生防菌株贝莱斯芽孢杆菌DJ1液体发酵工艺优化

在单因素实验的基础上,分别采用正交实验、响应面实验优化了贝莱斯芽孢杆菌DJ1的培养基组分和发酵条件。确定最佳培养基组分为:麦芽糖2.5%、酵母粉0.5%、氯化钠1.0%、硫酸锰0.02%;最佳发酵条件为:发酵时间23 h、初始pH值8、发酵温度36℃,在此条件下,OD_(600)值为1.819,与模型预测值基本吻合,发酵液的有效活菌数为2.34×10^(9) CFU·mL^(-1)。

分离纯化重组解脂耶氏酵母发酵液中虫草素的研究

多项研究证明以解脂耶氏酵母作为虫草素生物合成的细胞工厂,是获得虫草素的有效途径。为获得下游虫草素分离纯化工艺,该研究采用不同规格的大孔吸附树脂对重组解脂耶氏酵母发酵液中的虫草素进行静态、动态纯化。结果显示,以NKA-Ⅱ大孔吸附树脂作为吸附材料,在虫草素质量浓度为3 mg/mL、pH值为9的上样液以上样流速为3 BV/h、上样体积为10 BV、洗杂流速为2 BV/h、洗杂体积为3 BV、洗脱剂为体积分数为30%乙醇、洗脱流速为3 BV/h、洗脱体积为15 BV时,发酵液中虫草素回收率可达到87.67%,纯度达65.82%。该研究为今后利用重组解脂耶氏酵母大规模生产制备虫草素提供数据参考。

menD表达强度对枯草芽孢杆菌中维生素K2产量的影响

维生素K2(Vitamin K2,MK)是一种重要的天然化合物,在治疗多种疾病方面都有着重要的作用。为探究枯草芽孢杆菌甲萘醌途径中关键基因menD表达量的不同对于细菌生长、生物膜形态与MK合成的影响,以枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168,BS168)为出发菌株,构建BS168-ΔmenD、BS168-P_(43)-menD、BS168-P_(xylA)-menD突变菌株,使用HPLC检测菌株中MK的含量,使用western-blot检测蛋白质的表达强度,以确定menD在枯草芽孢杆菌中对于MK合成的作用。研究发现,BS168-ΔmenD菌株生长缓慢,无法很好的产生生物膜,在培养基中需要添加甲萘醌标准品细胞才能生长;BS168-P_(43)-menD、BS168-P_(xylA)-menD突变菌株的生物膜和MK的含量与原始菌株都有较为显著的差异。静态发酵时,孔板中重组菌株BS168-P_(43)-menD、BS168-P_(xylA)-menD生物膜的形成量和褶皱程度相较于原始菌株得到较大的提升,BS168-P_(43)-menD、BS168-P_(xylA)-menD重组菌株的生物膜形成量分别为原始菌株的1.36倍与1.59倍,同时,BS168-P_(43)-menD、BS168-P_(xylA)-menD MK产量分别为原始菌株的1.64倍和1.87倍,BS168-P_(xylA)-menD的最大产量达39.27 mg/L。结果表明,作为枯草芽孢杆菌中MK合成途径的关键酶,menD的表达量是影响枯草芽孢杆菌中生物膜与MK形成的重要因素。

