋微藻的生长。各种海洋微藻对敌百虫的敏感性不同。对3种野生甲壳类的半致死浓度分别为 :天津厚蟹LTD50(96h)为1.25×10-6;脊尾白虾LTD50(12h)为0.05×10-6;克氏纺锤水蚤LTD50 (48h)为0.063×10-6。敌百虫对3种养殖生物的半致死浓度分别为 :中国对虾LTD50(48h)为0.060×10-6;缢蛏LTD50(72h)为18.79×10-6;台湾红罗非鱼LTD50(72h)为36.35×10-6。文中还对敌百虫作为对虾病毒病预防药物的价值进行了探讨。

噬菌体PZL-Ah1的生物学特性及其治疗嗜水气单胞菌感染的效果评价

噬菌体利用细菌作为天然宿主,可以特异性杀死宿主菌,尤其是治疗耐药菌株的感染有着巨大潜力。为了研究嗜水气单胞菌(A.hydrophila)噬菌体PZL-Ah1的生物学特性,评价其治疗A.hydrophila感染的效果,本研究以耐药性A.hydrophila(A-L138)作为宿主菌,从污水中分离获得了噬菌体PZL-Ah1,并重点研究了PZLAh1的生物学特性和PZL-Ah1治疗A.hydrophila感染的效果。电镜观察可见该噬菌体属于有尾病毒目(Caudovirales)短尾噬菌体科(Podoviridae)。将噬菌体和宿主菌以不同比例混合时,得出PZL-Ah1的最佳感染复数(MOI)为0.1,平板点滴法试验表明PZL-Ah1可以裂解7株气单胞菌,其中包括4株A.hydrophila和3株维氏气单胞菌(A.veronii)。结晶紫染色结果显示,PZL-Ah1对A.hydrophila已经形成的生物被膜(BF)有较强的破坏作用。该噬菌体潜伏期和爆发期均为20 min,PZL-Ah1在温度为20℃~40℃均有较好的活性,在pH4~pH10范围内非常稳定,对鲫鱼腹腔注射治疗剂量噬菌体PZL-Ah1的安全性试验显示,7 d观察期内,实验组鲫鱼均未出现游动缓慢、食欲减退、体质量下降等临床症状及死亡。治疗试验结果显示,宿主菌(A-L138)对鲫鱼最佳感染剂量为106cfu/尾,感染鲫鱼经PZL-Ah1治疗后存活率为100%,对照组全部死亡。结果表明PZL-Ah1有严格的宿主特异性,裂解能力强,能够显著提高感染A.hydrophila鲫鱼的存活率。本研究分离的噬菌体PZL-Ah1具有较高的裂解效率,能够有效清除宿主菌形成的BF;为噬菌体制剂治疗A.hydrophila感染提供了重要实验依据,也为噬菌体疗法的临床应用奠定了基础。

日本医蛭水肿病病原分离鉴定及敏感性试验

为了明确日本医蛭(Hirudo nipponia)发病的病因并筛选有效的治疗药物为新渔药研究提供新思路,采用生理生化特性分析、16S rRNA基因测序和构建系统发育树对细菌进行了鉴定;并通过药敏试验、最小抑菌浓度测定和棋盘式微量稀释试验测定了该病原菌对药物的敏感性和抗菌药物与天然化合物的联合抑菌作用。结果显示:该病原菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),对妥布霉素、氟苯尼考等药物敏感,对头孢拉定、阿莫西林、恩诺沙星等药物耐药。联合药敏试验发现恩诺沙星与异土木香内酯联合使用具有协同抑菌作用(FICI <0. 5)。结果表明,分离株JZ15062301是对日本医蛭具有致病性的多重耐药维氏气单胞菌,异土木香内酯和恩诺沙星联合用药为耐药性维氏气单胞菌的控制提供了新的思路。

杂交鲶维氏气单胞菌鉴定及联合药敏试验研究

为对从四川眉山发病的杂交鲶分离的一株优势菌株(MS20150925)进行鉴定,并筛选敏感药物,本研究首先经人工感染试验显示该菌株可以导致杂交鲶的皮肤溃疡和脏器出血,与采集标本症状一致;根据该菌株的生理生化特性和16S rRNA基因测序与系统发育树构建对该菌株进行了鉴定;分别采用平板扩散法和二倍稀释法测定了抗生素和中药单体对该菌株的体外抑菌活性,并研究了抗生素与天然化合物的联合抑菌作用。结果显示,该菌株为维氏气单胞菌,其对氟苯尼考、恩诺沙星、磺胺异噁唑等药物较为敏感,对多西环素、新霉素、诺氟沙星、青霉素、阿奇霉素等药物耐药。联合药敏试验结果显示,新霉素、多西环素与二氢杨梅素具有协同抑菌作用(FICI<0.5)。以上研究表明,分离株MS20150925对杂交鲶具有致病性且为多重耐药菌,二氢杨梅素与新霉素或多西环素的复方制剂可以作为治疗该病的候选药物,联合用药可以降低抗生素的治疗剂量,对于降低抗生素残留和延长药物使用寿命有重要意义。

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea breamiridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Pri mer Express3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.1841gX+40.270,相关系数R2=0.9969。熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃。该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性。利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析。

鱼用哈维氏弧菌亚单位缓释微球口服疫苗的免疫效果初探

通过复乳化-溶剂挥发技术,采用生物可降解性高分子材料聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)包裹哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,Vh)重组外膜蛋白OmpK,制成缓释微球颗粒疫苗,口服免疫鲫鱼,测定其血清的凝集效价和相对免疫保护率.结果表明,制备的缓释微球疫苗直径＜10μm,且以粒径＜5μm的微球居多;微球中重组外膜蛋白OmpK包裹率达78.3%.鲫鱼口服微球疫苗2周后,血清抗体水平持续上升,第5周血清凝集抗体效价可达到与佐剂注射组相当的水平(28),抗体高峰期比注射组长1～2周,且降低较慢;免疫4周后用活菌攻击,口服组具有69.4%的相对免疫保护率,而对照组死亡率高达98%.结论为采用可生物降解的缓释微球作为鱼类亚单位口服疫苗的载体系统是可行的.

