一株链霉菌的鉴定及其产格尔德霉素的发酵工艺研究

【目的】对链霉菌Streptomyce sp.FIM18-0592进行菌种鉴定,并对其胞外格尔德霉素产量进行发酵工艺优化,旨在提高产量并降低发酵成本。【方法】通过形态特征、培养特征和生理生化特性,结合16S rDNA序列分析构建系统发育树进行菌种鉴定;采用单因素试验优化培养条件及培养基配方,进一步使用最陡爬坡试验和响应面试验优化培养基配方的含量。【结果】通过对链霉菌FIM18-0592的形态特征、培养特征及生理生化特征进行初步培养观察发现,其在ISP2等培养基上生长较好,气生菌丝旺盛,产黑色素。结合16S rDNA分子鉴定,确定该菌为格尔德霉素链霉菌(Streptomyces geldanamycininus)。通过单因素试验对发酵条件以及培养基配方进行优化,得到最适宜菌株发酵的培养条件为转速140 r/min、装液量12%(体积分数)、接种量7%(体积分数)、培养时间144 h。最佳的碳源、氮源、无机盐分别为葡萄糖、黄豆饼粉和硫酸铵。采用最陡爬坡试验和响应面优化试验确定了其最优的发酵培养基为:葡萄糖10.42%、黄豆饼粉1.68%、硫酸铵0.3%、乳酸0.3%、甘油4%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.4%,在此条件下,格尔德霉素的发酵效价达到2887μg/mL,较原始发酵工艺效价提高了66%。【结论】链霉菌FIM18-0592为格尔德霉素链霉菌,通过对其发酵工艺进行优化显著提高格尔德霉素的产量,为格尔德霉素及其衍生物的开发和利用奠定基础。

凝结芽胞杆菌发酵优化工艺

为提高凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)的生长效率,在摇瓶、发酵罐水平考察了最适的碳源、温度、维生素添加量、pH以及发酵过程存在的氧化胁迫对凝结芽胞杆菌生长代谢的影响,获得了发酵培养基配方,并确定了30 L发酵罐最适培养条件:培养温度为40℃,初始pH为6.2~6.5,培养过程中9~14 h用氨水溶液控pH=5.5,pH大于5.5后停止控制,全程以4.1 mg/(L·h)速率流加半胱氨酸。优化条件下,发酵13 h细胞生物量达1.9×10^(10)CFU/mL,较对照提高363.4%,细胞生长效率为1.5×10^(9) CFU/(mL·h),较对照提高305.4%。显著提高了生物量、缩短了发酵周期,为凝结芽胞杆菌工业化生产提供了重要参考。

米曲霉异源表达合成虫草素

【目的】通过米曲霉中异源表达虫草素合成关键基因,构建米曲霉工程菌株合成虫草素。【方法】以米曲霉尿苷/尿嘧啶和组氨酸双营养缺陷型菌株AoΔpyrGΔHisB为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对虫草素合成关键基因CmCns1-CmCns3进行过表达;通过荧光显微镜观察CmCns1和CmCns2在米曲霉中的亚细胞定位;利用高效液相色谱法(HPLC)测定转基因米曲霉虫草素含量,同时对米曲霉发酵液添加合成虫草素的前体甘氨酸和腺嘌呤,探究其在米曲霉中对合成虫草素的影响。【结果】蛹虫草CmCns1和CmCns2在米曲霉中定位于脂滴;并且米曲霉中单独过表达CmCns1、共表达CmCns1和CmCns2以及共表达CmCns1-CmCns3均能合成虫草素,发酵48 h虫草素胞外产量最高达到37.74 μg/mL;向米曲霉发酵液添加甘氨酸和腺嘌呤,不能有效提升虫草素的含量。【结论】成功在米曲霉异源表达合成虫草素。

基于ZYNQ的罐内液位检测系统设计

在工业生产中,实时液位检测技术对提升产品质量、加快产品生产效率有着重要意义。文章以青霉素发酵项目为背景,在ZYNQ-7000平台上,搭建了以视觉传感系统为核心的液位检测系i统。采用软硬协同的方法,在PL端搭建图像采集硬件平台,完成图像数据缓存。在PS中实现罐内液位检测、基于UDP协议的视频传输以及McroSD卡图像存储功能。实验结果表明,该系统可实现对发酵罐液位的精确检测,具有低功耗、实时性、抗干扰能力强等优点,大幅提高了罐内液位的检测效率。