纤维素降解菌I2的分离及相关降解基因功能验证

纤维素是地球上数量最大的可再生能源物质,利用微生物或其产生的酶可将纤维素水解成葡萄糖。筛选高效纤维素降解菌和纤维素酶一直是生物能源等领域研究的热点。该研究筛选分离了1株具有降解纤维素能力的短小芽孢杆菌I2,通过基因组测序,分析其参与纤维素降解的基因,并对纤维素酶的功能进行验证。I2分离自河南南阳宝天曼自然保护区落叶及长期堆积小麦秸秆的堆体等样本富集后的混合菌系,具有降解滤纸的能力,48 h内可以降解大部分滤纸。基因组组装分析显示,I2的基因组大小为4.2 Mbp,含有4635个基因。利用CAZy碳水化合物数据库注释和酶活性测定实验,对数据库检测到的182个基因进行分析,明确I2中4个基因在大肠杆菌表达后具有纤维素酶活性。其中,G2269纤维素内切酶活性最高,在pH 5.0,温度55℃条件下,酶活力可达49.02 U/mL。金属离子Ca^(2+)、Zn^(2+)对于G2269的活性有明显提高作用,Mn^(2+)和Cu^(2+)对G2269活性抑制比较明显,Mg^(2+)、Co^(2+)、K^(+)、Ni^(2+)、NH_(4)^(+)对于G2269的活性无显著影响。此外,G2269还具有良好热稳定性和酸碱稳定性,在65℃保持30 min后仍保留70%的活力,在食品加工和饲料生产等领域显示出较好的应用潜力。

λ-Red重组技术结合复合诱变提高大肠杆菌L-异亮氨酸合成能力

本研究旨在通过λ-Red重组技术结合复合诱变方法提高大肠杆菌L-异亮氨酸合成能力。以E. coli NXA为出发菌株,首先采用λ-Red同源重组敲除编码支链氨基酸转运蛋白基因brnQ,获得突变菌株E. coli NXA1。然后将E. coli NXA1经常温常压等离子体(ARTP)、紫外(UV)与亚硝基胍(NTG)多轮复合诱变,以α-氨基丁酸(α-AB)为结构类似物进行筛选,筛选得到突变菌株E. coli NXA2。摇瓶发酵结果表明,在37℃、200 r/min条件下发酵40 h后,E. coli NXA1的L-异亮氨酸滴度为2.76 g/L,较E. coli NXA提高了33.98%;E. coli NXA2的L-异亮氨酸滴度为3.22 g/L,较E. coli NXA1提高了16.67%,较E. coli NXA提高了56.31%。对菌株E. coli NXA2经连续传代20代后,表现出较好的遗传稳定性。λ-Red重组技术结合复合诱变对大肠杆菌提高L-异亮氨酸合成能力有明显效果,为选育L-异亮氨酸高产菌株奠定理论基础。

代谢工程改造大肠杆菌合成甲萘醌-7

甲萘醌-7(menaquinone-7,MK-7),作为维生素K2亚型之一,具有治疗骨质疏松,保护心血管健康等作用。常见MK-7生产主要由纳豆等食品发酵而来,但存在产量低,提取复杂等问题,而枯草芽孢杆菌作为MK-7常见生产菌株,也面临发酵周期长,发酵产量低的问题。该研究对一株引入甲羟戊酸途径的大肠杆菌进行改造,首先利用DLKcat模型比较筛选出4个关键酶,包括七聚异戊二烯焦磷酸合酶BtHepS\BtHepT、1,4-二羟基-2-萘甲酸七烯基转移酶MnMenA、甲萘醌生物合成C-甲基转移酶NtMenG,将其进行表达优化,构建了大肠杆菌内源合成MK-7途径。随后,整合表达异戊烯基焦磷酸异构酶EcIdi提升前体供应,再对得到的菌株进行补料分批发酵条件优化,包括延迟诱导时间,提升溶氧量至60,MK-7产量达到929.58 mg/L,但出现1217.58 mg/L的去甲基甲萘醌-7(DMK-7)大量堆积的现象。进一步筛选了不同来源的MenG降低DMK-7的堆积,发现Bacillus subtilis 168来源的MenG可以较好地降低DMK-7堆积。最终,在5 L发酵罐上MK-7的产量达到1090.45 mg/L,DMK-7降低至231.14 mg/L。该研究结果对应用大肠杆菌生产MK-7具有一定的指导意义。

