2022-2023年山东省A(H1N1)pdm09流感病毒HA、NA基因变异特征分析

目的 了解山东省2022-2023流感监测年度分离的A(H1N1)pdm09亚型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因的变异特征,为流感的防控提供科学依据。方法 从流感监测网络实验室分离的流感毒株中按地市随机选取14株A(H1N1)pdm09亚型流感毒株,以WHO推荐的当季疫苗株为参考进行全基因组测序,并采用荧光法开展神经氨酸酶抑制(neuraminidase inhibition,NI)实验以评估药物敏感性。结果 山东省2022-2023年度分离的A(H1N1)pdm09流感病毒属于6B.1A分支中的5a.2a进化簇,核苷酸序列比对分析显示,HA和NA基因与2021-2023年度北半球疫苗株A/Victoria/2570/2019的亲缘关系较为接近,同源性分别为98.5%~98.7%和98.8%~99.1%。氨基酸序列分析显示,HA蛋白有20个位点发生了氨基酸序列变异,并发现1株病毒可能发生抗原漂移,有3株病毒发生了HA蛋白糖基化位点的缺失。NA酶相关重要位点未发生变异。NI实验显示,所测流感毒株均对抗流感病毒药物敏感。结论 所监测毒株与疫苗株整体同源性很高,但氨基酸存在一定程度变异,今后有必要持续开展流感病毒基因变异特征监测以了解流感流行的风险,以及评价基因变异对流感疫苗和治疗药物效果的影响。

基于SPARTA框架的HAS4决赛攻击路径分析

太空网络面临的安全威胁越来越多,美国自2020年起,连续四年举办黑掉卫星(Hack-A-Sat,HAS)挑战赛,并发射真实卫星“月光者”用于HAS比赛。太空攻击研究与战术分析框架SPARTA是针对太空网络安全的对抗战术和技术知识库。借助SPARTA框架,详细分析了第四届HAS决赛中攻击使用的战术技术,对于深入理解SPARTA框架、太空网络安全具有一定借鉴意义。

基于Galileo HAS服务的全球PWV反演验证分析

基于实时精密单点定位PPP的大气可降水量PWV反演技术近年来受到广泛研究,但目前该技术大多需利用网络通讯接收改正信息,这使其在通讯网络不能覆盖及因灾通讯受限地区的使用受到限制。2023年1月开通服务的Galileo系统高精度定位服务HAS(High Accuracy Service)为实现不依赖额外通讯手段的实时PWV反演提供了新手段。本文首先分析验证了Galileo系统HAS服务的卫星轨道和钟差改正信息精度,并将基于武汉大学IGS分析中心产品的PWV反演结果作为内部对比参考值、将基于ERA5数据及探空数据结果作为PWV结果对比的外部参考值,验证了基于HAS服务的PWV反演精度。结果表明HAS服务反演得到的PWV与两类参考值均具有较高的一致性。其中HAS服务计算得出的结果与IGS事后产品PWV解算结果的两序列差的RMS为2.91 mm,与探空数据的序列差的RMS为2.51 mm。初步验证了HAS可用于降雨的短时预报可行性。

HA/H_(2)O_(2)体系对磺胺噻唑降解的机理与效能

以盐酸羟胺/过氧化氢(HA/H_(2)O_(2))作为研究体系,考察其对于磺胺噻唑(STZ)的降解效能。文章考察了HA初始浓度、H_(2)O_(2)初始浓度、STZ初始浓度、pH、天然有机物(NOM)、阴离子(SO_(4)^(2-)、Cl-和NO_(3)^(-))对STZ降解的影响。结果表明:在pH值=3.0的条件下,HA/H_(2)O_(2)体系对STZ具有高效的降解效果,当HA的物质的量浓度由2 mmol/L增加到10 mmol/L时,对STZ的去除率从56.06%增加到85.26%;当H_(2)O_(2)的物质的量浓度从2 mmol/L增加到10 mmol/L时,对STZ的去除率从58.96%增加到85.26%,当STZ的物质的量浓度从2μmol/L增加到10μmol/L时,对STZ的去除率从98.72%降低到71.86%。随着pH的增大,STZ的去除率逐渐降低,在pH值>7的条件下对STZ的去除率可以忽略不计。向反应体系中分别投加5 mmol/L的SO_(4)^(2-)和5 mmol/L的NO_(3)^(-)都可以有效促进STZ的降解,而5 mmol/L的Cl^(-)则会抑制STZ的降解。当向体系中投加小于5 mg/L的NOM则对STZ的降解的影响可以忽略不计。测定了体系中共有17种降解产物,并推测STZ通过取代反应、羟基化反应等方式逐步被降解。通过明亮发光杆菌发光值变化分析降解过程中溶液毒性的变化,测定发现STZ降解过程中急性毒性不高。实际水体试验结果表明,HA/H_(2)O_(2)系统对二级出水中的荧光类物质具有较好的降解效果。

