芽孢杆菌属在烟叶发酵和醇化中的应用研究进展

芽孢杆菌属在烟叶发酵和醇化的过程中起到了十分重要的作用。综述了烟叶发酵和醇化过程中细菌群落的研究进展,对芽孢杆菌属在协调烟叶化学成分、增加烟叶香气物质含量、改善烟叶感官质量、缩短发酵醇化时间和抑制烟叶霉变等方面的应用研究现状进行了总结,并对芽孢杆菌属在雪茄烟叶发酵过程中的研究方向及应用进行了展望,以期为应用芽孢杆菌菌剂提升国产雪茄烟叶品质提供参考。

雪茄烟叶工业发酵过程中霉变对真菌群落结构的影响研究

为探究雪茄烟叶工业发酵过程中真菌群落结构随霉变发生的变化情况,以德雪一号雪茄烟叶为实验材料,采用微生物学计数方法和Illumina MiSeq高通量测序技术对雪茄烟叶工业发酵过程中正常烟叶和霉变烟叶进行霉菌数量及真菌群落结构变化分析。结果表明:与正常烟叶相比,发酵第30 d霉变雪茄烟叶中,霉菌数量最高(8.3×10^(4) CFU/g),物种丰富度和多样性最低,OTU数量最少;在门水平上,子囊菌门(Ascomycota)在发酵第30 d霉变烟叶中为绝对优势菌门,平均相对丰度为99.82%;在属水平上,曲霉属(Aspergillus)为整个发酵过程中的主要优势菌属,在发酵第30 d霉变雪茄烟叶中平均相对丰度最大(92.32%);发酵第30 d霉变雪茄烟叶与正常烟叶相比在物种组成上具有明显差别,其中曲霉属既是优势菌属,又是组间差异菌属,且在各样品中平均相对丰度均最高,推断其为引起雪茄霉变发生的关键菌属。

^(60)Co-γ射线辐照对雪茄烟叶发酵微生物和代谢物变化及烟叶质量的影响

【目的】通过^(60)Co-γ射线辐照灭菌,明确微生物在雪茄烟叶发酵过程中的重要作用。【方法】以四川雪茄烟品种德雪1号为试验材料,以剂量10 kGy的^(60)Co-γ射线对发酵前烟叶进行辐照处理,测定分析发酵过程中烟叶微生物多样性、代谢组学、中性香气成分和常规化学成分含量。【结果】(1)辐照组烟叶发酵28 d样本经传统分离培养和Illumina MiSeq高通量测序均未发现细菌群落。(2)非靶向代谢组学结果显示,辐照组烟叶发酵28 d后芸香苷、根皮苷和山奈酚等多酚类物质,山奈酚-3-O-芸香糖苷等多酚糖苷类物质,二肽等含量高于未辐照组烟叶,而亮氨酸、L-丝氨酸和脯氨酸等氨基酸含量低于未辐照烟叶。KEGG富集差异显著的代谢通路是黄酮和黄酮醇生物合成通路与花生四烯酸代谢通路。(3)发酵28 d后,两组烟叶的生物碱、还原糖、总糖、淀粉和蛋白质含量均显著降低,辐照组烟叶发酵前后各指标的降幅小于未辐照烟叶。辐照组烟叶发酵28 d后中性香气成分总量显著低于未辐照烟叶,而棕色化反应产物总量显著增加,烟叶劲头、杂气、刺激性更大。【结论】对发酵前烟叶进行10 kGy^(60)Co-γ射线辐照可有效杀灭烟叶细菌,发酵28 d后大分子物质降解转化低于未辐照烟叶,感官质量增加幅度减小,但相比于发酵前仍有一定程度的改善。

一株具有多糖降解酶活性的真菌菌株的筛选及其在烟叶品质提升中的应用研究

【目的】获得对烟叶品质有提升效果的微生物菌种。【方法】以醇化两年的烟叶为材料,筛选出具有较强多糖降解酶分泌能力的真菌,进行种属鉴定、发酵条件优化和应用效果研究。【结果】(1)从烟叶中分离到5株丝状真菌,通过生物酶活性比较分析筛选到一株具有较强多糖降解酶活性的菌株S1。经形态学和分子生物学分析,该菌种鉴定为棘孢曲霉。(2)对菌株S1发酵条件进行优化,发现其在pH 6、30℃、10%接种量条件下发酵6 d时产酶量最高,其中纤维素酶、淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、果胶酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活力分别达到0.36 U/mL、8.48 U/mL、0.25 U/mL、3.71 U/mL、17.98 U/mL和3.19 U/mL。(3)施用菌株S1发酵液的烟叶样品的可溶性糖含量和多种有机酸、酮类、醛类、芳香类、醇类致香物质含量显著提高,烟碱和多种多糖大分子含量显著降低。【结论】本研究分离得到一株具有多糖降解酶活性的棘孢曲霉,在提升烟叶品质的应用方面具有较大的开发潜力。