大肠杆菌利用不同碳源生产N-乙酰神经氨酸的研究

N-乙酰神经氨酸是最常见的一种唾液酸,通常位于细胞膜表面糖蛋白和糖脂的末端,具有多种生物学功能。由于其独特的生理和生化性质,N-乙酰神经氨酸在制药、化妆品和食品行业的应用越来越广泛,需求量不断增加。N-乙酰神经氨酸在大肠杆菌中的异源生物合成需要与中心碳代谢过程竞争前体物,因此,碳源利用效率,以及碳代谢流在细胞生长与N-乙酰神经氨酸合成中的分配,直接影响N-乙酰神经氨酸的合成效率。该研究从碳源利用调控角度,比较了葡萄糖、甘油,以及两者混合利用对N-乙酰神经氨酸合成的影响。在单一葡萄糖碳源条件下,菌株NEU5AC-2中pfkA的敲除减弱了中心碳代谢的强度,减少了副产物乙酸的积累,协调了前体物N-乙酰甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸的供应,5 L发酵罐分批补料发酵38 h产生23.8 g/L N-乙酰神经氨酸,获得了较高的发酵生产水平,具有较强的工业应用潜力。该研究可以为其他以糖酵解途径的中间代谢物为前体物的异源产物合成提供借鉴。

产生物碱苦豆子内生真菌筛选及其发酵条件优化

本研究旨在筛选出能够产喹诺里西啶类生物碱的苦豆子(Sophora alopecuroides)内生真菌菌株,探究其发酵条件,提高碱产率。以前期从苦豆子健康种子中分离的50株内生真菌为材料,采用薄层色谱法、高效液相色谱法和酸性染料比色法进行产生物碱菌株的筛选,对获得的菌株进行形态学和多基因序列比对分析,确定分类地位。随后,通过单因素和响应面法探究添加L-哌啶酸、L-赖氨酸和α-酮戊二酸对产生物碱菌株碱产率的影响。结果表明,共筛选出3株高活性产槐定碱菌株DSD103,DSD201和DSD308,均属于互隔链格孢(Alternaria alternata),其菌丝中槐定碱的产率分别为0.212,0.544和0.276 mg·g^(-1)。碱产率最高的菌株DSD201在L-哌啶酸浓度为1.079μmol·L^(-1)、L-赖氨酸浓度为6.251μmol·L^(-1)和α-酮戊二酸浓度为0.153μmol·L^(-1)时,菌丝中碱产率达到最大,为0.949 mg·g^(-1),比对照提高了74.12%。所筛选的产生物碱菌株为通过微生物发酵生产喹诺里西啶类生物碱提供了一种新方法。

达托霉素高产菌株选育及补料工艺研究

通过选育达托霉素高产菌株以及优化前体物质的补料工艺来提高发酵产量。采用常压室温等离子体(Atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变,结合链霉素和利福平抗性育种方法,在低溶氧发酵体系下对达托霉素突变株进行筛选,获得了高产菌株DT-SR-18,其摇瓶发酵水平较出发菌株提高了36.2%。以癸酸钠作为达托霉素合成的前体物质,在50 L罐优化了癸酸钠的补料工艺。研究结果表明:在发酵培养24 h后,以0.5 mL/(h·L)恒定速度流加25%的癸酸钠溶液,其500 L罐发酵产量平均达到2351μg/mL,达托霉素的发酵水平大幅提高。

封闭式固态发酵体系监测与调控的研究进展

封闭式固态发酵体系是指在封闭可控的条件下,自动化、智能化完成固态发酵的系统,以此达到稳定产品质量、降低劳动强度、提升智能化程度的目的。近年来,随着传统酿造行业转型升级、推进智能制造的需求日益迫切,封闭式固态发酵体系的研发越来越受到行业及科研人员的关注。本文从各类监测设备和方法的运用、各种数学模型和调控策略的开发、各式调控策略对监测设备的优化角度出发,综述封闭式固态发酵体系的监测方式,介绍封闭式固态发酵体系的调控策略,为将来改进和研发封闭式固态发酵体系提供一定的理论依据。