PRP联合HA治疗膝骨性关节炎疗效及安全性的Meta分析

目的探讨富血小板血浆(PRP)联合透明质酸(HA)关节内注射与PRP单独注射相比的疗效和安全性,为膝骨性关节炎(KOA)的治疗提供循证策略。方法查阅PubMed、Web of Science、中国知网(CNKI)、万方数据库,检索建库初到2021年10月公开发表的文献。纳入已发表的随机对照实验(RCT)或队列研究。研究对象为KOA患者,实验组为PRP联合HA关节内注射,对照组为PRP或HA关节内注射。对纳入RCT研究使用Cochrane手册风险评估工具进行质量评价,队列研究使用Newcastle-Ottawa Scale进行质量评价,用RevMan5.3软件对结局指标进行Meta分析。结果纳入10篇文献,共1110例患者,其中PRP组467例,PRP+HA组450例,HA组193例。Meta分析结果显示,PRP+HA组在治疗6个月后视觉模拟评分(VAS,MD:-0.31;95%CI(-0.60~-0.03);P=0.03)、西大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)评分(MD:-2.81;95%CI(-4.48~-1.13);P=0.001)、Lequesne指数(MD:-1.46;95%CI(-2.01~-0.90);P<0.00001)均显著优于PRP组;两组并发症发生率无统计学意义(RD:0.00;95%CI(-0.03~0.04);P=0.97)。结论PRP联合HA治疗KOA具有良好的临床治疗效果。基于此Meta分析,与单纯关节内注射PRP相比,PRP联合HA可提高治疗6个月后的WOMAC评分、VAS评分和Lequesne指数评分。在并发症发生率方面,两种治疗方案的安全性相似。

表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒构建及其免疫效果评估

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的二联疫苗候选株,试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统,以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体,构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的重组血清4型腺病毒;并通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、Westernblot试验以及SPF鸡保护性试验等方法,探究此重组病毒体外生物学特性并评估其为鸡提供的保护力。结果显示:研究成功构建能稳定表达H7N9禽流感亚型病毒HA蛋白的重组血清4型腺病毒,命名为FAdV4-H7;FAdV4-H7能在LMH细胞高效复制,并能在LMH细胞传代15次后仍能稳定表达HA蛋白;FAdV4-H7不仅高度致弱,而且能诱导机体产生高滴度针对H7N9亚型禽流感病毒HI抗体和FAdV-4的中和抗体,能为SPF鸡提供足够保护来抵抗致死性FAdV-4感染。研究表明,试验成功构建了重组病毒FAdV4-H7,为H7N9亚型禽流感病毒和FAdV-4的联防联控提供了二联苗候选疫苗株。

HA@Fe_(3)O_(4)修饰阳极增强微生物燃料电池降解类固醇雌激素

利用腐植酸(HA)与具有较强电容性的纳米Fe_(3)O_(4)颗粒形成的金属化合物(HA@Fe_(3)O_(4))修饰微生物燃料电池(MFC)阳极,探究含有以17α-乙炔基雌二醇(EE2)为代表性类固醇雌激素(SEs)的模拟废水在MFC阳极的降解特性,并对EE2降解过程中MFC的产电特性进行了表征。电化学交流阻抗测试结果表明,与不存在HA@Fe_(3)O_(4)的MFC相比,存在HA@Fe_(3)O_(4)的MFC的欧姆阻抗降低了79.58%,电荷转移阻抗降低了89.60%。循环伏安扫描结果显示,HA@Fe_(3)O_(4)的存在显著增加了阳极板的电容。HA@Fe_(3)O_(4)修饰阳极后MFC最大功率密度可达537.37 mW/m~2。HA@Fe_(3)O_(4)修饰的阳极可显著提高MFC对EE2的去除率,EE2在低浓度下(≤5.0μmol/L)可以介导电子转移,提高MFC的产电性能,进而提高MFC去除EE2的能力,但高浓度(5.0~10.0μmol/L)时会抑制微生物的活性并降低MFC产电效率。

