二氟沙星残留检测的Ci-ELISA方法建立

以合成的二氟沙星（DIF）人工抗原为基础，制备出了高效价抗DIF血清（1：2^9×10^4），并建立了DIF间接竞争酶联免疫吸附测定法（Ci—ELISA法）。标准曲线的线性回归方程为y=-0．223x-I-0．9631（r=0．9929），中值（I50）=119．21ng／ml，最低检测（LOD）=1．14ng／ml，线性范围为1．14～10000ng／ml，方法的平均批内变异系数（CV）为4．83％，平均批间CV为10．69％。DIF以浓度15～10000ng／ml在鸡肉中添加时，回收率为81．24％～90．64％，变异系数为8．18％～11．75％。

用ELISA方法检测鸡蛋氟喹诺酮类药物残留的研究

针对鸡蛋中喹诺酮类药物的残留,采用间接竞争ELISA方法建立了检测手段.样品经提取净化后,以氟喹诺酮类药物多残留试剂盒为基础,建立了鸡蛋中喹诺酮类药物残留的检测方法.结果显示,在5～50μg/kg浓度范围内的平均添加回收率在70%以上,批内变异系数在10%以内,批间变异系数在15%以内,检测限为5μg/kg,低于国家规定的喹诺酮类药物在鸡蛋中的残留限,建立了一种快速的对鸡蛋中喹诺酮类药物残留的检测方法,能满足目前基层初筛工作的实际需要.

氟喹诺酮类药物间接竞争ELISA检测方法的建立

以人工合成的CPLX-OVA为检测抗原、CPLX标准品为竞争半抗原,建立间接竞争ELISA检测方法。结果表明:理想的包被抗原质量浓度为0.25μg/mL,CPLX抗血清稀释倍数为1∶16000,酶标二抗稀释倍数为1∶4000,最小检测量为31.3 ng/mL,得到回归方程(y=-19.386x+95.648,R2=0.9875)和标准曲线,且对甲磺酸达氟沙星和甲磺酸培氟沙星有特异性识别,对氧氟沙星、盐酸洛美沙星、诺氟沙星、恩诺沙星识别较弱。该方法可用于多种氟喹诺酮类药物残留筛选检测。

兽药残留免疫检测技术应用进展

免疫检测技术 ( Immunoassays,IAs)是利用抗原与抗体在体外的特异性反应建立起来的检测技术。兽药属于小分子物质 ( MW<1 0 0 0 D) ,没有免疫原性 ,必须与大分子物质交联成人工抗原才能获得免疫原性。本文从兽药人工抗原的制备、抗体的制备、免疫检测方法的建立等三个方面对免疫技术在兽药残留检测的应用进行了综述 。

抗氯霉素单克隆抗体的制备与鉴定

本文用人工合成的氯霉素 -牛血清白蛋白 (CAP- BSA)免疫 BAL B/ C小鼠 ,通过杂交瘤技术建立了 2株分泌抗氯霉素的单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 1D1 0 和 5 E6 。经间接酶联免疫吸附试验 (ci EL ISA)检测细胞培养上清效价为 1∶ 5 12 ,诱生腹水的效价可达 1× 10 8。两株单克隆抗体的亚型为 Ig G1 ,杂交瘤染色体数目为 84～ 96条。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定。ci EL ISA检测显示其与常见抗生素及结构类似物的交叉反应小 ,其灵敏度为 0 .1ng/ ml,IC50 为 2 .38ng/ m l。

抗氟喹诺酮类抗生素单抗的研制及其检测应用

用与牛血清白蛋白交联的环丙沙星免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得1株能稳定传代并分泌抗氟喹诺酮类药物的单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞9H9,用杂交瘤细胞制备单克隆抗体腹水。单克隆抗体对环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、沙拉沙星、双氟沙星均有免疫反应,且50%抑制质量浓度分别为达到3.21、3.01、8.15、4.85、7.75、3.70、9.83、6.21、11.62、200.70 ng·mL-1。利用单抗建立了检测蜂蜜、鸡肉组织、牛奶中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶联免疫吸附测试(CI-ELISA)和免疫胶体金试纸条法。CI-ELISA方法的IC50及IC10分别为3.21 ng·mL-1和0.42 ng·mL-1。添加试验和特异性分析表明,免疫胶体金试纸条能用于检测蜂蜜、鸡肉组织、牛奶中的氟喹诺酮类药物残留,且检测上述样品中环丙沙星残留的灵敏度分别为5、20、30 ng·mL-1。

