转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_(GAP)组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_(AOX1)诱导型和P_(GAP)组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除Mit1后,GFP几乎不能发出荧光。实时荧光定量PCR结果显示,在甲醇和甘油2种碳源下,敲除Prm1后Mit1少量表达,敲除Mit1后Prm1大量表达。【结论】利用P_(AOX1)诱导型过表达Prm1、Mit1和利用P_(GAP)组成型过表达Mit1,均能提高GFP在毕赤酵母细胞内的表达量。Prm1和Mit1可作为正调控因子在毕赤酵母产外源蛋白中发挥作用,且Prm1能激活Mit1,Mit1可反馈抑制Prm1。

核酸切除修复途径相关基因对酿酒酵母耐受性的影响

酿酒酵母在工业发酵过程中会受到多种环境压力,包括氧化、高温、酸、乙醇及高渗等,因此选育高耐性酿酒酵母对工业生产具有重要意义。微生物中DNA重组酶、核酸修复酶等与核酸修复相关的蛋白与菌体对不良环境的耐受性有关。该实验基于核酸切除修复途径,通过基因工程手段,探究酿酒酵母内源核酸切除修复基因(RAD 16、RAD7、RAD23和RAD4)和外源基因(UVRA)对酿酒酵母耐受性的影响。结果表明,过表达酿酒酵母自身核酸切除修复基因RAD16、RAD7、RAD23及RAD4提高了酿酒酵母高渗耐受性。过表达UVRA基因可以提高菌株高渗耐受性,这意味着该元件在真核和原核细胞中存在功能上的保守性。这些结果有助于提高酿酒酵母对环境胁迫尤其是高渗透压环境的耐受性,并为研究酵母耐受性机制提供了新的思路。

温度对豆瓣酱发酵过程理化指标、风味物质和微生物群落的影响

该文通过设置恒温豆瓣酱发酵实验,考察不同温度对豆瓣酱发酵过程中理化指标、风味物质、生物胺和微生物群落组成的影响,并与自然温度发酵豆瓣酱进行比较。结果发现,温度的提高有利于氨基酸态氮和还原糖的积累,同时促进了游离氨基酸和挥发性风味物质的形成,且能降低酱醅中食源性致病菌的丰度;然而,较高的温度同样会导致酱醅中总酸含量和生物胺含量偏高。发酵后,40℃发酵组中的氨基酸态氨、还原糖、挥发性风味物质和生物胺含量分别为1.02 g/100 g、12.07 g/100 g、25.65 mg/kg和54.10 mg/100 g,自然发酵组中的各物质含量分别为0.95 g/100 g、11.70 g/100 g、16.74 mg/kg和43.52 mg/100 g。因此,与自然发酵相比,提高发酵温度能够加速豆瓣酱发酵成熟,但是需要进一步的工艺优化消除总酸和生物胺偏高的风险。

细菌sRNA来源、作用机制及调控网络研究进展

通过发酵生产工业产品一直是细菌等微生物的研究热点,但是发酵过程中存在的代谢副产物和环境胁迫等问题,限制了工业菌株的发展。sRNA是细菌中普遍存在的一类调控性非编码RNA,它们与核糖开关、双组分系统、转录因子等其他调控元件共同构成了细菌中的复杂调控网络,在代谢调控和抗胁迫中都发挥着异常重要的作用。文章对细菌中sRNA的来源、作用机制以及在调控网络中的角色进行了详细总结,有助于更好地解析细菌的代谢途径及发酵过程中受到的环境限制,对构建低毒力、高鲁棒性菌株,助力工业产品的发酵生产有重要参考意义。

基于非粮糖蜜的聚羟基脂肪酸酯发酵培养基优化与中试放大

为促进绿色生物基材料聚羟基脂肪酸酯(PHA)的发展,推进非粮糖蜜发酵等工艺标准化、规模化、绿色化运行,压缩PHA发酵成本,提高生产强度,该研究以盐单胞菌(Halomonos sp.)TD01为发酵菌株,基于非粮糖蜜原料发酵生产PHA。通过单因素试验和响应面法优化确定最佳发酵培养基配方,并调整补料培养基后进行中试放大验证。结果表明,生产PHA最佳发酵培养基配方为糖蜜添加量33.2 g/L,尿素添加量2.5 g/L,硫酸铵添加量2.2 g/L。在此优化条件下,PHA产量为3.12 g/L。通过2 L扩大发酵罐培养得到PHA总产量达到67.36 g/L,较优化前产量增长142.13%;5 kL中试发酵得到PHA总产量为51.16 g/L,较优化前产量增长了83.90%。