HA-Al_(2)O_(3)复相陶瓷浆料的调制及其高精度光固化性能

利用高强度氧化铝(Al_(2)O_(3))作为增强相,可以改善生物活性材料羟基磷灰石(HA)的强度,但传统水热法制备的HA-Al_(2)O_(3)陶瓷无法实现孔隙大小和孔隙率的精确控制,而光固化增材制造技术可以利用高性能光固化浆料实现HA-Al_(2)O_(3)陶瓷的高精度成型。通过加入分散剂、光引发剂及光吸收剂,调节HA-Al_(2)O_(3)浆料状态,缓解HA粉末、Al_(2)O_(3)粉末和光敏树脂之间折射率不匹配而产生的严重散射效应。本研究探索了光引发剂和分散剂的种类和含量对浆料的影响,流变性和固化性能随着两者含量增加先改善后削弱,光引发剂和分散剂最佳用量分别为0.5%和4%(质量分数)。比较了石墨和甲基黄两种光吸收剂对提高打印精度的影响,虽然石墨对浆料的打印精度和流变性均有改善,但是降低了打印质量,因此确定甲基黄的用量为5.0×10^(-5),最终获得了适用于高精度打印的HA-Al_(2)O_(3)光固化浆料。

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白。

缺氧状态下has-miR-215-5p通过抑制BLCAP的表达调控子宫内膜腺上皮细胞增殖和迁移

目的探究缺氧状态下的子宫内膜腺上皮细胞(EEC)增殖和迁移的可能机制。方法分别提取缺氧(1%氧浓度,缺氧组)和常氧(21%氧浓度,常氧组)条件下EEC的RNA进行高通量测序(RNA-sequence),分析两组细胞中微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法对差异表达的miRNA即has-miR-215-5p进行鉴定,通过miRNA靶基因数据库网站(Target Scan)分析has-miR-215-5p的靶基因。Western Blot检测两组细胞中靶基因膀胱癌相关蛋白(BLCAP)的蛋白表达水平,细胞计数实验检测两组EEC的增殖情况,划痕实验检测两组EEC的迁移能力。结果测序结果显示,缺氧组EEC中has-miR-215-5p表达显著上升(P<0.001),RT-qPCR验证结果与测序结果一致。miRNA Target Scan数据库检索结果显示,BLCAP是has-miR-215-5p的下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验结果显示has-miR-215-5p与BLCAP-3’-UTR结合,结合位点突变后结合活性消失。Western Blot结果显示,与常氧组相比,缺氧组EEC中的BLCAP蛋白表达显著下降(P<0.001)。CCK-8及划痕实验分别提示与常氧组相比,缺氧组的EEC增殖能力显著降低、迁移能力显著增强(P<0.001)。结论缺氧条件下EEC中has-miR-215-5p可能通过与BLCAP-3’-UTR结合,抑制BLCAP的表达活性,导致EEC的增殖降低与迁移增强。

Has-miR-204-5p介导椎间盘退变和相关疼痛症状的发生:来自孟德尔随机化和生物信息学的证据

目的:挖掘椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)及其相关疼痛症状的新MicroRNA生物标志物并探索相关分子机制。方法:从已发表的文献和全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)Catlog数据库中获取MicroRNA、背部疼痛和坐骨神经痛的GWAS数据,从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载IDD相关的MicroRNA和mRNA表达数据。利用孟德尔随机化和生物信息学分析挖掘关键MicroRNA,并基于GeneMANIA数据库探索其靶基因的生物学功能。结果:孟德尔随机化分析结果表明,has-miR-204-5p与背部疼痛(GCST90018797,OR=0.9761)和坐骨神经痛(GCST90044614,OR=0.8957)均具有明显的因果效应。同时,生物信息学分析结果显示,has-miR-204-5p在IDD组织中明显低表达,其3个靶基因Ⅲ型胶原蛋白α1链(collagen typeⅢalpha 1 chain,COL3A1),核糖体蛋白侧柄亚基P1(ribosomal protein lateral stalk subunit P1,RPLP1)和转录因子4(transcription factor 4,TCF4)在IDD组织中异常高表达。此外,生物学功能富集分析揭示,3个靶基因主要富集在胶原蛋白、核糖体和Wnt信号通路等与IDD密切相关的生物学功能上。结论:HasmiR-204-5p是一种可靠的IDD生物标志物,在IDD及其相关疼痛症状中发挥重要作用。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