氟喹诺酮类药物的多残留酶免疫分析研究

以制备的多抗血清为基础,建立了氧氟沙星（OFL）、二氟沙星（DIF）和诺氟沙星（NOR）的多残留间接竞争酶免疫吸附测定法（Ci-ELISA法）。OFL、DIF和NOR的标准曲线的线性回归方程分别为y=-0.1984x＋0.9687（r=0.9885）、y=-0.1738x＋0.9150（r=0.9985）、y=-0.2004x＋0.9572（r=0.9954）;中值（IC50）分别为231.57、245.321、86.14 ng/ml;最低检测限（LOD）分别为1.62、1.861、.07 ng/ml;标准曲线在2～10000 ng/ml之间均有良好的线性关系（r≥0.9885）。方法的批内CV≤5.44%,批间CV≤12.45%。当OFL、DIF或NOR以浓度15～10000 ng/ml在牛奶中添加时,药物能较好地被回收,回收率均在71.70%～94.53%之间。

己烯雌酚特异性抗体的制备

【目的】制备抗己烯雌酚(DES)的高亲和力特异性抗体,建立检测DES的间接竞争ELISA标准曲线,为进一步研究DES快速检测试剂盒打下基础。【方法】应用DES人工免疫抗原免疫新西兰大白兔,采集抗DES的特异性抗血清,用KCjunior软件进行4参数非线性回归,建立检测DES的间接竞争ELISA标准曲线,各药物浓度在同一批次酶标板中做4次重复,共做4个批次对标准曲线进行评价,用己烷雌酚(HEX)、双烯雌酚(DIEN)、雌二醇(E2)、乙炔雌二醇(EE2)和L-酪氨酸(Tyr)来评价抗体的特异性。【结果】5只家兔免疫产生了抗DES的特异性抗血清,其中4号家兔抗血清效价达到了1﹕4096000竞争抑制效果最好,工作稀释浓度为1﹕1024000时,线性范围在0.01～50μg·L-1,标准曲线的IC50在0.71～1.0μg·L-1,R2在0.9952～0.9978。获得各标准浓度下B/B0的批内变异系数在0.52%～22.48%,批间变异系数在2.64%～19.51%。交叉反应试验表明,4号家兔抗血清对与DES结构相似的人工合成二苯乙烯类雌激素药物己烷雌酚(HEX)和双烯雌酚(DIEN)的交叉反应率分别为8.5%和38.5%,与天然雌激素类药物雌二醇(E2)和乙炔雌二醇(EE2)以及L-酪氨酸(Tyr)的交叉反应均小于0.001%。【结论】本文报道的抗体特异性好、亲和力高,可满足目前中国动物性食品安全评价检测的需要,为研究组织中DES残留检测的ELISA方法及其开发DES快速检测试剂盒奠定了基础。

检测牛乳中三聚氰胺的间接竞争ELISA方法的建立

利用戊二醛法合成的三聚氰胺—钥孔匙锥蓝蛋白(KLH)为免疫原制得三聚氰胺的多克隆抗体,并在此基础上以重氮法制备的三聚氰胺—牛血清白蛋白为包被抗原建立了检测三聚氰胺的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,理想的包被抗原质量浓度为0.8mg/L,抗三聚氰胺抗血清的稀释倍数为1:400,最适检测范围为0.03-10mg/L,最小检测量为0.01mg/L,批内与批间变异系数分别为1.952%和6.673%,回归方程为y=-0.4239-0.0933。本实验建立的三聚氰胺含量的间接竞争酶联免疫吸附试验(ci-ELISA)方法可用于牛乳样品中三聚氰胺残留的检测。