枯草芽孢杆菌LM 4-2发酵人参芦头生物转化人参皂苷Rd的研究

人参为我国传统的食药同源资源,但由于潜在的催吐等副作用,在人参炮制过程中需要做去芦处理,导致大量的人参芦头被丢弃,造成了严重的资源浪费,如何减少浪费、提高人参的综合应用需要进行相应研究。该研究建立了基于超高液相色谱法的人参皂苷检测方法,通过对13种人参皂苷单体进行测试,验证了该检测方法的准确性与可靠性。采用生物转化的方法,从6株候选菌株中筛选出转化人参皂苷Rd产量最高的菌株Bacillus subtilisLM 4-2,推测人参皂苷Rd经由Rc水解途径转化而来,进一步通过单因素试验与响应面试验设计,确定了菌株LM 4-2的最佳发酵条件为发酵时间20 d,温度30℃,料液比1∶4.3(g∶mL),接种量7.5%,该优化条件下Rd产量为(6.375±0.006)mg/g。同时,研究还对人参芦头发酵提取物的抗氧化性和抑菌效果进行了测定,抗氧化性试验发现DPPH自由基的清除率随着提取物浓度的增加而增加,提取物质量浓度为50 mg/mL时,DPPH自由基的清除率为82.55%;抑菌试验结果表明,在提取物质量浓度达到1.0 mg/mL时,对测试菌株金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均能产生抑制作用,发酵液对3种测试菌株的最低抑制浓度分别为1.0、0.75和1.0 mg/mL。这些研究为通过菌株LM 4-2发酵人参芦头转化人参皂苷Rd、提高人参芦头的应用价值提供了参考。

灵芝固态发酵三七渣产漆酶工艺优化

目的 优化灵芝固态发酵三七渣产漆酶工艺。方法 在单因素试验基础上,以发酵时间、发酵温度、接种量为影响因素,漆酶活性为评价指标,Box-Behnken响应面法优化发酵工艺。结果 最佳条件为发酵时间14 d,发酵温度28.09℃,接种量26.65%,漆酶活性为3.612 U/g。结论 该方法稳定可靠,可为灵芝固态发酵三七渣产漆酶后期开发和应用提供依据。

苹果酵素混菌发酵工艺优化

该研究以费比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、戊糖乳植物杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)为发酵菌种制备苹果酵素,研究不同菌种组合发酵对苹果酵素可溶性固形物、pH、总酸、还原力、超氧化歧化酶(SOD)活性和感官评分的影响,并采用单因素和响应面试验对苹果酵素酵母菌发酵阶段和乳酸菌发酵阶段的工艺进行优化。结果表明,多菌种发酵苹果酵素酵母菌发酵阶段最佳工艺条件为费比恩塞伯林德纳氏酵母∶酿酒酵母1∶0.2,接种量3.3%,发酵温度23℃,初始pH4.7,乳酸菌发酵阶段最佳工艺条件为戊糖乳植物杆菌∶肠膜明串珠菌1∶1,接种量5.2%,发酵温度33℃,初始pH 5.1,在此优化条件下,多菌种发酵苹果酵素的感官评分为9.82,SOD活性为55.83 U/m L、总酸含量为4.96 g/L、还原力为6.83、可溶性固形物含量3.14°Bx、p H为2.96。该研究为苹果酵素产品工业化产生提供了理论依据。

淀粉液化芽孢杆菌BS5582产蛋白酶的发酵条件优化、酶学性质分析及其在牛皮脱毛中的应用

该研究旨在优化1株高产蛋白酶淀粉液化芽孢杆菌BS5582的产酶条件,分析其酶学性质,并考察其在牛皮脱毛工艺中的应用效果。结果表明,BS5582菌株的较优产酶培养基组成为(g/L):玉米粉50.0,豆饼粉40.0,Na_(2)HPO_(4)·12H_(2)O 6.0,KH_(2)PO_(4)3.0,MgSO_(4)1.8,CaCl_(2)0.75;培养基初始pH 6;较优发酵条件为:发酵温度35℃,接种量10%,装液量15 mL。在较优条件下,该菌株产蛋白酶活力达到(5270.59±19.61)U/mL,是优化前的21倍。BS5582菌株所产蛋白酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和8.5,Mn^(2+)对酶有明显激活作用,而Fe^(2+)、Fe^(3+)和苯甲基磺酰氟对酶活力有显著抑制作用。将该酶应用于牛皮脱毛,发现其具有良好的牛皮脱毛能力且胶原损伤小。相比于传统灰碱法脱毛,该蛋白酶脱毛后牛皮毛孔中无发根残留,毛发完整脱落,脱毛废水的污染指标总固体悬浮物、化学需氧量和五日生化需氧量值分别比化学脱毛法降低约87%、39%和45%,这说明BS5582菌株产蛋白酶具有潜在的清洁脱毛应用价值。