ORBIT评分与HAS-BLED评分对心脏瓣膜置换术后华法林抗凝出血风险的预测价值比较

目的比较ORBIT评分与HAS-BLED评分对心脏瓣膜置换术后华法林抗凝出血风险的预测价值。方法回顾性分析304例心脏瓣膜置换术后需行华法林抗凝治疗患者的病例资料,分别根据ORBIT评分和HAS-BLED评分对患者进行风险分层和分组,分析基于不同评分的风险分层与术后华法林抗凝出血事件的相关性,比较2种评分方法风险分层的一致性及其对出血事件的预测价值。结果304例患者中,出血患者32例、未出血患者272例,出血患者的术后ORBIT评分、HAS-BLED评分均高于未出血患者,差异有统计学意义(P<0.05)。基于ORBIT评分划分的中危、高危患者的出血风险分别为低危患者的6.092(95%CI:2.694~13.775)倍、9.373(95%CI:1.465~59.943)倍,基于HAS-BLED评分划分的中危、高危患者的出血风险分别为低危患者的3.750(95%CI:1.383~10.166)倍、14.250(95%CI:5.489~36.995)倍。受试者工作特征曲线分析结果显示,ORBIT评分预测华法林抗凝出血风险的曲线下面积(AUC)为0.646(95%CI:0.589~0.699),敏感度为46.88%,特异度为87.87%,最佳截断值为3分;HAS-BLED评分预测华法林抗凝出血风险的AUC为0.768(95%CI:0.717~0.814),敏感度为75.00%,特异度为69.85%,最佳截断值为2分;Delong检验结果显示,2种评分的AUC差异有统计学意义(D=0.122,95%CI:0.001~0.245,Z=1.962,P<0.05)。结论ORBIT评分和HAS-BLED评分对心脏瓣膜置换术后华法林抗凝出血风险均具有一定预测价值,其中HAS-BLED评分的预测效能更优。

负载RGD的PLA-HA骨仿生支架促进骨缺损早期修复的研究

目的:使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD)修饰骨仿生支架并探究其应用于大鼠股骨缺损区的成骨性能。方法:通过三维(3D)打印技术制备聚乳酸-羟基磷灰石支架(PLA-HA),在其表面修饰甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和RGD构建复合水凝胶支架PLA-HA/GelMA/RGD(PHD),扫描电镜(SEM)表征支架表面形貌,CCK-8实验评估骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖能力。将18只SD大鼠随机均分为3组(n=6)制备股骨缺损模型,分别植入PLA-HA/GelMA(PHG)、PHD支架,空白对照组不植入。于术后4周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,并对缺损区的股骨样本进行HE染色和Masson三色染色观察组织学形态。结果:SEM观察到支架和水凝胶孔径明显,同时水凝胶稳健的连接到支架表面;CCK-8结果显示与PHG组相比,PHD组显示细胞增殖活性更佳。术后4周,Micro-CT三维重建图像显示空白组和PHG组新骨形成较少,PHD组骨缺损内部见大量新骨形成,同时定量分析发现该组骨体积分数、骨小梁厚度均显著大于空白组和PHG组。组织学染色结果显示PHD组形成连续且致密的骨组织。结论:负载RGD的PLA-HA骨仿生支架在体外具有促进成骨细胞增殖的能力,同时在体内诱导大鼠股骨缺损区新骨形成,成功地实现了早期骨缺损修复。