阿维菌素单克隆抗体的制备与鉴定

将与牛血清白蛋白(BSA)偶联的阿维菌素人工合成抗原AVM-BSA免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了2株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F2和2H10。生物学特性鉴定的结果表明,2株杂交瘤细胞株诱生腹水的效价为1∶6 400,分泌的抗体亚型均为IgM;间接竞争酶联免疫吸附试验结果表明,抗体的50%抑制质量浓度(IC50)为101 ng/mL,2株单克隆抗体与伊维菌素、多拉菌素、红霉素和白霉素均无交叉反应,证实单克隆抗体2H10具有很强的特异性,可用于阿维菌素药物残留免疫分析方法的建立。

青霉素单克隆抗体的制备及鉴定

用与细胞色素C交联的氨苄青霉素(Amp-Cy)免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗青霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞(1C1,2C11K和2G7),并分别制备它们的单克隆抗体腹水。3株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-6以上,1C1和2C11的抗体类型及亚类均为IgG1,而2G7为IgM,3株单克隆抗体的轻链均为κ链。3株单克隆抗体(1C1、2C11、2G7)的青霉素50%抑制质量浓度分别为45.3、60.1、80.0μg/L。间接竞争酶联免疫吸附试验(CI-ELISA)显示,3株单克隆抗体对青霉素类和先锋霉素类抗生素有特异性反应,而对链霉素、卡那霉素、氯霉素、土霉素、四环素、新霉素其他抗生素没有交叉反应,可用于青霉素类抗生素残留的检测。

抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定

构建了微囊藻毒素(Microcystin-LR,MC-LR)完全免疫原MCLR-KLH,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗MCLR单克隆抗体,用间接竞争ELISA方法筛选抗体。经过3次克隆,获得2株可稳定分泌抗MCLR单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水效价达1:8?104;IC50为0.81 ng?m L?1,最低检测限0.10 ng?m L?1,亲和常数3.8?108 L?mol?1,电泳结果显示抗体由1条重链和1条轻链组成,与MC-LR同系物MC-RR、MC-YR有较强的交叉反应,与MC-LW有弱交叉性反应,与河豚毒素无交叉反应。实验结果表明该抗体质量较好,将在微囊藻毒素的快速检测、产生机理等方面具有较大的科研和应用价值。

氯霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立检测动物源性食品中氯霉素(CAP)残留的间接竞争ELISA(ci-ELISA)方法。在CAP羟基(-OH)位点上引入活性基团羧基(-COOH)得到氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐法将CAP-HS分别与BSA和OVA偶联合成人工免疫原CAP-HS-BSA和包被抗原CAP-HS-OVA,用CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和ci-ELISA筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备抗CAP单克隆抗体;以CAP单克隆抗体为基础、CAP-HS-OVA为检测原建立ci-ELISA方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗CAP抗体的杂交瘤细胞株(2C4),抗体效价为4.8×10-5,利用2C4腹水优化得到ci-ELISA最佳试验条件:0.4μg/mL CAPHS-OVA 37℃包被2h;5%猪血清37℃封闭1h;1∶6.4×104 CAP单克隆抗体37℃孵育15min;1∶1 000羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)37℃孵育30min;室温显色9min。绘制的CAP残留ci-ELISA标准曲线为典型的S型,与4参数logit拟合曲线相吻合,半数抑制浓度(IC50)为0.53ng/mL。添加回收试验结果显示,阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3%~96.6%和93.7%~96.8%,批内变异系数分别为2.3%~5.0%和2.2%~4.6%,批间变异系数分别为2.7%~4.1%和2.3%~3.6%。HPLC对比试验结果显示,ci-ELISA与HPLC的测定结果无显著差异。本试验成功建立了CAP的ELISA残留检测方法,该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,可满足动物源性食品中CAP残留检测要求。

测定司帕沙星间接竞争酶联免疫检测方法建立及应用

目的建立快速、灵敏的司帕沙星残留间接竞争酶联免疫检测方法。方法采用混合酸酐法,将司帕沙星与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别合成免疫抗原(sparfloxacin-BSA)和包被抗原(sparfloxacin-OVA)。通过背部多点免疫法免疫大白耳兔,制备了抗司帕沙星的特异性抗血清。结果利用所获得的特异性抗血清,建立了测定司帕沙星的间接竞争酶联免疫检测方法(ci-ELISA),其线性范围为5ng/mL～2μg/mL(R2=0.9942),且与HPLC方法具有良好的相关性(R2=0.9918)。样品牛奶、大鼠血浆和尿液中的加样回收率分别为93.7～110.3%、105.6～113.3%和90.2～98.1%%。应用所建立的方法,对司帕沙星大鼠体内药物分析及药品中的含量进行了测定。结论本研究所建立的检测司帕沙星残留的酶联免疫检测方法具有样品处理简单,灵敏度高及分析速度快等优点,非常适合于生物样品分析及药品残留的筛选工作。

