白斑综合征病毒PCR检测方法的建立及初步应用

引起白斑综合征(White spot syndrome,WSS)的白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是一种传播速度快、致死率高的对虾病毒,对全球对虾养殖业构成了严重威胁。为及早诊断WSS,防止WSS的传播和暴发,有必要开发一种适用于对虾养殖场所的高灵敏度WSSV检测方法。该文针对保守区VP28序列设计和优化了一种可以特异地扩增WSSV的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。WSSV扩增产物在凝胶电泳图上可观察到清晰且单一的目的条带,而非靶标病毒则没有对应扩增产物出现,最低检测限可以达到50拷贝/反应;利用该PCR方法检测杭州地区采集的112份对虾混样样品,WSSV阳性率为15.7%。该特异和灵敏的PCR方法可被应用于WSS流行早期监控。

白斑综合征病毒在养殖克氏原螯虾中感染流行研究

2007年,在从南京采集的患病养殖克氏原螯虾样品超薄切片中发现大量类似对虾白斑综合征病毒(WSSV)颗粒,结合初步的流行病学调查、人工回感实验及PCR检测结果确定导致此次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原为WSSV。利用建立的特异性引物PCR方法,在江苏省内扬州邵伯湖、淮安白马湖、盱眙、南京禄口等多处养殖克氏原螯虾体内均检测到该病毒,且在鳃、心肌、神经、肝脏、肠道、肌肉等多处组织中被检出;未检测到另外两种常见对虾病毒:桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)。

一株凡纳滨对虾病原菌的分离、鉴定及其致病力分析

从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的进化地位最接近。综合上述实验结果分析得出,该细菌分离物为副溶血弧菌。

对虾WSSV人工感染螯虾及其检测

用对虾白斑综合症病毒(WSSV)人工感染淡水克氏原螯虾(Procambarusclarkii) ,感染组螯虾3～6d内全部死亡。核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴 ,阳性检出率分别为92% (92% ) ,89 % (86 % ) ,81 % (75 % ) ,对照为11 % (3% ) ,5 % (5 % ) ,0(0) ;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大、嗜酸性着染 ,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子 ;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃 ,阳性检出率均为100 % ,对照阳性检出率均为0。结果表明 :对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾 。

疑患EMS/AHPNS对虾中检出黄头病毒的一种新株型

对2012—2013年从河北、福建和广东3个对虾养殖场采集的12份发生疑似早期死亡综合征/急性肝胰腺坏死综合征(EMS/AHPNS)的样品,采用组织病理学方法、套式RT-PCR检测方法以及快速灵敏检测试剂盒进行了检测。三地来源的养殖对虾样品症状均表现为肝胰腺颜色变淡,部分出现萎缩,空肠空胃,腹节肌肉略微白浊;组织病理切片结果表明,患病对虾肝胰腺血细胞浸润,肝胰腺盲管上皮细胞脱落,继发性细菌感染,淋巴器官和血淋巴细胞内存在核固缩、破裂和细胞质包涵体。按世界动物卫生组织(OIE)手册的套式RT-PCR方法检测,结果显示,黄头病毒(Yellow head virus,YHV)目的产物的阳性样品检出率为66.7%,该方法对这些样品的灵敏度可能很低。目的产物测序后经NCBI Blast,与已报道的YHV相似性为76.5%—89%;系统发育树显示这3个来源的样品位于同一个分支,与已知的YHV/鳃联病毒(gill-associated virus,GAV)株均不相同,其亲缘关系与YHV较近,而与GAV较远。用新研发的YHV快速高灵敏检测试剂盒检测,结果表明,所有样品均为YHV强阳性。以上表明患AHPNS的养殖对虾中存在一种YHV的新株型的感染,这也是我国首次检测到YHV的感染。

对虾病毒病与化学需氧量相关关系研究

通过对虾池内主要环境因子与对虾病毒病相关关系的研究 ,发现虾池内化学需氧量(COD)太高是诱发对虾病毒病暴发流行的主要环境因子之一。利用多级S型净化池可以大幅度消除水体中的COD 。

用聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测无包埋体对虾病毒

聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测证明，某虾场发病的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）感染无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ），或称中国对虾类杆状病毒（ＰｃＢＬＶ）；野生脊尾白虾（Ｅｓｏｐａｌａｅｍｏｎｃａｒａｉｎｉｃａｕｄａ）也感染ＮＯＳＶ，并可能经卵垂直传播；南美白对虾（（Ｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）亦可感染该病毒而发病。经ＰＣＲ扩增纯化的皮下及造血组织坏死症杆状病毒（ＨＨＮＢＶ）与ＮＯＳＶ的核酸结果表明，两者为同一种病毒。选取经ＰＣＲ检测的９份样品，重新编号后用ＥＬＩＳＡ法进行检测，两种方法判定的结果完全相同。将ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ双阳性的样品制备超薄切片，观察到ＮＯＳＶ感染的典型细胞病变。可以认为，在国内流行的中国对虾“暴发病”病原为ＮＯＳＶ。

抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)中草药的筛选及番石榴叶水提取物对WSSV致病性的影响

通过人工感染试验,比较了11种中草药水提取物对对虾白斑综合症病毒(WSSV)致病性的影响,在此基础上,研究了番石榴叶水提取物的浓度和处理时间对WSSV的消毒效果。结果表明,在11种中草药提取液中,仅有番石榴叶水提取物对WSSV有显著的杀灭作用,处理时间超过12 h可使WSSV失活,消毒效果与药物和病毒的相对浓度相关。

颤藻浓度和水温对凡纳滨对虾响应颤藻粗提液毒性的影响

文章研究了绿色颤藻(Oscillatoria chlorina)不同成分对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的毒性,分析了颤藻浓度与水温对对虾响应粗提液毒性的影响,并初步检测了颤藻粗提液所含的毒素。结果显示,湿藻质量浓度为5.04 mg·m L^(-1)的颤藻细胞及其粗提液可导致93.72%以上的对虾死亡,藻细胞培养液对对虾无致死效应。用湿藻质量浓度高于2.52 mg·m L^(-1)的粗提液注射对虾,对虾死亡率超过86.67%,随质量浓度低至0.504 mg·m L^(-1),对虾死亡率降至2.22%,差异显著(P<0.05);水温显著影响了粗提液对对虾的致死效应(P<0.05),湿藻质量浓度为2.52 mg·m L^(-1)的粗提液在22℃水温条件下可引起20.0%对虾死亡,当温度升至34℃,对虾死亡率增加至97.8%;以微囊藻毒素(Microcystin-RR/YR/LR,MC-RR/YR/LR)作标准品,使用高效液相色谱法检测颤藻粗提液毒素,结果在粗提液中均未检出RR、YR、LR等3种常见的微囊藻毒素。结果表明,绿色颤藻可致对虾急性死亡,其主要有害成分是颤藻粗提液所含的非MC-RR/YR/LR等藻毒素,对虾对颤藻粗提液毒性的响应与颤藻浓度和水温显著相关(P<0.05)。

对虾白斑综合征病毒在螯虾动物模型的感染特性

应用克氏原螯虾作为动物模型研究对虾白斑综合征病毒 (WSSV)的感染增殖特性 ,涉及感染温度、感染途径、继发感染、半数致死量 (LD50 )、免疫保护及保存期等。结果显示 ,2 2～ 2 5℃时 ,接种WSSV的螯虾一般于 2～7d内死亡 ,温度升高对病毒增殖影响不显著 ,30～ 32℃时 ,平均死亡时间 2～ 6d ,温度降低对病毒增殖影响较显著 ,15～ 19℃时 ,接种螯虾平均 2～ 10d内死亡 ,8～ 10℃时 ,平均死亡时间 3～ 13d。感染途径分别用腹节肌肉、腹节皮下注射及口服 ,均能使螯虾感染发病 ,而浸泡方式不能使螯虾发病。细菌分离和细菌定量结果表明 ,寄生于螯虾心脏、肝胰腺内的阴沟肠杆菌在感染后期大量增殖 ,菌量分别是正常螯虾的 2 5和 30倍 ,形成继发感染。用螯虾测定WSSV的LD50 为 10 -6.5·mL-1种毒液。将病毒 5 6℃ ,30min灭活后免疫螯虾 ,不能使螯虾形成免疫保护。WSSV匀浆液 - 30℃冻存 1年后失活 ,而 - 30℃冻存于螯虾体内WSSV保存