基于磁控溅射的PEEK表面HA涂层构建及其生物安全性评估

目的:基于磁控溅射技术在PEEK表面构建羟基磷灰石(HA)涂层,并系统评估该方法的生物安全性。方法:磺化PEEK以增加结合面积,并利用磁控溅射技术在其上构建HA涂层;通过扫描电镜结合能谱分析检测构建效果;通过细胞黏附实验、细胞骨架荧光染色以及扫描电镜来评估细胞层面安全性;通过SD大鼠全身毒性评估材料在体安全性;通过金黄地鼠黏膜刺激实验评估材料口腔应用安全性。结果:利用上述技术可在PEEK表面成功构建具有梯度形貌的HA涂层;该涂层可促进细胞黏附、伸展与增殖;且无全身毒性,对动物体重与体内重要脏器HE染色均无显著性影响(P>0.05);同时该涂层在一定程度上减轻了单纯磺化带来的口腔黏膜刺激。结论:基于磁控溅射技术可稳定制备HA涂层,并满足临床应用的生物安全性需求。

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒构建及应用

为构建表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT),以连续覆盖HVT全基因组的Fosmid文库为基础,利用Red/ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将优化的携带Pec复合启动子的HA基因插入到HVT复制非必需区HVT053与HVT054位点处的95318~95319nt之间,获得了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组HVT(rHVT-H9-HA株),并对构建的毒株进行鉴定。结果显示,成功构建了含有HA基因的入门质粒pEntr-HA,通过Gateway克隆的LR反应将含有HA基因的表达盒转移到黏粒pFosC DEST的第53和54号基因之间形成pFosC HA;提取5个黏粒后,转染次代CEF细胞获得拯救重组病毒rHVT-H9-HA株。连续传代和动物试验结果表明,rHVT-H9-HA株毒价高,遗传稳定,可以克服母源抗体干扰,免疫持续期长,能够提供针对H9亚型禽流感的保护;同时也实现了一针防两病,效果明显优于灭活疫苗。本研究为H9亚型禽流感病毒重组HVT活载体疫苗的研制提供了技术支撑。

长春市2016—2020监测年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因特征分析

目的分析长春市2016—2020年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因特征,了解其变异情况及遗传进化特征。方法选取2016—2020年度甲型H1N1流感病毒分离株109株,PCR扩增HA基因并进行序列测定;利用生物信息学软件对分离株的HA基因进行进化和变异分析。结果长春市109株分离株与疫苗株A/California/07/2009的HA蛋白相比均有S84N、S162N和I216T共同的氨基酸位点变异,且有1株发生了HA蛋白D222N位点突变,提示此毒株可引起患者下呼吸道症状。109株病毒株的HA基因之间核苷酸同源性为96.9%~100%,氨基酸同源性为97.2%~100%。在进化树分析上,都属于6B.1大分支,并且随着时间的推移,HA在基因进化树上离早期疫苗株A/California/7/2009越来越远,同一年份里也有毒株位于不同的小分支内。结论长春市2016—2020年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因在不断的变异中,应持续进行监测,为预防甲型H1N1流感大流行提供参考。

pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建与验证

目的构建抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)与激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体,并在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中验证。方法设计特定的moesin^(T558A)、moesin^(T558D)基因突变引物,以pcDNA3/HA-moesin为模板,采用逆向PCR技术进行体外定点突变,以丙氨酸、天冬氨酸取代苏氨酸,获得抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体并测序。体外培养HUVECs,随机分为对照1组、pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组以及对照2组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组,pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组分别转染pcDNA3/HA空载体、pcDNA3/HA-moesin、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)、pcDNA3/HA-moesin^(T558D),对照1组与对照2组不予转染。转染24 h,收集细胞,采用实时荧光定量PCR法检测moesin mRNA表达,采用Western blotting法和免疫荧光法检测moesin蛋白表达。结果经测序,目的基因moesin^(T558A)、moesin^(T558D)序列完全正确,第558位苏氨酸分别突变为丙氨酸、天冬氨酸,抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建成功。pcDNA3/HA-moesin组moesin mRNA相对表达量显著高于对照1组和pcDNA3/HA空载体组(t分别为16.688、16.649,P均<0.05),而pcDNA3/HA空载体组与对照1组比较差异无统计学意义(t=1.925,P>0.05)。pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组moesin mRNA相对表达量均显著高于对照2组(t分别为13.809、9.260,P均<0.05),pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组与pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组比较差异无统计学意义(t=2.364,P>0.05)。Western blotting结果显示,pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin蛋白表达,而对照1组未观察到HA-moesin蛋白表达。免疫荧光结果显示,pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin荧光,而对照2组未观察到HA-moesin荧光。结论成功构建了抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体;经验证,这两种基因突变体均能促进moesin表达。