产角蛋白酶芽孢杆菌50-3的分离与初步鉴定

为获得产角蛋白酶活性较高的菌株,以1 942株动物粪便源芽孢杆菌为对象,在角蛋白酶筛选培养基中进行初筛,以菌株生长的透明圈与菌落直径比值较大的菌株在种子培养基中进行复筛,并进行菌株鉴定。结果表明:复筛得到的菌株50-3在鸡毛粉作为角蛋白酶诱导底物的培养基上,37℃发酵36 h,角蛋白酶活力可以达到(694±15)U/mL。通过形态观察、生理生化分析、全细胞蛋白电泳和16S rDNA序列分析,初步鉴定菌株50-3为枯草芽孢杆菌进化分支中的一个种,命名为Bacillus sp.50-3。

宏基因组来源高活性酯酶的鉴定及其酶学性质表征

土壤中大量的非培养微生物是新酶发现的重要资源。该研究利用功能宏基因组学策略筛选获得高活性酯酶,并对其进行鉴定分析。采用三丁酸甘油酯平板法对土壤微生物宏基因组文库中具有酯酶活性的克隆进行筛选,获得高活性的阳性克隆,通过生物信息学分析和生化实验对酯酶的酶学性质进行研究表征。获得一个比活力高达(3 957±3) U/mg的酯酶AesZF899,该酯酶为不含信号肽的酯酶第四家族胞内酯酶,蛋白大小34 kDa,与来自Afipia sp.P52-10中未表征的α/β水解酶(GenBank登录号为WP_034470467.1)一致性达76.43%。AesZF899的最佳底物为对硝基苯乙酸酯,酶反应的最适pH值和最适温度分别是9.0和40℃。AesZF899在30℃温育8 h后仍可保持初始活性,在35、40℃分别温育7和4 h后仍可保持50%的活性,在反应温度大于80℃后酶活性丧失。终浓度10 mmol/L的Fe3+可以增强酶活性,而终浓度10 mmol/L的Na+、Li+和Mg2+有较强的抑制作用。体积分数为1%二甲基亚砜可以增强酶活性,异戊醇也对酶活性有一定的促进作用。

C/N对枸杞枝条粉发酵过程中堆体理化性状及微生物群落多样性的影响

为探讨C/N对枸杞枝条粉园艺基质化腐熟发酵过程中堆体理化性状及微生物群落多样性的影响,以宁夏枸杞枝条粉为研究材料,以尿素为氮源,分别设置C/N为15(W1)、20(W2)、25(W3)、30(W4)、35(W5)、43.75(W6)。结果表明:整个发酵过程中各处理的pH和电导率均呈现逐渐降低趋势,总氮含量逐渐升高,铵态氮含量呈现先增加后降低的总体变化规律,硝态氮含量各时期变化规律较为一致,均呈现出先增加、后降低、再升高的折线变化规律。在整个发酵过程中纤维素酶活性差异较大,C/N为20~35处理W2、W3、W4、W5在发酵过程中呈现出持续上升趋势,C/N过低(15)或过高(43.75)表现为发酵前期(0~15 d)呈小幅度上升趋势,在15~105 d时间内呈现缓慢下降趋势。发酵堆体中脲酶变化规律为先增加、后降低、再增加的变化规律。C/N为20时,纤维素、半纤维素降解率值最大,而木质素增加值最大。在属水平上草酸降解菌(Pandoraea)、亚硝基单胞菌(Nitrosomonas)、亚硝基螺旋体(Nitrosospira)、假单胞菌(Pseudomonas)、双球菌(Paracoccus)、陶厄氏菌(Thauera)、嗜酸盐杆菌(Acidihalobacter)、绵羊属(Ovis)、马赛菌属(Massilia)、硝化细菌(Nitrobacter)、游动放线菌属(Actinoplanes)、硫磺菌属(Sulfuritortus)均为优势菌群。C/N较高时(C/N≥25),枸杞枝条发酵堆体微生物群落物种数量、物种多样性、丰富度、物种均匀度均显著增加,基于PCA分析得出C/N值25为氨化作用和硝化作用临界值、C/N值35为反硝化作用临界值。因此,为加速枸杞枝条粉发酵过程并减少氮素流失,建议发酵堆体初始C/N保持在20~25之间。

