草鱼出血病病毒的研究进展

根据80－90年代中国关于草鱼出血病病毒研究的进展，就草鱼出血病病毒的发现、形态结构特征、理化特性、基因组结构及其所编码的多肽、基因组的转录和翻译过程，病毒的繁殖动态、体外细胞培养特性，病毒对鱼体的致病机理和宿主范围，草鱼出血病的诊断和防治等问题进行综合评述，总结概括了草鱼出血病病毒的研究现状以及研究中需要亟待解决的问题，并提出该领域以后的重点研究方向。

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果

本文报道经筛选的ＧＣＨＶ－８４１毒株在草鱼吻端成纤维细胞系（ＰＳＦ）中进行适应性培养，弱毒驯化，细胞培养弱毒疫苗的制备，安全性观察，不同稀释度和剂量的免疫保护率测定及保存试验。ＧＣＨＶ－８４１毒株在ＰＳＦ细胞中继代驯化至５３代达到减毒目的。筛选得５３～５９代作毒种制备的细胞弱毒疫苗使用安全。用稀释１０～１０４倍的疫苗，０．１～０．３毫升／尾剂量注射草鱼，其免疫保护率均在８５％以上。生产上使用疫苗的适宜浓度和剂量是稀释１０２倍和０．２毫升／尾。冻干疫苗宜保存于４℃以下。较合适的保存期是６个月（４℃）和１８个月（－２０℃）。

亚硒酸钠对四氯化碳损伤草鱼肝原代细胞与肝组织的保护作用

不同浓度四氯化碳（ＣＣｌ４）对草鱼肝原代细胞的损伤实验中，ＣＣｌ４浓度为１０μｌ／ｍｌ可引起细胞血清中丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）、天门冬氨酸氨基转移酶（ＡＳＴ）、乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）逸出量与细胞破损率显著增高，培养液中添加亚硒酸钠（Ｎａ２ＳｅＯ３）０．２μｇ／ｍｌ，则可降低ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ的逸出量，减轻细胞破损程度。Ｎａ２ＳｅＯ３保护实验中，Ｎａ２ＳｅＯ２＋ＣＣｌ４组预先腹腔注射（ｉｐ）０．１ｍｇ／ｋｇ．ｂｗ连续三日，末次ｉｐＣＣｌ４混合液１ｍｌ／ｋｇ．ｂｗ，２４ｈ内肝组织超氧物歧化酶（ＳＯＤ）相对活性比ＣＣｌ４组提高达９１．５％，第七日仍提高达５４．５％，与对照组的水平基本接近；血清中丙氨酸氨基转氨酶（ＡＬＴ）水平逐渐降低。本实验还观察到Ｎａ２ＳｅＯ３可引起肝脂质过氧化物显著降低，肝微粒体蛋白含量与细胞色素Ｐ—４５０活性升高；组织切片观察显示肝组织损伤程度减轻，７２ｈ后细胞核增多。表明Ｎａ２ＳｅＯ３可提高草鱼肝清除自由基能力，增强肝脏解毒功能。

浙江省血吸虫病疫情纵向监测及防治策略探讨

分析1996～2009年浙江省血吸虫病疫情监测情况,为制定防治策略提供科学依据.采用5 m系统抽样结合环境抽查2框方法查螺,压碎镜检法检查钉螺感染情况,并采用土埋结合药物方法灭螺.对当地人群和家畜进行血清学筛查后,再用尼龙绢集卵孵化法进行病原学检查,阳性人（畜）进行吡喹酮治疗.建立血吸虫病防治工作年报数据库并进行分析.结果显示1996～2009年全省累计查螺投工2.10×106工,查螺面积1.04×109m2,查出有螺乡1 221个,有螺村4 171个,螺点21 344个,有螺面积1.13×107m2 累计解剖钉螺985 205只,未查获感染性钉螺 灭螺投工8.79×105工,灭螺面积1.06×107m2,扩大灭螺面积1.79×108m2.1996～2009年全省累计血吸虫查病2 929 195人（次）,其中血清学查病2 584 928人（次）,查出阳性者60 549人（次）,血清学阳性率为2.34%.粪检44 589人（次）,未查出内源性血吸虫病人,但发现输入性血吸虫病人174例.耕牛查病93 342头,均为阴性.结果标明,浙江省血吸虫病疫情稳定,但重新传播的流行因素仍然存在,今后应采取＂查灭残存钉螺和防控外来传染源为主的综合性防治策略＂.