ARTP-DES复合诱变结合前体耐受性选育达托霉素高产菌株

为提高玫瑰孢链霉菌AN-126的达托霉素产量,对菌株AN-126进行常压室温等离子体-硫酸二乙酯(ARTP-DES)复合诱变,并结合癸酸钠耐受性筛选,最终获得一株达托霉素高产菌株RR-447,摇瓶产量为(101.41±0.37)mg/L,是出发菌株的2.44倍。对高产菌株RR-447进行平板传代、菌落形态及BOX-PCR多态性分析。结果表明,高产菌株RR-447高产性能稳定遗传,与出发菌株的菌球形态有明显差异,且高产菌株RR-447基因组DNA在1.50~2.00 kb之间存在一条特异性条带。在5 L发酵罐中通过分阶段补加癸酸钠溶液评价了菌株RR-447的发酵性能,达托霉素产量达到512.64mg/L。ARTP-DES复合诱变结合癸酸钠耐受性是选育达托霉素高产菌株的一种有效育种手段,为达托霉素工业微生物育种以及其他菌株改良提供了技术参考。

蛹虫草液体种制备及发酵生产菌丝体和虫草菌素工艺优化

为获得蛹虫草液体种制备和液体发酵生产菌丝体和虫草菌素的最佳工艺,以蛹草拟青霉Peacilomyces militarisBCEC07菌株为菌种,通过对接种量(孢子浓度)的考察,探索不同孢子浓度对蛹虫草液体母种制作效果的影响;通过单因素和正交试验,优化生产虫草菌素各营养因子的最佳种类和配比。结果表明:在1.5×1010孢子数的接种量时制作的母种最适合用于蛹虫草液体发酵产菌丝体和虫草菌素;蔗糖、蛋白胨、MgSO4.7H2O、K2HPO4和NAA是最适合的碳源、氮源、无机盐及生长因子;工艺优化后得出蛹虫草液体发酵产菌丝体的最佳配方为30g/L蔗糖、25g/L蛋白胨、1.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4.7H2O和4.0mg/L NAA;产虫草菌素的最佳配方为:30g/L蔗糖、25g/L蛋白胨、1.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4.7H2O和3.0mg/L NAA。优化后生物量和虫草菌素总产量分别提高了43.00%(达31.60g/L)和31.60%(达645.12mg/L)。为进一步提高蛹虫草菌丝体及虫草菌素的单位产量提供参考。

咪鲜胺对水稻恶苗病菌及其抗药突变体生长发育的影响

采用菌丝生长速率法和显微镜观察,研究了咪鲜胺对水稻恶苗病菌Fusarium fujikuroi生长发育及菌丝形态的影响。结果表明:咪鲜胺对水稻恶苗病菌敏感菌株及其抗药性突变体的菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长均有明显的抑制作用,而对产孢量无影响。当咪鲜胺浓度为0.5μg/mL时,能够完全抑制敏感菌株菌丝的生长,而不能抑制不同抗性水平抗性菌株的菌丝生长。随抗性倍数从24倍增加到112倍,药剂对抗药突变体菌落扩展的影响逐渐减小。咪鲜胺对敏感菌株菌丝生长的EC50值为0.047μg/mL,最小抑制浓度(MIC)为0.5μg/mL。20.00μg/mL咪鲜胺可完全抑制亲本敏感菌株的孢子萌发,而对不同抗药突变体孢子萌发和芽管伸长的抑制率分别为84.1%～89.0%和58.5%～65.8%,表明抗药突变体在菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长等阶段对药剂的敏感性与亲本菌株相比都有了不同程度的降低。10μg/mL咪鲜胺处理菌丝12h后,亲本菌株菌丝顶端膨大畸形,抗药突变体的菌丝顶端膨大,并在菌丝上长有许多细小分枝,表明药剂对抗药突变体次生菌丝生长的抑制作用不明显。

降解黄曲霉毒素微生物筛选中降解与吸附结合作用的区分

黄曲霉毒素的污染不仅带来巨大的经济损失,而且严重危害人和动物的健康,因而生物降解真菌毒素一直引人关注。但在研究黄曲霉毒素微生物降解时,首先必须要有可靠的方法来判定毒素是被降解还是可逆的吸附结合。该文在黄曲霉毒素B1(AFB1)降解菌株筛选中,对区分降解与吸附结合作用的方法进行了研究,建立了可靠的分析方法,通过比较不同pH的影响,细胞灭活对AFB1去除的影响,分析菌株细胞水洗脱、有机溶剂萃取后AFB1的变化等方法,有效地排除了生物吸附结合以及pH的干扰,区分了降解作用和可逆的吸附作用,这些方法简单实用。据此,从动物粪便中成功筛选到了2株能高效降解AFB1的菌株F4、F7。