雪茄烟发酵过程微生物群落结构及物种均衡性变化特征

为明确雪茄烟叶发酵过程中微生物群落组成、结构及物种均衡性的变化特征,基于高通量测序技术,采用细菌、真菌多样性指数比值分析方法,对不同发酵阶段雪茄烟叶表面细菌、真菌进行分析。结果表明,随发酵进行,细菌α多样性先升高后降低,在PEF3(中期)达到最高值;真菌α多样性基本稳定,仅在发酵PEF4(后期)显著降低;物种均衡性在前中期小幅度升高,但在PEF4后显著降低。PCoA分析显示,未发酵与发酵前中期细菌群落结构相似,与发酵后期明显分离。在发酵过程中,细菌葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和真菌明梭孢属(Monographella)、曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)为主要优势菌属。影响物种均衡性的关键微生物群落变化规律是:由发酵初期的泛生菌属(Pantoea)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),变为发酵中期马赛菌属(Massilia)、壤霉菌属(Agromyces)、根瘤菌科(Rhizobiaceae),最后稳定为Staphylococcus、Pseudomonas、Trichomonascus、雷尔氏菌属(Ralstonia)、Monographella。将微生物分为两个模块研究,共筛选出8个有利于提高物种均衡性的关键菌属。最终结构方程模型表明,在雪茄烟叶发酵过程中,影响物种均衡性改变的主要环境因子是温度和湿度,二者通过影响关键菌属的丰度而影响物种均衡性。

分子蒸馏法精制烟草提取物及其致香成分分析

以超临界萃取工艺及脱蜡工艺获得的烟叶提取物为原料,通过分子蒸馏法制备具有“清甜香”,“焦甜香”功能的烟草净油组分,研究了分子蒸馏制备烟草净油过程中各个工艺参数对实验结果的影响,并通过GC/MS分析,确定了不同净油功能组分的标志性致香成分及其含量。证明了通过超临界提取法联合分子蒸馏精制,可以有效富集烟叶中的致香成分,提高卷烟抽吸质感,为自主调香提供了核心的烟草净油产品。

嗜热毁丝霉果胶酯酶MtCE12-1的克隆表达及其酶学性质和应用研究

【目的】挖潜新型果胶酯酶的酶资源,在嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)中高水平表达烟草生物质诱导显著上调的同源果胶酯酶,对其进行酶学性质研究,并探究该果胶酯酶在协同降解烟草生物质过程中的作用。【方法】利用RTqPCR的方法分析嗜热毁丝霉在烟草生物质中果胶酯酶MtCE12-1的表达水平,通过2A肽介导的表达筛选系统,在嗜热毁丝霉菌株ATCC 42462中高表达果胶酯酶基因Mtce12-1,对高活性的阳性转化子进行产酶培养和蛋白纯化,表征了果胶酯酶MtCE12-1的酶学性质;以两种烟草生物质烟草压棒和烟草梗丝为底物,通过检测纤维素的剩余含量,分析了与纤维素酶的协同作用效果。【结果】与葡萄糖培养条件相比较,烟草生物质条件下果胶酯酶基因Mtce12-1的转录水平显著上调109-110倍,SDS-PAGE电泳分析、拷贝数和Western检测显示,重组蛋白MtCE12-1成功进行了表达和分泌,表达水平达到464.08 U/mL。该酶在75℃、pH 8.0时表现出最佳酶活力,在50-85℃和pH 7.0-9.0的范围内表现出较好的酶活力,具有良好的热稳定性。将100-300μg的MtCE12-1添加至降解体系后,烟草生物质中纤维素降解效率分别提高了18.5%-30.7%和14.6%-30.5%。【结论】用2A肽介导的表达系统在嗜热毁丝霉中可以高效表达和纯化制备目标蛋白,碱性果胶酯酶MtCE12-1不仅具有良好的温度稳定性,在烟草生物质降解过程中也具有突出的作用效果,为烟草工业生产应用提供了潜在的优质酶资源。