射干止咳胶囊镇咳作用及对RARs受体、HA、5-HT的影响

目的探讨射干止咳胶囊镇咳作用部位及潜在的作用机制。方法采用浓氨水诱发小鼠咳嗽模型,观察射干止咳胶囊镇咳作用的量效关系;采用电刺激豚鼠喉上神经引咳模型,观察射干止咳胶囊中枢性镇咳作用;采用机械刺激致辣椒素脱敏豚鼠咳嗽模型,观察射干止咳胶囊外周性镇咳作用;采用烟熏建立豚鼠慢性支气管炎模型,观察射干止咳胶囊对血管活性胺类物质组胺(HA)和5-羟色胺(5-HT)的影响。结果射干止咳胶囊在43.00、86.00、172.00 mg提取物·kg^(-1)剂量下具有降低小鼠咳嗽次数的作用(P<0.05或P<0.01)。射干止咳胶囊低、中、高剂量组在给药后30 min、60 min时,均无明显抑制电刺激豚鼠喉上神经引咳作用。射干止咳胶囊低剂量组在给药60 min,中剂量组在给药30 min,高剂量组在给药30 min、60 min时可显著抑制机械刺激所致的辣椒素脱敏豚鼠咳嗽(P<0.05)。与模型对照组比较,射干止咳胶囊低、中、高剂量组豚鼠血清中HA含量明显减少(P<0.05或P<0.01);射干止咳胶囊高剂量组豚鼠血清5-HT含量明显减少(P<0.05)。结论射干止咳胶囊的镇咳作用部位不在中枢,其外周性镇咳作用与抑制RARs受体有关,同时HA、5-HT等血管活性胺类物质也参与其中。

载二甲双胍PLGA/HA支架复合BMSCs植入对兔股骨缺损的修复作用观察

目的 观察载二甲双胍(Met)聚乳酸—羟基乙酸聚合物(PLGA)/羟基磷灰石(HA)支架复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)植入对兔股骨缺损的修复作用。方法 自新西兰兔双侧股骨中段获取BMSCs培养传代,分别以0、0.1、1、10 mmol/L的Met处理BMSCs,检测BMSCs活力及成骨分化能力,筛选Met适宜作用浓度。采用溶剂浇铸—粒子沥滤法制备PLGA/HA支架和PLGA/HA/Met支架,将BMSCs分别与2种支架复合,Hochest染色观察BMSCs的黏附增殖情况。将16只新西兰兔采用钻孔法构建兔股骨骨缺损模型,并随机分为Blank组、PLGA/HA组、PLGA/HA/BMSCs组、PLGA/HA/Met/BMSCs组,每组4只;Blank组不做任何处理,PLGA/HA组植入PLGA/HA支架,PLGA/HA/BMSCs组植入复合1×10^(6)个BMSCs的PLGA/HA支架,PLGA/HA/Met/BMSCs组植入复合1×10^(6)个BMSCs载Met的PLGA/HA支架。支架植入术后4周采用ELISA法检测血清骨钙素;支架植入术后8周观察骨缺损修复情况,碱性磷酸酶染色观察组织切片骨化程度,采用RT-PCR法检测缺损处骨组织中的CollagenⅠ、RUNX-2 mRNA。结果 Met可激活BMSCs并促进其成骨分化,浓度为1 mmol/L时,其促进成骨分化作用最佳。BMSCs可与PLGA/HA支架及PLGA/HA/Met支架黏附并在其内增殖。支架植入术后4周,Blank组、PLGA/HA组、PLGA/HA/BMSCs组、PLGA/HA/Met/BMSCs组血清骨钙素水平依次增高(P均<0.05);支架植入术后8周,四组股骨缺损处骨痂渐明显且骨缺损渐缩小,碱性磷酸酶染色蓝色面积依次增加且渐深,股骨缺损处CollagenⅠ、RUNX-2 mRNA表达水平依次增高(P均<0.05)。结论 Met可激活BMSCs并促进其成骨分化,PLGA/HA支架可作为Met的载体和缓释体,将Met和BMSCs装载于PLGA/HA支架构建PLGA/HA/Met/BMSCs支架可更好地促进兔股骨缺损的修复。