产细菌素植物乳杆菌菌株的筛选及其细菌素生物学特征研究

从甘蓝泡菜中分离到６９株乳酸杆菌，通过琼脂点扩散交叉拮抗试验，筛选出３株有明显抑菌活性代谢产物的植物乳杆菌。排除酸、过氧化氢等干扰因素后，离心发酵液对指示菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ９６Ｄ仍有抑菌作用，用胰蛋白酶对其透析液处理后活性丧失，说明它们产生的抑菌物质是细菌素。以Ｇ８菌株为试材，对其细菌素类物质的产生及细菌素粗提物进一步研究，发现在对数末期其抑菌活性最高，对热相对稳定（１００℃，２０ｍｉｎ），易被胰蛋白酶、蛋白酶Ｋ和胃蛋白酶失活，显示活性的ｐＨ值范围为４．０～５．５，粗提液表现为不仅抗明串株菌属、片球菌属、乳杆菌属的一些菌株，而且抗一些非乳酸菌的革兰氏阳性菌，但对大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等革兰氏阴性菌没有任何抑制作用。

糖肽类抗生素替考拉宁研究进展

本文综述了目前临床上首选治疗多重耐药菌感染的糖肽类抗生素之一替考拉宁的研究进展,包括替考拉宁的结构、抗菌谱、作用机制、产生菌、发酵条件。

间歇补料分批发酵提高纳他霉素产量

对间歇补料分批发酵提高纳他霉素产量的工艺进行了研究,结果表明,在5L自动发酵罐条件下,初始葡萄糖浓度40g/L,以发酵液中的还原糖为控制指标,当还原糖降至2％以下时开始间歇补糖使葡萄糖浓度维持在2％,葡萄糖流加总量为20-25g/L,在最佳的间歇补料分批发酵工艺下,使纳他霉素的产量从1.5g/L提高到2.3g/L,提高率为35％。

红霉素发酵工艺优化研究

通过摇瓶正交实验，得出７种营养成分对红霉素生物合成的影响程度，对发酵工艺条件进行了优化研究，找到了红色链霉菌抗噬菌体６８＃菌种生长的优化组合，得出快速碳源（葡萄糖）与慢速碳源（淀粉）配比为２６４时，有利于红霉素的生物合成。还原糖／氮为２０，总糖／氮为８０～１２０时对红霉素发酵极为有利。借助磷酸三钙、沸石对ＮＨ＋４的独特吸附和释放作用，将二者按５∶１混合配成吸附和吐纳效果很好的捕集剂，对发酵液中游离无机氮源进行控制，可使抗生素生物合成提高１５％～２９％。

必特螺旋霉素基因工程菌发酵参数的研究

曾利用同源重组技术构建了稳定的必特螺旋霉素基因工程菌。本研究在30L全自动发酵罐从菌体生长,糖、氮源利用及发酵效价增长情况考察了必特螺旋霉素基因工程菌的发酵过程,研究了发酵过程摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、溶解氧(DO)等在线参数的变化,着重研究了不同溶氧水平对必特螺旋霉素发酵的影响。结果表明溶氧水平尤其是发酵前期溶氧水平对必特螺旋霉素发酵影响至关重要,前期临界氧浓度应控制在25%左右。本研究为必特螺旋霉素发酵放大工艺研究提供了依据。

产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化

以羧甲基纤维素钠培养基和液体发酵培养基筛选菌株,经初筛和复筛筛选出目的菌株后,通过观察菌落形态、颜色和孢子形态等方法初步鉴定目的菌株。结果表明,本研究筛选出的2株目的菌株均为黑曲霉。菌株的最佳碳源和氮源分别为1.0%CMC-Na和0.3%酵母膏,最佳培养起始p H值和最适宜温度分别为4和40℃。在此条件下培养7d后菌株1和菌株2的CMCase酶活分别达到0.504 IU/m L和0.277 IU/m L。

黑暗链霉菌DNA同源重组系统的构建

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprF-G的上、下游序列,作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因筛选标记及其启动子插入两交换臂之间,以温敏型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49安普霉素生物合成的重组质粒pFD8。该质粒通过E.coli ET12567/pUZ8002去甲基化修饰后,经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,利用红霉素抗性筛选得到3株阳性转化子,分别命名为Tt-49 AG1、Tt-49 AG2和Tt-49 AG3。通过PCR鉴定,证明pFD8已插入黑暗链霉菌Tt-49基因组的目标位点。以亲株作对照,对3株工程菌进行红霉素抗性能力考察,发现3株工程菌的抗红霉素能力均高达1 000μg/mL以上。