云产雪茄烟叶微生物群落、游离氨基酸及挥发性风味物质特征分析

为探究云南产区(以下简称“云产”)雪茄烟叶的品质差异,采用高通量测序和代谢组学技术等对云产雪茄烟叶的微生物群落结构、游离氨基酸和挥发性风味物质进行测定,通过O2PLS分析和相关性分析系统性地揭示产地微生物与烟叶风味品质之间的关系,并确定烟叶中的功能微生物和协同作用类群。结果表明:云产雪茄烟叶微生物群落结构存在产地差异,其中优势细菌主要为Aerococcus、Staphylococcus和Corynebacterium,优势真菌主要为Aspergillus、Cladosporium和Alternaria;雪茄烟叶中共检测出17种游离氨基酸,氨基酸含量整体表现为Asp含量最高,Met含量最低,味觉活性值较高的Asp和Glu对其呈味具有较大贡献,临沧云雪2号和普洱云雪2号雪茄烟叶游离氨基酸呈味特征较为突出;雪茄烟叶中共检测出65种挥发性风味物质,主要以酮类物质为主,甲基庚烯酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、癸醛、二氢猕猴桃内酯等16种差异风味物质对云产雪茄烟叶的风味形成具有重要作用,普洱2号的整体风味特征更加突出;Sphingomonas、Staphylococcus、Pseudomonas和Oceanobacillus之间的协同作用对烟叶的风味形成具有重要贡献,而Penicillium相对丰度与烟叶品质呈负相关。

茄衣中上部烟叶采收成熟度研究

立足湖北省丹江口市气候特征,以楚雪26号(CX-026)为研究材料,对不同生长时期(移栽后59~101 d)采收的中、上部烟叶的农艺性状、内在生理指标进行分析,探寻烟草成熟的变化规律,从而明晰最佳采收时间。农艺性状结果分析表明,随着采收时间的延后,中部和上部烟叶逐渐变长变宽、身份变厚至恒定水平;叶色由青渐深,后出现黄褐斑纹;茎叶夹角增大、拉力减小,说明烟叶成熟度逐步提高。生理指标分析表明,色素指标(SPAD、叶绿素a等)、光合特性(净光合速率、气孔导度等)随着生长而下降,从而使烟叶叶片色度值(LAB)提高。熵权分析揭示了光合指标和色素指标在烟叶成熟度评估中的重要作用,二者不仅权重高,而且相关性显著,为烟叶成熟度判别提供关键参考。根据光合指标以及色素指标分析结果,中部叶在移栽后66~73 d,上部叶在移栽后87~94 d变化趋于稳定,说明可能在此时间进入成熟期,可以选择作为适宜的采收时间。

基于宏基因组学的霍氏肠杆菌发酵解析及其烟叶品质提升机制研究

利用宏基因组学技术分析霍氏肠杆菌F8-1(Enterobacter hormaechei F8-1)发酵烟叶期间表面微生物的动态变化,结合烟叶中性香味成分分析及感官分析,探究霍氏肠杆菌F8-1提升发酵烟叶品质的机制。结果表明:发酵后烟叶香气质提高、润甜感突出、杂气和刺激性降低;巨豆三烯酮、茄酮、(E)-β-大马酮和二氢大马酮含量较发酵前分别提高37.40%、59.87%、53.02%和46.61%;烟叶发酵过程中霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌为优势菌;糖苷水解酶类数量最多,占发酵期间烟叶表面微生物碳水化合物活性酶的78.3%;肠杆菌属的相对丰度与茄酮、巨豆三烯酮、(E)-β-大马酮、二氢大马酮等中性香味成分含量呈正相关,糖苷水解酶1(GH1)家族的相对丰度与茄酮、法尼基丙酮、巨豆三烯酮等含量呈正相关;GH1家族中的糖苷水解酶可能是烟叶发酵后感官品质提升的关键因素。