一株具水霉抑制特性的芽孢杆菌筛选及其分子生物学鉴定

以水霉菌(Saprolegnia ferax)的生物防治为切入点,通过对本实验室保存的9株芽孢杆菌(Bacillus spp.)与水霉菌JL菌株进行对峙拮抗试验,筛选出具有明显抑制水霉菌JL菌株的芽孢杆菌BA1(P<0.05)。经进一步测定菌株BA1对不同来源水霉菌株试验,结果显示菌株BA1对水霉菌株6#、10#、S2也有明显的抑制作用(P<0.05)。通过测定菌株BA1的16 S rDNA,利用BLAST软件进行同源性比对,发现与蜡样芽孢杆菌的同源性在99%以上。由此推测,菌株BA1为蜡样芽孢杆菌菌株,且具有明显抑制水霉菌作用,可以作为水产养殖上水霉病防治的生物制剂使用。

呋喃唑酮对饲养水及草鱼体表粘液中菌群的影响

对饲养水中泼洒不同浓度（０．２ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ和１．０ｍｇ／Ｌ）的呋喃唑酮后，研究了饲养水及草鱼体表粘液中好氧与兼性厌氧细菌的数量及组成变化。结果表明：用药前，饲养水及粘液中的菌群主要有Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ和Ｂａｃｉｌｕｓ，此外，水体中还检测到Ｍｉｃｒｏｃｏｃｕｓ和Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ。水体及粘液中的细菌数量在用药后１２ｈ或２４ｈ时降至最低，在４８ｈ或９６ｈ时恢复到原来的水平。用药后，水体及粘液中的优势菌群未发生改变，但Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ的比例显著增加，Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｖｉｂｒｉｏ和Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ明显减少，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ和Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ则未能检测到，其他各类群的比例也有一定的变化。菌群的变化速度与用药浓度有关。

微生态制剂A对罗非鱼生长及消化酶活性的影响

以奥尼罗非鱼为试验对象,考察以枯草芽孢杆菌和紫色非硫光合菌为主要成分制成的微生态制剂A对罗非鱼生长及消化酶活性的影响.结果显示:与对照组相比,饲料中添加微生态制剂A能够降低罗非鱼养殖饵料系数16.91%,体质量提高9.78%;能显著或非常显著地提高罗非鱼胃、肠道和肝脏中的淀粉酶活性(P<0.05或P<0.01)和脂肪酶活性(P<0.05或P<0.01);能够显著提高罗非鱼肠道胰蛋白酶的活性(P<0.05).可见,微生态制剂A有降低罗非鱼养殖饵料系数和促进生长的作用.

恩诺沙星在日本鳗鲡体内残留消除规律研究

采用高效液相色谱法检测日本鳗鲡肌肉、血清、肠、鳃和肝脏组织中恩诺沙星及其代谢物环丙沙星的残留。方法的日内和日间变异系数分别为1.86%和2.53%,标准添加回收率为（95±6）%;最低测量限为1.0μg/kg。用现场试验方法研究恩诺沙星在鳗鱼体内的代谢残留规律。对约50 g鳗鱼按9 mg/kg鱼体重每天给药2次,连续投喂7 d。给药期间鳗鱼体内的药物含量呈锯齿状上升,停药60 d后鳗鱼肠、鳃和肝脏组织中药物即下降至1~5μg/kg。肌肉和血清中药物残留到90 d,分别消除至3μg/kg和4μg/kg。所测组织的药物残留至停药120 d后降到检测限以下。故鳗鱼的停药期不应低于120 d。

绿色合成纳米银材料的制备及其对水产病原菌的抗菌效果测定

近年来随着水产养殖规模不断扩大,渔药安全问题备受重视。为积极寻找抗生素替代品,本研究采用银杏叶提取物和硝酸银反应合成纳米银材料,并通过紫外-可见光全波段扫描、透射电镜以及X射线衍射对其结构表征进行鉴定。在此基础上,以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌,以及水产病原菌迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌为测试对象,采用杯碟法、常量肉汤稀释法以及抑菌动力学实验测定合成的纳米银抗菌效果。结果显示,在波长450 nm处有纳米银等离子共振体形成的吸收峰;透射电镜观察到纳米银颗粒平均直径小于10 nm;X射线衍射图谱验证了金属银的生成;本研究所合成的纳米银材料对4种病原菌均有良好的抗菌效果。研究表明,采用银杏叶绿色合成纳米银,不仅方便、快捷,而且成本低廉、环境友好,在水产病害防控中具有良好的前景。

中西药物对鱼类病原菌的抑菌作用

本试验用３种中药配方和８种抗菌素及化学药物分别对５种海水海贝类病原菌和５种淡水鱼类病原菌进行了抑菌试验研究．结果表明，中药配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对副溶血性弧菌具有较强的抑菌作用．中药Ⅰ对５种淡水鱼类病原菌均有一定的抑菌作用．中西药结合配制的９种药物时鱼贝类病原菌具有很强的抑菌和杀菌作用．