大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖基因组整合型菌株构建及发酵优化

2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose,2’-FL)是一种岩藻糖化人乳低聚糖,具有预防肠道疾病、提高免疫力、促进大脑发育等重要生理功能。基于基因组水平,通过敲除大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中2’-FL合成前体物质相关代谢基因,如β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase,lac Z)、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因(undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase,wca J)和GDP-甘露糖基水解酶基因(GDP-mannose mannosyl hydrolase,nud D),构建2’-FL合成底盘细胞;在此基础上,将外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-Fucosyltransferase,wbg L)和磷酸甘露糖变位酶基因(phosphomannomutase,man B)、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因(annose-1-phosphate guanylyltransferas,man C)、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因(GDP-mannose 4,6-dehydratase,gmd)和GDP-岩藻糖合酶基因(GDP-L-fucose synthase,wca G)引入到大肠杆菌基因组中,探究在基因组水平过表达2’-FL合成基因对2’-FL产量的影响。结果表明,2’-FL在所构建菌株B-05的摇瓶含量达到了1.99 g·L^(-1)。进一步通过摇瓶发酵优化确定了最优发酵条件:IPTG诱导浓度为0.4 mmol·L^(-1)、诱导时OD600为2.4,诱导温度为28℃。在此条件下,摇瓶中2’-FL合成量达到了3.92 g·L^(-1)。最后在5 L发酵罐中,2’-FL含量达到了43.48 g·L^(-1)。研究表明通过将外源2’-FL相关合成基因导入基因组中进行过表达,实现了2’-FL高效合成,为构建整合型2’-FL菌株提供了数据支撑。

大肠杆菌肌苷酸节点代谢优化高效合成肌苷

该研究以产肌苷的大肠杆菌INO4-5为出发菌,针对其发酵过程中副产物含量高、肌苷产量低以及需要额外添加腺嘌呤等问题,对肌苷酸节点代谢流进行了优化。首先使用不同启动子和核糖体结合位点对枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)基因进行了表达,以强化腺苷合成支路,使菌株5 L发酵罐上的肌苷产量达到了29.5 g/L,且无需额外添加腺嘌呤。接着通过替换guaB基因的原有启动子以弱化鸟苷合成支路,并过表达guaC基因促使鸟苷酸回流至肌苷酸,使菌株副产物含量显著降低且肌苷产量提升至35.1 g/L;最后对不同5′-核苷酸酶进行了筛选和强化,发现引入来自酿酒酵母的特异性5′-核苷酸酶基因(introduction of specific 5′-nucleotidase gene,ISN1)可有效促进肌苷生产。最终所得菌株INO7-6在5 L发酵罐上发酵,肌苷产量为41.2 g/L,转化率为0.17 g/g葡萄糖,生产强度为0.86 g/(L·h),为目前报道的基因工程菌株的最高产量。

Amycolatopsis sp.的全基因组测序及香兰素合成途径分析

拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)CCTCC NO:M2011265是一株可以转化阿魏酸生成香兰素菌株,该研究利用Illumina Hiseq测序平台对拟无枝酸菌进行全基因组测序、拼接、基因预测及功能注释,并从拟无枝酸菌的全基因组中筛选和鉴定参与香兰素合成的功能基因。结果表明,总共组装得到64个scaffolds,整个基因组组装大小约为8425551 bp,总GC含量为71.89%。通过生物信息学分析发现了香兰素合成关键基因ech、fcs和ech2基因,及香兰素分解代谢基因vdh基因,其中ech和fcs为一个基因簇,并进一步构建过表达ech-fcs-ech2菌株,其摇瓶发酵表明转化阿魏酸生成香兰素速率加快,发酵时间显著缩短。该研究获得的拟无枝酸菌的全基因组信息为解析其转化阿魏酸生成香兰素发酵过程中的代谢机理提供遗传信息基础,也为通过代谢工程获得高产香兰素菌株的研究提供理论支持。

氧化还原电位在微生物发酵中的应用

氧化还原电位(ORP)作为一种可以实时监控发酵状况、高灵敏度的发酵参数,可以克服微氧、厌氧环境下溶氧电极应用的限制而应用于发酵。ORP波动既可以反映发酵液中氧化性或还原性的相对强弱,还与发酵过程中微生物生长状态密切相关。分析ORP数据可以判定微生物生长阶段,而调控ORP可以反向作用于微生物的基因表达和代谢活动,为发酵生产提供一种新颖的调控途径。该文系统介绍了微生物发酵中ORP的概念、波动原理及潜在的微观机制,总结了近年来ORP作为非调控参数时的发酵应用及新检测技术开发;同时针对ORP的调控方式、分析方法、产品开发以及菌种选育进行重点阐述,以期为ORP在微生物发酵中的深入研究提供理论基础。