基于宏基因组学的不同陈化时间烟草源功能微生物筛选

利用宏基因组学解析云南烟叶在不同陈化时间表面微生物群落结构及功能基因演替,跟踪烟叶陈化过程中的中性香味成分动态变化,分析微生物、酶基因与中性香味成分的相关性,并指导筛选烟草源功能微生物。结果表明:在烟叶陈化第3、6、9和12个月时,其表面优势菌属分别为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、肠杆菌属(Enterobacte)、泛菌属(Pantoea)和不动杆菌属(Acinetobacter);陈化过程中烟叶的中性香味成分如苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、茄酮、大马酮、巨豆三烯酮等总体呈增长趋势,糠醛和β-环柠檬醛则呈现先增加后降低的趋势,烃类化合物含量呈下降趋势;克雷伯菌属(Klebsiella)与β-大马酮、巨豆三烯酮和茄酮等呈显著正相关,不动杆菌属(Acinetobacter)与2-乙酰基呋喃,芳樟醇、巨豆三烯酮呈显著正相关,大部分碳水化合物活性酶与苯乙醛、苯甲醛、糠醇和西柏烯等成分呈负相关,多数糖苷酶与中性香味成分呈正相关;在烟叶陈化过程中共筛选得到75株微生物,微生物种类及其功能与宏基因组分析结果基本吻合,说明宏基因组分析结果可以指导微生物筛选工作,增强筛选目的性,提高筛选效率。

肠杆菌和不动杆菌混菌发酵提升山东烟叶品质机制研究

采用肠杆菌(Enterobacter cloacae F8-2)和不动杆菌(Acinetobacter nosocomialis 7S-2)混菌发酵山东烟叶,对发酵前后烟叶的感官品质与化学成分、烟气化学成分及烟叶表面微生物群落变化进行研究。结果表明:肠杆菌和不动杆菌按照体积比1∶1混合发酵24 h时,烟叶香气增加、杂气降低最为明显;发酵后烟叶中甲基庚烯酮、二氢大马酮、5-甲基糠醛分别增加了89.22%、35.67%、33.93%,烟气中橙花醇、茄酮、金合欢醇分别增加了78.01%、46.83%和45.95%;混菌发酵对烟叶表面细菌群落有较大影响,微生物间协同发酵、互利共生,同时肠杆菌和不动杆菌可能与苯甲醛、甲基庚烯酮等香气物质的生成有关。

工业发酵雪茄烟叶霉变微生物的分离鉴定及生物学特性研究

为明确引起工业发酵雪茄烟叶霉变的微生物种类及其生物学特性,从工业发酵霉变雪茄烟叶表面分离纯化得到3株霉菌,采用形态学和分子生物学结合的方法进行种属鉴定,并研究其生物学特性。结果表明曲霉属Aspergillus是本研究中引起工业发酵雪茄烟叶霉变的主要菌种,分离纯化得到3株霉变菌株分别为烟曲霉A.tabacinus、黄曲霉A.flavus和蒙地曲霉A.montevidensis。3株霉菌在不同培养基上的生长速度为黄曲霉>烟曲霉>蒙地曲霉。3株霉菌在25~35℃都能生长,40℃只有黄曲霉能生长,45℃及以上3株霉菌均不能生长。黄曲霉生长的最适pH为4,烟曲霉和蒙地曲霉生长最适pH为8~9。3株霉菌均对紫外光较敏感,紫外光照射15 min后致死率均达到90%以上。综上,本研究发现工业发酵过程中引起雪茄烟叶霉变的3种曲霉分别是烟曲霉、黄曲霉和蒙地曲霉,合理运用温度调控和紫外光照射对于防霉控霉有重要意义。

造纸法再造烟叶浓缩液中抗逆酵母的分离鉴定与代谢活性研究

采用稀释离心、富集培养、梯度平板筛选等方法,从造纸法再造烟叶生产过程中的烟草废弃物水提液(TWE)浓缩液中分离获得具有正常代谢活动的菌株,对其进行形态、生理生化特性等鉴定,并将其添加到TWE浓缩液中进行发酵,考查其生长代谢特性和对TWE浓缩液中代谢物组成的影响。结果表明:从TWE浓缩液中筛选获得一株高抗逆性的酵母菌株MC-9A1,其属于拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii);该菌株能在TWE浓缩液中生长并进行正常代谢活动,消耗大量的糖分;菌株MC-9A1在TWE浓缩液中消耗了大量强极性物质和少量中极性物质,并生成了大量弱极性或非极性物质,310多种代谢物发生显著上调或下调,如苯乙酰胺、木糖醇等极显著增加,而熊果苷、D-半乳糖醛酸等显著减少;菌株MC-9A1发酵改善了TWE浓缩液感官效果,使其香气质量增加,杂气、残余下降。