病毒诱导草鱼产生干扰素活性因子的研究

采用细胞病变抑制法测定了病毒诱导前后草鱼外周血中干扰素的活性变化。结果表明，经病毒诱导的草鱼血清中出现明显的干扰素抗病毒活性，２５℃水温下诱导３天，其活性达到高峰，在草鱼细胞中的效价（Ｌｏｇ２ＣＰＥＩ５０／０．１ｍｌ）可达１１．０８±０．５８以上。草鱼血清干扰素具有１０００００ｇ离心不沉降，耐热，在ｐＨ２．０－１０．０范围内活性稳定，抗ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ，对胰蛋白酶、糖苷酶和ＮａＩＯ４敏感等性质，其抗病毒作用依赖于细胞内ＲＮＡ和蛋白质的合成。在鱼类细胞中具有抑制不同病毒的能力，但在人、哺乳类、鸟类和贝类等细胞中无抗病毒作用，表现出抗病毒的广谱性和相对的种属特异性。

草鱼出血病的组织病理研究

草鱼出血病提由呼肠孤病毒引起的一种急性传染病。病鱼全身出血,鱼的红细胞、白细胞及血红蛋白都明显地低于健康鱼。病毒侵袭草鱼后,小血管的内皮广泛受损,引起弥漫性血管内凝血,从而大量消耗了血液中的凝血因子,引起广泛性出血。由于循环血量减少和小血管阻塞,导致大多数组织和器官缺氧而变性和坏死;尤其是造血组织的坏死,更加速病鱼死亡。此外,还在草鱼血液申首次发现嗜碱粒细胞,查明了草鱼出血病同草鱼肠炎病的肠道组织病变之间的差异。

草鱼出血病细胞培养灭活疫苗旋转瓶法大规模生产工艺

Ｃａｒｅｌ氏瓶静置培养草鱼ＣＩＫ细胞，细胞２～３ｄ内长成单层，细胞单层均匀而稳定；旋转瓶培养，细胞７ｄ左右长成单层，细胞单层面积大，病毒培养产量高。２种方式所培养病毒的ＴＣＩＤ５０／ｍｌ值稳定在６．０左右。０．１％福尔马林４℃条件下灭活病毒材料１７ｄ制备疫苗，疫苗性能稳定，安全性好。疫苗效力检验结果表明，注射免疫１０ｄ和浸泡免疫１０ｄ后，免疫鱼体内血清中和抗体效价分别为１０７．９±１１．０（３）和６８．５±９．９（３），免疫保护力分别为（７７．１±８．９）％（３）和（７３．９±８．３）％（３），与对照组相比差异显著。本研究建立了草鱼细胞培养灭活疫苗大规模生产工艺流程，进行了较大规模的疫苗生产和生产性免疫试验，免疫草鱼成活率平均达到８５％以上。

草鱼出血病鱼主要器官组织的超薄切片观察及感染力的比较

草鱼出血病是一种严重的病毒性疾病,它会引起草鱼大批死亡。已有报告指出,在病鱼肾组织的超薄切片中观察到病毒粒子的存在,并认为肾脏是草鱼出血病病毒侵袭是严重的器官。在制备草鱼出血病组织疫苗时仅取病鱼的肝、脾、肾和肌肉组织,肠道组织往往弃之不用。

池塘中亚硝酸盐对草鱼种的毒害及防治

亚硝酸盐对草鱼种有很高的毒性,特别是水温超过30℃以上时。它主要是诱导草鱼血液中的血红蛋白转变为高铁血红蛋白,高铁血红蛋白超过血红蛋白总量的23.0％时,容易诱发草鱼出血病。随着草鱼血液中高铁血红蛋白的增高,红细胞数量和血红蛋白含量逐渐减少。池中亚硝酸盐氮含量到0.099±0.03毫克/升时,草鱼会出现出血病。清除水中亚硝酸盐氮的方法是在池塘中施加次氯酸钠,亚硝酸盐氮超过0.15毫克/升时,最好在池塘中先施加熟石灰,然后施加次氯酸钠,且以分次施用,效果较好。

葡萄球菌A蛋白协同凝集试验快速检测草鱼出血病病毒

本文报道葡萄球菌 A蛋白协同凝集(SPA COA)快速检测草鱼出血病病毒的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织检测的初步结果。并对该方法进行了特异性和敏感性考核以及凝集物的电镜观察。该方法快速、特异、设备简单,适合基层单位检测草鱼出血病病毒,并有可能作为草鱼出血病疫苗质量鉴定的指标之一。

细胞生物反应器大规模培养草鱼细胞和病毒

应用细胞生物反应器微载体悬浮培养法,对草鱼胚胎细胞 CP-80 进行大规模培养,同时增殖草鱼出血病病毒。细胞经培养6天后,细胞量可达到8.4×10~6cells/ml,较始接量(2×10~5cells/ml)提高了41倍。接入草鱼出血病病毒后,经5天培养增殖,毒力达到8.0LgTCID_(50)/0.1ml,较始接毒力(3.75LgTCID_(50)/0.1ml)增加了4.25个对数值。