凡纳滨对虾Crustin-like基因的克隆及在副溶血弧菌感染条件下的表达分析

【目的】研究凡纳滨对虾Crustin-like基因(即CL基因)的结构和功能,探明CL基因是否参与副溶血弧菌侵染条件下的免疫应答,为进一步研究凡纳滨对虾的免疫机制和抗病育种奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆凡纳滨对虾CL基因;用DNAstar、Clustalx、MEGA 5.0、PROSITE、TMpred和SignalP软件,分析CL基因序列及其蛋白结构,并预测蛋白功能;利用副溶血弧菌进行攻毒试验和实时定量PCR,检测CL基因在病原侵染条件下的表达情况。【结果】克隆获得了凡纳滨对虾CL基因(登录号:JQ824114)的cDNA,全长为501bp,含有33bp的5′非翻译区(1～33bp)和24bp的3′非翻译区(478～501bp),编码区为444bp,共编码147个氨基酸;对CL蛋白结构及功能的分析表明,该蛋白编码蛋白质含有1个信号肽、1个跨膜螺旋和1个WAP结构域;攻毒试验表明,副溶血弧菌刺激可导致CL基因表达量的明显变化,总体呈现出先降低后升高的变化趋势。【结论】克隆了凡纳滨对虾CL基因的全长,发现其与副溶血弧菌侵入后引发的免疫反应密切相关,可以作为副溶血弧菌感染前期诊断的参考指标。

中华绒螯蟹豚鼠气单胞菌的分离和鉴定

对杭州转塘患“抖抖病”的中华绒螯蟹进行了病原的分离和鉴定 ,从病蟹体内分离到两株病原菌 ,均属革兰氏阴性杆菌 ,单极生鞭毛 ,运动 ,兼性厌氧 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,氧化酶、七叶苷、过氧化氢酶阳性 ,能还原硝酸盐等 ,其形态特征及生理生化反应与豚鼠气单胞菌基本相同 ,故鉴定为豚鼠气单胞菌 .人工注射感染健康蟹后 ,均在 3d内死亡 ,死亡率为 10 0 %,证实豚鼠气单胞菌为中华绒螯蟹的致病菌 .药敏试验结果表明 ,此病原菌对链霉素、卡那霉素、新霉素、环丙沙星、氟哌酸、氯霉素、庆大霉素、妥布霉素、氟嗪酸、壮观霉素、复达欣、头孢呋肟、菌必治、萘啶酸、呋喃妥因等药物高度敏感 .

常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。

流式细胞术检测对虾白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染

用WSSV粗提液人工感染克氏原螯虾,感染后分别在6,12,18,24h采血分离血细胞,通过WSSV的混合单抗和FITC标记的羊抗鼠二抗的间接免疫荧光染色,应用流式细胞仪检测病毒对克氏原螯虾血细胞的感染并分析感染强度。结果表明:分离获得的血细胞形态完好,感染后血细胞内的病毒被标记上了绿色荧光;流式检测发现,随感染时间延长,被感染细胞的百分率及平均荧光强度均逐渐升高,反映血细胞的病毒感染程度逐渐加深;PCR检测同时证实人工感染后各采样点血细胞样品均为WSSV阳性。

蝇蛆提高对虾抗杆状病毒感染能力的初步研究

室内试验表明 ,投饲蝇蛆起始时间至少需在病毒侵袭前 1 0d ,对对虾起始死亡时间和 50 % ,90 %死亡时间才有明显的延缓 ,分别较对照组延长 1 .76,3 .0 4 ,4 .1倍 ;蝇蛆可以显著提高对虾的抗杆状病毒感染能力 ,激活对虾的酚氧化酶系统 .田间试验表明 ,投喂有蝇蛆的虾池 ,存活时间平均为 64d ,不投喂蝇蛆的对虾 ,存活时间平均为 3 3 .5d .1 993年投喂蝇蛆的虾池平均每天死虾数小于存池量的 0 .0 2 3 % ,1 994年平均每天死虾数占存池数的 0 .0 1 5% ,经PCR检测证实 ,1 993 ,1 994年对虾中杆状病毒病变的个体仅占 1 .1 5% .