原花色素对酿酒酵母细胞膜特性的影响

为了从细胞膜的角度考察原花色素的作用机制,该研究考察了添加量为0.5 g/L和1.0 g/L的原花色素对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞膜特性的影响,分别测定了不同发酵体系中胞外核酸和蛋白质含量、脂肪酸组成和丙二醛含量等变化。结果表明,与未添加原花色素的体系相比,经原花色素处理的酵母细胞膜的通透性、完整性和流动性有所增加,其中1.0 g/L原花色素对细胞膜流动性影响最大,且添加1.0 g/L原花色素使细胞膜通透性在72 h内增加到24 ms/cm;不同的脂肪酸含量变化不同,其中花生酸含量的变化最为明显,1.0 g/L原花色素组增加了7%。膜脂的过氧化产物分析结果表明,添加原花色素降低了胁迫条件下丙二醛含量,其中添加1.0 g/L原花色素组的变化最为明显,在第5天时丙二醛含量最低,为1.3μmol/L。因此推断在葡萄酒发酵过程中,原花色素通过增强细胞膜的完整性和通透性等特性,增加底物和代谢物的交换速度,进而促进酵母的生长和代谢。

过表达kojR高产曲酸米曲霉的转录组差异分析

曲酸是一种真菌次生代谢产物,在化妆品、食品和制药工业中有多种用途。为揭示米曲霉发酵生产曲酸的生物合成机制,该研究利用基因工程的手段获得一株kojR过表达菌株T58号,摇瓶发酵曲酸产量最高达到29.54 g/L,较原始米曲霉菌株3.042的10.12 g/L提升191.9%。将发酵过程中获得的菌株T58与3.042菌丝体进行转录组分析,发现两者之间存在2450个显著差异表达基因,其中1203个基因表达上调,1247个基因表达下调。菌株T58差异性表达量最高的前20个基因中,上调基因主要为不同类别的氧化还原酶,与氮源利用相关基因的转录水平显著下调。基因本体数据库分析显示,与转运活性相关的差异基因数量最多。

基于高效液相色谱(HPLC)的微生物发酵过程中的关键代谢物分析

微生物发酵是生物工程和工业生物技术的核心过程,涉及多种复杂的生物化学变化,其发酵过程中产生的代谢物对于理解微生物的生理状态和优化生产过程至关重要。高效液相色谱(HPLC)作为一种高效、精确的分析方法,在识别和定量这些代谢物方面发挥着关键作用。文章基于高效液相色谱(HPLC)对微生物发酵过程中的关键代谢物展开分析,以期为微生物发酵过程的控制和优化提供参考。

基于OBE理念的发酵工程课程建设

作为生物技术专业的主干课程,发酵工程具有广泛的交叉性、应用性和创新性。该课程在传授专业知识的同时,满足了教学育人的时代需求,具有普及课程思政工作的特殊优势。基于成果导向教育(outcome based education,OBE)理念,从人才培养、课程体系、教学模式、地方特色需求等方面,就进一步改良和提高发酵工程课程的教学质量进行探索与研究。

枯草芽孢杆菌生产工艺优化研究

为优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵工艺,提高其在工业生产中的应用效率,通过调整碳氮源、无机盐添加和发酵条件(pH值、温度、通气量和转速),探究枯草芽孢杆菌最佳生产工艺。结果表明,葡萄糖和豆粕粉是最佳的碳氮源,在40 g/L和15 g/L浓度下菌量和芽孢率最优;添加无机盐能够显著增加菌量和芽孢率;pH值、温度、通气量和转速对菌体生长和芽孢有显著影响。这些发现可为枯草芽孢杆菌的商业利用提供重要的工艺指导。

基于海藻糖代谢及转运的酿酒酵母抗逆机制研究

酿酒酵母是发酵工业中的重要微生物,广泛应用于酿造及烘焙等行业。然而,在生产过程中,酵母细胞常常会面临各种“环境胁迫”,如酿酒中的乙醇胁迫及烘焙中的冷冻、高渗胁迫等。这些条件会抑制酵母细胞的生长和代谢能力,降低其发酵效率。海藻糖作为一种重要的细胞保护剂,在寒冷、干燥、氧化等胁迫条件下,能够维持细胞膜和蛋白质的结构稳定,起到保护细胞的作用。在酿酒酵母中,葡萄糖苷转运体(alpha-glucoside transporter,Agt1)是一种H+依赖性海藻糖转运蛋白,能够在细胞应对各种胁迫时,通过转运海藻糖到脂质双分子层的机制,为细胞提供保护功能。该文综述海藻糖在酿酒酵母中的抗逆机制及与Agt1相关的研究进展,旨在为筛选和构建高产高耐性工业酿酒酵母菌株奠定理论基础。