草鱼干扰素诱生条件的研究

草鱼干扰素 (IFN)诱生条件与规律的研究结果显示 ,病毒侵染草鱼后能迅速诱导IFN的合成 ,2 4h即可在血清中检测到IFN活性 ,3d后活性达到高峰。草鱼IFN的合成受温度、病毒种类、病毒剂量、鱼体营养状况等因素的影响。 2 5℃水温下诱生的IFN活性明显高于 15℃和 8℃。RNA病毒的诱生能力高于DNA病毒 ,其中以双链RNA病毒GCHV的诱生能力最强。在急性致死剂量以下提高病毒感染剂量以及维持鱼体的正常营养状况 ,有利于提高IFN的产量。用适量IFN或灭活GCHV预注射草鱼 ,作起动或预诱导处理 ,能显著促进IFN的诱生。病毒活性、鱼龄大小对IFN的诱生无显著影响。

穿心莲对草鱼血液吞噬细胞吞噬活性的影响

利用体外试管法测定摄食穿心莲药饵的草鱼在不同时刻血液吞噬细胞的正常吞噬活性。结果表明 ,穿心莲水煎剂对草鱼血液吞噬细胞的吞噬活性没有显著性影响 (P >0 .0 5 )。

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的最小免疫量、免疫期和保存期

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗对草鱼的最小免疫量为稀释１０３倍、０２ｍｌ／尾。免疫产生期为疫苗注射后的第２天；免疫保护期达１５个月。弱毒疫苗的保存期为－３０℃３０个月、－１０℃２４个月、４℃８个月、１５—２０℃１个月左右。

氯氰菊酯和有机磷农药对草鱼鱼种急性及联合毒性

氯氰菊酯对草鱼24、48、72、96h半致死质量浓度分别为32.82、9.92、8.12、6.51μg/L,安全质量浓度为0.65μg/L;三唑磷对草鱼24、48、72、96h半致死质量浓度分别为1.93、1.73、1.601、.50 mg/L,安全质量浓度为0.15 mg/L;辛硫磷对草鱼24、48、729、6 h半致死质量浓度分别为15.34、8.88、6.12、5.74 mg/L,安全质量浓度为0.57 mg/L。急性毒性顺序是:氯氰菊酯>三唑磷>辛硫磷。氯氰菊酯与三唑磷混配在24、48、72、96 h时毒性表现为拮抗;氯氰菊酯与辛硫磷混配在24 h时表现为协同,48、72、96 h时表现为拮抗;这2种农药对草鱼的联合毒性作用,都显示出随时间的延长AI逐渐增大,拮抗逐渐增强。

草鱼呼肠孤病毒的研究进展

草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成,编码11种结构多肽。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶,在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以及预防治疗等方面的研究成果,提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性,初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。

草鱼miR-1260对鱼淋巴囊肿病毒中国株复制的调控作用

【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-1260(cid-miR-1260),分析cid-miR-1260在鱼淋巴囊肿病毒中国株(Lymphocystis disease virus China,LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的时序表达特性,揭示cid-miR-1260对其靶基因znf574和LCDV-cn复制的调控作用。【方法】制备LCDV-cn感染的GCO细胞,通过茎环RT-PCR和测序鉴定cid-miR-1260;采用定量PCR检测cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中的时序表达;应用生物信息学方法预测cid-miR-1260的靶基因,并用双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;通过转染cid-miR-1260 mimic和cid-miR-1260 inhibitor使cid-miR-1260过表达和抑制表达,并用定量PCR检测cid-miR-1260、靶基因znf574、LCDV-cn mcp基因的表达;应用Reed-Muench法测定LCDV-cn在GCO细胞中的滴度。【结果】cid-miR-1260与其他已知miR-1260仅有一个碱基差异,且cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中呈先上升后下降的表达变化,72 h时表达量最高(P<0.05);生物信息学分析表明,znf574为cid-miR-1260的靶基因;重组质粒pmirGLO-znf574-WT与cid-miR-1260 mimic共转染后,荧光素酶活性显著降低(P<0.05),证实znf574为cid-miR-1260的靶基因;cid-miR-1260过表达后,靶基因znf574的表达显著下降(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著上升(P<0.05);抑制cid-miR-1260表达后,靶基因znf574的表达量显著上升(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达量和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著下降(P<0.05)。【结论】LCDV-cn感染GCO细胞后,cid-miR-1260的表达显著上调;在LCDV-cn感染中,cid-miR-1260对其靶基因znf574的表达起负调控作用,且cid-miR-1260表达与LCDV-cn的复制呈正相关,起促LCDV-cn感染作用,而锌指蛋白ZNF574具有抗LCDV-cn作用。本研究为淋巴囊肿病的防治提供新的依据和思路。

草鱼传染性疾病的环境因素及防治对策

对发生草鱼传染性疾病与未发病池塘的水质比较，前者表现为透明度、溶解氧和ｐＨ值下降，生化需氧量增加，统计分析表明，上述四因子具有显著性差异。

草鱼口服鱼害粘球菌疫苗的免疫效果

以F—MP、P—MP、H—MP和LPS四种疫苗拌入饵料中投喂草鱼,实验条件下,四种疫苗均能使鱼体获得不同程度免疫力,其中LPS疫苗作用为最强.