基于高效液相色谱(HPLC)的微生物发酵过程中的关键代谢物分析

微生物发酵是生物工程和工业生物技术的核心过程,涉及多种复杂的生物化学变化,其发酵过程中产生的代谢物对于理解微生物的生理状态和优化生产过程至关重要。高效液相色谱(HPLC)作为一种高效、精确的分析方法,在识别和定量这些代谢物方面发挥着关键作用。文章基于高效液相色谱(HPLC)对微生物发酵过程中的关键代谢物展开分析,以期为微生物发酵过程的控制和优化提供参考。

一株除臭固氮菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

为提高食品加工原料质量、降低环境污染,从自然界分离筛选出一株能有效减少鸡粪臭味及氮素流失的菌株JFN-1。通过形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定,JFN-1为假肠杆菌(Empedobacter falseni)。通过液态发酵得出:JFN-1菌株在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶作用下,可以提高硝态氮、减少铵态氮含量以及减少氮类物质分解为氨气,从而减少氮素损失。通过单因素和正交优化试验,得到JFN-1菌株增殖培养基组成为可溶性淀粉8 g/L、牛肉膏20 g/L、硫酸镁4 g/L、氯化钠5 g/L,30℃培养20 h发酵液OD600可达到3.14,相比未优化培养基提高12.91倍,总氮含量提高2.14倍。通过固态发酵条件优化,得到JFN-1菌株固定氮素含量最多的固态发酵基质为菌糠15 g、麸皮15 g、豆粕1 g、糠醛渣2 g、硫酸铵0.165 g,在此条件下,总氮量提高196.42%。

混菌发酵茶籽抗氧化肽的分离纯化及其功能活性研究

为促进茶叶籽资源的深度开发利用,采用不同截留分子质量的超滤膜对混菌发酵茶籽多肽产物进行分级分离,比较茶籽多肽的抗氧化活性与其分子质量的对应关系;利用凝胶过滤色谱技术对茶籽多肽逐级纯化,获得特征性茶籽抗氧化肽,对其二级结构组成及相对含量进行分析,并考察其热稳定性和抗消化稳定性;以H_(2)O_(2)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)建立氧化损伤模型,评价茶籽抗氧化肽的细胞氧化损伤保护功能。结果表明:经超滤分级后,茶籽多肽的抗氧化活性与其分子质量呈负相关,分子质量小于1 kDa的TSP4组分具有最高的自由基清除能力;TSP4分子质量分布范围在90~849 Da之间,凝胶过滤色谱纯化得到的TSP4-b亚组分平均分子质量为446 Da,其二级结构中的β-折叠的相对含量从未发酵茶叶籽的16.59%上升至44.43%,α-螺旋则由未发酵茶叶籽的37.61%降至17.57%;TSP4-b经20~60℃热处理以及模拟胃肠消化后,自由基相对清除率仍可分别保持在90%及80%以上,具备良好的热稳定性及抗消化能力;中(0.5 mg/mL)、高(5.0 mg/mL)剂量的TSP4-b的介入可使H_(2)O_(2)诱导的MEF细胞存活率分别达到73.8%、82.4%。综上,所分离的茶籽抗氧化肽具有较强的抗氧化活性,对H_(2)O_(2)诱导的细胞损伤具有保护作用,在医药、保健食品等领域具有良好的发展潜力。