微生物发酵中菌丝结球影响因素的研究进展

在微生物发酵过程中,诸多产品只有在丝状菌丝结球的情况下才能产生其所需要的次级代谢产物;还有一些产品在菌丝结球的情况下能够有效减少发酵动力消耗,有利于控制成本。菌丝结球的影响因素复杂且综合,涵盖了菌种的遗传特性、质量和接孢量、进入发酵罐前种子的种龄和移种量、培养基中各种营养成分的比例,以及发酵过程中的溶氧、搅拌转速、空气流量等工艺控制参数。基于此,文章对发酵过程中菌丝结球影响因素的研究进行系统介绍。

多粘类芽孢杆菌发酵工艺优化研究

针对多粘类芽孢杆菌发酵工艺进行系统优化,主要从培养基成分(碳源、氮源、碳酸钙)方面入手,通过三角瓶试验及100 L发酵罐放大试验找出最优发酵培养基,提高多粘类芽孢杆菌的菌量和芽孢率。结果表明,最佳发酵培养基为2%豆粕粉+2%蔗糖+1%玉米淀粉+0.6%硫酸铵,最优碳酸钙添加量为0.5%,在37℃、转速200 r/min、通气60 L/min、初始pH值7.2的条件下,100 L发酵罐发酵32 h,菌量和芽孢率达到最佳,验证了小试条件的可行性和稳定性。

混菌发酵蓝莓酒工艺及抗氧化活性评价

为提升蓝莓酒品质,采用异常威克汉姆酵母单独接种、葡萄酒酿酒酵母单独接种,异常威克汉姆酵母和葡萄酒酿酒酵母混菌接种发酵蓝莓酒,在单因素试验的基础上进行正交试验,确定了混合菌种发酵蓝莓酒的最佳工艺参数:异常威克汉姆酵母提前24 h接种,接种量4%,异常威克汉姆酵母与葡萄酒酿酒酵母的接种体积比为1.5∶1,初始可溶性固形物25°Brix,发酵温度25℃,发酵时间10 d。最佳工艺条件下发酵得到酒香协调,酒体丰满,具有蓝莓的特有风味的蓝莓酒,感官评价得分86.2,酒精度为13.5%vol。对混菌发酵的蓝莓酒进行抗氧化活性评价,结果表明混菌发酵的蓝莓酒DPPH和ABTS自由基清除率较高,与单菌发酵所得蓝莓酒DPPH和ABTS自由基清除率均存在显著性差异(P<0.05)。

副干酪乳杆菌VHProbi E12发酵藿香提取液的抗UVB性能研究

中波紫外线(Ultraviolet B,UVB)照射会使细胞产生自由基,诱导细胞衰老和光老化。近年来,环境污染、臭氧层的破坏等问题导致UVB辐射增强,皮肤光老化问题日益严重。为筛选具有抗光老效果的藿香发酵菌株,建立人永生化角质形成细胞(Human immortalized keratinocytes,HaCaT)UVB损伤模型,并从细胞活力、抗光老、抗氧化以及抗炎效果方面评价菌株发酵液的作用效果。结果表明,副干酪乳杆菌VHProbi E12的发酵藿香提取液能够帮助HaCaT抵御UVB损伤,使细胞活力提高21.20%。在抗光老效果方面,与模型组相比,高浓度E12发酵液使基质金属蛋白酶-1含量减少24.68%,羟脯氨酸浓度提高43.79%。在抗氧化方面,E12发酵液处理可以逆转UVB照射引起的氧化损伤,显著提高细胞中SOD和GSH水平,与模型组相比,高浓度E12发酵液使SOD含量提高77.75%,GSH含量提高26.03%。此外,E12发酵液处理后,UVB照射引起的炎症也有所缓解,TNF-α和IL-6含量较未处理组降低。本研究提供了副干酪乳杆菌VHProbi E12发酵藿香提取液保护HaCaT抵御UVB损伤的证据,为藿香的进一步开发以及抗光老天然提取物在防晒产品方面的应用提供了理论依据。

生物基可持续皮革替代材料的研究现状及进展

微生物和植物材料具有可生物降解性、独特的物理机械特点,以及形成和处理过程中的无污染和可再生性等优势,可用作皮革的替代材料。文中从原料来源、制备方法等方面介绍了近年来生物基皮革替代品的研究进展,指出了目前研发存在的不足,并探讨了未来的发展趋势。