氨基酸和碳架物质前体对surfactin生物合成的影响

本文研究了单独添加以及组合添加氨基酸和碳架物质对surfactin生物合成的影响。氨基酸筛选试验表明,赖氨酸和甘氨酸能在一定程度上提高surfactin产量。添加一定浓度的赖氨酸和亮氨酸时,surfactin的产量分别比对照提高了29.20%和23.58%。进一步采用空间填充试验设计研究了氨基酸协同作用对surfactin生物合成的影响。结果表明:组合添加试验各氨基酸之间无交互作用,而且对surfactin生物合成未表现出比单独添加更高的增强作用,因此推测其surfactin生物合成存在严密的特异性限速机制。对碳架物质的筛选试验发现,添加三羧酸循环(TCA循环)相关碳架柠檬酸钠、琥珀酸钠和草酸时surfactin生成系数(YP/X)均高于对照组。琥珀酸钠和草酸单独添加浓度为0.75 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时,YP/X分别达到0.58和0.52。由于壬酸钠和癸酸钠的细胞毒性作用,碳架组合添加的均匀试验设计中对surfactin产量提高不明显,推测其surfactin生物合成途径与能量代谢存在潜在调控路径。

顶头孢霉菌原生质体制备及再生条件的改进

对头孢菌素Ｃ的工业生产菌顶头孢霉菌的原生质体制备、储存和再生的具体条件（如破壁酶、菌丝处理、菌龄、再生培养基、原生质体储存液等）进行了研究，优化各种条件后制备的原生质体的再生率最高可达６０％以上，这些改进了的条件也可供其它丝状真菌的原生质体制备和再生借鉴。

应用膜分离技术改进泰乐菌素提取工艺

应用超滤-纳滤组合膜分离技术对泰乐菌素发酵液进行提纯和浓缩,以取代原有的板框过滤。对不同材料、截留分子量的超滤和纳滤膜的筛选结果表明,超滤膜宜采用PES-150聚醚砜膜,纳滤膜宜采用聚酰胺复合纳滤膜DL 2540。发酵液采用硅藻土预处理,且超滤过程恒容累积加水250L,能提高82%的膜通量,此时泰乐菌素的收率达97%。发酵液超滤液与原板框滤液的泰乐菌素组分纯度基本一致,但超滤液萃取效果更好,萃取收率提高了20%～26%。DL 2540纳滤膜对超滤液进行3.5倍浓缩,平均通量可达41.3 L/(m2.h),通过纳滤收率可达99%,纳滤浓缩液萃取无乳化现象,所得萃取液的色度也较低。

Taguchi法优化Bacillus amyloliquefaciens fmb50产surfactin工业发酵培养基

采用田口方法(Taguchi method)对影响surfactin生产的各因素进行筛选,并对显著因子的水平进行优化后得出最佳配比。统计分析结果表明:玉米粉、硝酸铵和PO43-对其产量影响显著。获得高产工业发酵培养基的配方为:玉米粉35g/L,硝酸铵为15g/L,尿素6g/L,PO34-20mmol/L,Mn2+0.5mmol/L,Mg2+0.1mmol/L,Cu2+12.8μmol/L,Fe2+1μmol/L,Ca2+0.5μmol/L。此培养基surfactin产量达2294.28 mg/L,较原有Landy培养基产量提高15%,生产成本降低40%,为实现surfactin的工业化生产提供了基础。

响应面法优化达托霉素发酵培养基

采用响应面法对玫瑰孢链霉菌发酵产达托霉素的培养基进行了优化。首先通过Placket-Burman设计法筛选出影响达托霉素产量的4个重要因素:初始pH值、葡萄糖、L-天冬氨酸(L-Asp)、硫酸钾。其中初始pH值的影响极为显著(p<0.01),因此,对初始pH值进行了单因素试验,得到最优初始pH值为8.6。在此基础上对其余3个因素用最陡爬坡路径逼近最大响应区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得到最适培养基组成为:葡萄糖13.0 g/L、L-Asp 2.6 g/L、硫酸钾4.1 g/L。在此优化条件下,达托霉素产量达373.98 mg/L,与预测值(365.76 mg/L)非常接近,比优化前产量提高了2.25倍。