雪卡毒素人工抗原合成及鉴定

雪卡毒素是一种存在于珊瑚鱼中的海洋毒素,极低剂量就会引起中毒。为了建立雪卡毒素的免疫分析方法,必须合成其人工抗原才能制备抗体。以雪卡毒素的结构类似物莫能菌素为半抗原,采用琥珀酸酐法将其改造成莫能菌素-琥珀酰半酯(MON-HS),再用混合酸酐法将其与大分子载体牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,成功制备出了雪卡毒素人工抗原MON-HS-BSA和MON-HS-OVA。以MON-HS-BSA为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,以MON-HS-OVA为包被抗原,用间接竞争酶联免疫吸附法(Ci-ELISA)检测到小鼠血清中产生了雪卡毒素的抗体,说明已成功合成雪卡毒素人工抗原,该抗原可用于制备雪卡毒素单克隆抗体。

地方株马驽巴贝斯虫Bc48截短体单克隆抗体的制备及应用

本研究旨在建立马驽巴贝斯虫抗体的快速、准确检测方法。以纯化的马驽巴贝斯虫Bc48基因片段的原核表达产物免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并利用重组抗原与单克隆抗体建立间接竞争ELISA(CI-ELISA)方法检测马驽巴贝斯虫抗体。结果显示:制备出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H2、7F4、11F4,通过对CI-ELISA条件筛选得出,抗原最佳包被浓度为0.19μg·mL^-1,单克隆抗体11F4的最佳工作浓度为1∶3.2×10^5,通过检测30份马驽巴贝斯虫阴性血清及20份阳性血清,确定该检测方法临界值为45%;特异性试验发现,该CI-ELISA方法不与感染马泰勒虫病的阳性血清发生反应,具有特异性;用所建立的CI-ELISA检测临床血清90份,与标准c-ELISA试剂盒总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%。试验结果表明,该CI-ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。基于单克隆抗体(11F4)与重组蛋白(HIS-Bc48)所建立的CI-ELISA特异性、重复性好,可为新疆马驽巴贝斯虫的检测、监控提供有效手段。

Development of ELISA and immunochromatographic assay for ofloxacin

Two rapid, sensitive and reliable immunoassay methods, namely competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay (CI-ELISA) and colloidal gold-based immunochromatographic assay (CGIA), were developed to detect ofloxacin (OFL). The linear range of the CI-ELISA was from 0.5 to 128 ng/mL with a limit of detection (LOD) of 0.35 ng/mL. Good recoveries were obtained in analyzing simulated swine urine samples. The CGIA could accurately estimate OFL at concentrations as low as 10 ng/mL in less than 10 min, and test results were read visually without any instrument.

阿维菌素类药物单克隆抗体的制备和鉴定

将阿维菌素与牛血清白蛋白偶联,免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术获得了1株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株。用间接ELISA测定腹水的效价为1:160000,抗体的50%抑制药物浓度(IC50)为2.5ng/ml,抗体与伊维菌素的交叉反应为12.5%,与多拉菌素、莫西菌素均无交叉反应。

Study of Immunoassay Methods for Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) Using Competitive ELISA

Two different immunoassay methods, competitive indirect enzyme-linked immuno-sorbent assay (CI-ELISA) and amplificative competitive indirect ELISA (ACI-ELISA) using biotin-avidin complex system were studied to detect rhEPO. The linear ranges were 50-20000 ng/mL and 10-50000 ng/mL for CI-ELISA and ACI-ELISA, respectively. The low detection limits of CI-ELISA and ACI-ELISA were 62.8 ng/mL and 8.5 ng/mL, respectively.