生物酶在烟草工业中的应用研究进展

基于生物酶处理对烟草及其制品品质变化的显著影响,综述了近年来生物酶处理在烟草提质、产香和减害等方面的研究成果,分析了生物酶在研究中存在的薄弱环节及问题。认为:烟叶中淀粉和果胶的酶催化降解相关研究取得较大进展,其中复合酶的作用效果多优于单一酶;漆酶与蛋白酶搭配处理梗丝效果较单一酶处理更好,同时,对烟梗进行酸处理、碱处理和汽爆处理可显著提高酶解效果;在烟草薄片制备原料再造烟叶浓缩液中,生物酶更容易发挥作用,具有处理时间短、效率高和作用效果显著等优点;在产香方面,生物酶主要通过产生参与美拉德反应的物质或催化香味前体物产香实现;在减害方面,生物酶主要通过降低烟草特有亚硝胺和烟气自由基等有害物质含量来实现。未来可从烟草生物大分子结构表征和特性研究、烟用酶制剂创制和催化机制解析两方面进行深入研究,以进一步推进生物酶在烟草增香、提质和减害等方面的研究及应用。

短小芽孢杆菌改善烟叶品质的研究

从烤烟叶面上分离筛选得到一株短小芽孢杆菌Van35(Bacillus pumilus Van35),将其菌剂喷施于烟丝,在45℃,60%温湿度条件下发酵21d。测定了烟丝的总糖、还原糖、钾、纤维素、蛋白质、总氮和烟碱含量。结果表明,处理后的烟丝中总糖、还原糖和钾含量升高,纤维素、蛋白质、总氮和烟碱含量均有所下降。菌剂Van35处理后,烟叶的糖氮比、糖碱比和氮碱比均有提高,化学成分比例更加协调。利用短小芽孢杆菌Van35处理后的烟叶样品,具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。

降果胶菌改善烟叶品质研究

为降低烟叶的细胞壁物质和果胶质含量,改善烟叶的吸味品质,采用从优质烟叶上分离的降果胶质菌株DPE-005产生的果胶酶对上部烤烟烟叶进行了处理试验。结果表明:经酶处理后烟叶的细胞壁物质和果胶质含量均有所降低,吸味品质得到改善。

广西仓储烟叶霉变微生物的分类鉴定

为了查清广西各烟叶仓库中引起烟叶霉变的微生物类群,进行了烟叶霉变调查。并在广西钟山、富川、柳州、南宁、武鸣的烟仓采集霉变烟叶标本,经分离、致霉性测定,选取发生普遍的9株曲霉,进行培养性状、形态特征及核糖体DNA-ITS序列分析等研究。鉴定结果分别为:匍匐散囊菌原变种(Euroti-um repens var.repens)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、谢瓦散囊菌(E.chevalieri)、菌核曲霉(A.sclerotio-rum)、中文名称不详(A.elegans)、米曲霉原变种(A.oryzae var.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、孔曲霉(A.ostianus)和聚多曲霉(A.sydowii)。

淡紫拟青霉在烤烟根际定殖能力分析

通过盆栽试验,确定了烟草根结线虫生防菌淡紫拟青霉IPC菌株在烤烟K326和云85根际的生长和定殖情况及其对根际微生物的影响。结果表明,施入菌剂2周和4周时淡紫拟青霉IPC菌株能在烤烟K326外根际、根表分离到,根内则不能分离到;而不同时期在烤烟云85的外根际、根表和内根际都能分离到。在6周时2种烤烟的外根际、根表和根内的分离数达到最大,8周时分离数减少。每个时期在2种烟草根际分离到IPC菌株的菌落繁殖单位(CFU)都是外根际最大,其次是根表,内根际最小。IPC菌剂处理后烤烟根际细菌、真菌和放线菌的数量在2周比对照减少,4周时比对照增多,6周和8周时与对照接近。表明生防菌淡紫拟青霉IPC菌株可以在烟草外根际、根表定殖和生长,而在根内则较困难,菌剂施用2周时对根际土壤微生物具有一定的抑制作用,4周后抑制作用减弱。

大蒜粗提物对烟草黑胫病菌的室内抑制作用

采用平板抑菌法测定了大蒜乙醇和水提取物对烟草黑胫病菌的抑菌效果。结果表明:大蒜提取物对烟草黑胫病菌有显著抑制作用,且随大蒜提取物浓度的增大而增强;大蒜乙醇提取物对烟草黑胫病菌的抑制作用优于水提取物。0.2g/mL和0.3g/mL浓度大蒜乙醇提取物对烟草黑胫病菌的抑制率均为100.00%;而0.3g/mL浓度的大蒜水提取物的抑制率亦为100.00%;大蒜水提取物与乙醇提取物的有效抑制中浓度分别为0.04g/mL和0.03g/mL。因此,可尝试以大蒜为原料研制植物保护剂来防治烟草黑胫病。