蟹源致病性拟态弧菌的粘附及侵袭特性

病原菌对机体的致病作用是由其产生的各种毒力因子共同作用的结果,其中病原菌对组织细胞或粘膜的表面粘附是造成机体感染的首要条件。病原菌的粘附因子主要包括菌毛粘附素和其它非菌毛粘附素(如鞭毛、外膜蛋白和血凝素等),其中以菌毛介导的病原菌对组织细胞的粘附是细菌在体内定居、增殖释放毒力因子发挥致病作用的关键。为了揭示拟态弧菌HX 4的致病机理,以经典粘附模式细胞HEp 2细胞作为体外细胞模型,探讨蟹源致病性拟态弧菌HX 4株的粘附特性以及受体物质和抗全菌抗体对细菌粘附作用的影响,同时采用庆大霉素清洗裂解培养法测定该菌对HEp 2细胞的侵袭力。结果显示,HX 4菌株能粘附HEp 2细胞,对HEp 2细胞具有侵袭力。细菌对HEp 2细胞的粘附方式为集聚性粘附,最佳粘附时间为1h,甘露糖和抗体能显著抑制该菌的粘附,表明HEp 2细胞上含有甘露糖样受体。该菌的粘附素除了主要是菌毛外,可能还含有鞭毛、外膜蛋白、血凝素等多种成分。

人工越冬对虾体内寄生纤毛虫病的研究

本文报道了中国对虾越冬亲虾体内寄生纤毛虫（旋毛蟹栖拟阿脑虫）病的发病机制、病理组织及防治方法。试验结果表明：虾体表损伤是致病的主要原因。纤毛虫通过伤口进入虾体内，寄生于心脏血淋巴，吞噬血细胞，破坏组织尤其是鳃组织。致使组织机械损伤，缺血、变性，对虾呼吸困难，贫血、窒息而死。防止对虾体表受伤是预防该病的唯一途径。一些外用消毒剂如福尔马林、孔雀绿等对该病也有预防作用。

分离草虾杆状病毒包涵体的一种新方法

本文报道了一种纯化草虾杆状病毒（MBV）包涵体的方法。取出受MBV感染的虾肝胰组织，在TESP溶液中（50mmol／dm3Tris－HCIpH8．0，50mmol／dm3EDTA，0．1mol／dm3NaCl，0.5mmol／dm3PMSF）破碎，差迷离心，再经30％～70％蔗糖浓度梯度高速离心，可得到合包涵体的区带。电镜下观察到较纯的包涵体，经蛋白酶K降解后，PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳可见清晰的DNA区带。

人工感染白斑综合征病毒的克氏原螯虾的病理学试验

用从发病中国对虾体内提取的白斑综合征病毒 (WSSV )人工感染克氏原螯虾 ,被感染克氏原螯虾均发病死亡。光学显微镜下观察病螯虾的组织切片 ,发现其胃、鳃等的上皮组织以及结缔组织的细胞核明显肿大和嗜伊红染色 ;电镜观察超薄组织切片 ,发现病螯虾的胃部、鳃部组织的细胞核内有大量的杆状病毒样病毒粒子 ,该病毒粒子有囊膜 ;斑点杂交检测发病螯虾 ,阳性率为 10 0 % ;人工感染克氏原螯虾的角化上皮、胃上皮、肝胰腺上皮、疏松结缔组织、肌肉、造血组织和鳃 ,经原位杂交检测呈阳性。

人工越冬对虾拟阿脑虫病病理组织观察

本文报道了一种纤毛虫──旋毛蟹栖拟阿脑虫引起中国对虾越冬亲虾疾病的病理组织变化。试验结果表明：拟阿脑虫从对虾体表甲壳损伤处侵入虾体内,寄生于血淋巴,吞噬血细胞、大量繁殖并随血液循环到达组织器官,纤毛虫对组织尤其是鳃组织造成严重机械损伤而使组织变性、坏死,导致对虾呼吸困难,贫血、窒息,死亡。