APAAP桥联酶标技术的建立及初步应用

本文运用淋巴细胞杂交瘤技术获得5个产生抗碱性磷酸酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,同时设计一种改良ELISA方法用于筛选抗碱性磷酸酶单克隆抗体。筛选出的单克隆抗体能与碱性磷酸酶结合形成可溶性的复合物,即碱性磷酸酶一抗碱性磷酸酶抗体(APAAP)复合物。这些APAAP复合物仍保留有较高的酶活性,并可改良ELISA方法确定其酶一抗酶抗体的配制比例。在免疫组化染色中,APAAP复合物通过桥联二抗及显色系统能在组织原位较好地显示与一抗相对应的抗原物质。这种APAAP桥联酶标记技术显色鲜明,染色背景清晰,染色后的组织形态仍保存完好。APAAP桥联酶标记技术结合免疫金银染色进行免疫组化双重标记也取得了满意的标记效果。初步应用结果表明APAAP桥联酶标记技术是一种简便、灵敏、易于推广的实用免疫组织化学方法。

抗碱性磷酸酶单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其APAAP的制备与初步鉴定

本文报道用碱性磷酸酶Sigma Ⅰ型粗酶免疫Balb/c小鼠,采用酶联免疫吸附反应筛选细胞融合后杂交瘤培养上清,最后获7株稳定分泌抗碱性磷酸酶单抗的杂交瘤细胞株,对其中6株进行了特性鉴定。取其中1株AAP1/323腹水制成APAAP试剂盒,应用于ELISA和免疫组化染色表明:该试剂盒灵敏度高,本底低,无内源性酶干扰现象,对比好,背景清晰,结果容易判断,能满足临床检测的要求。

分泌高效价抗碱性磷酸酶McAb杂交瘤系的建立及其在APAAP免疫组化研究中的应用

用碱性磷酸酶长程多途径免疫BALB/C小鼠,采用反向间接ELISA法筛选融合孔上清,获得2株稳定分泌抗碱性磷酸酶McAb杂交瘤细胞株,腹水效价比国外报道高15～30倍,在APAAP免疫组化检测CD抗原、病毒抗原、肿瘤抗原以及细菌菌毛抗原等研究中均获得满意结果。

APAAP免疫印迹技术对抗副流感病毒1，3型单克隆抗体识别抗原表位的研究

副流感病毒１，３型（ＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓｔｙｐｅ１，３：ＰＩＶ＿１．３）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）应用免疫印迹技术（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）识别抗原表位特性。结果表明：ＰＩＶ＿１．３抗原经还原剂处理后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ５％～１５％梯度胶电泳，能分辨二十多条清晰的蛋白带。转印后采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物（ＡＰＡＡＰ）染色，本底浅，呈玫瑰红色带，优于ＨＲＰ染色结果。ＰＩＶ＿１的５株ＭｃＡｂ：ＩＣ＿５、ＩＨ＿６、ＩＨ＿２、ＩＣ＿１０、３Ｄ＿５分别与６８ｋＤ～５０ｋＤ、６８ｋＤ、５８ｋＤ～２７ｋＤ、５５ｋＤ～５０ｋＤ、５０ｋＤ对应ＰＩＶ＿１的蛋白质抗原表位起反应。ＰＩＶ＿３的６株ＭｃＡｂ：２Ａ＿１０、５Ｇ＿３、２Ｄ＿１１、２Ｅ＿１０、２Ｂ＿１２、４Ｆ＿１２与７０ｋＤ、６８ｋＤ、６０ｋＤ～５０ｋＤ、５５ｋｐ～４０ｋＤ、５５ｋＤ、４０ｋＤ对应的蛋白质抗原表位特异结合，说明ＰＩＶ＿１．３的１１株ＭｃＡｂ同对应抗原表位点的结合分布较广，有利于对ＰＩＶ＿１．３抗原的快速、敏感、特异检测。

应用APAAP光镜技术发现两株HFRSV敏感细胞中HFRSV包涵体

本文应用抗HFRSV McAb的APAAP(碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶)免疫组化技术,首次用光镜在HFRSV感染8—14天的Hep-2和wish细胞中查出病毒包涵体,并且根据其位置和形态特征可分为:(1)中央型包涵体;(2)外周型包涵体;(3)脱落包涵体。上述所见包涵体均在电镜下得到证实。此结果对于了解HFRSV感染细胞后的致病变作用以及研究HFRSV感染细胞包涵体的特征、来源、性质和形成过程具有十分重要的意义。

MPO的APAAP法检测对急性白血病分类的价值

89例具有髓系特征的急性白血病(AL)患者单抗检测抗髓系过氧化物酶(抗MPO)阳性率为93.2%,高于POX阳性率(78.7%);抗MPO在POX(+)组的检测水平高于POX(一)组.在代表髓系特征的抗原检测中,抗MPO阳性率明显高于CD_(33)、CD_(11C)、CD_(14).本文尚分析了抗MPO其他意义.认为碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)法检测MPO对AL分类中髓系特征的判断具有敏感性好、特异性高的优点.

APAAP高敏感信号放大技术在乳腺癌HPV DNA原位杂交检测中的应用

目的 探讨原位杂交 APAAP信号放大技术检测福尔马林固定 石蜡包埋乳腺癌组织HPV感染的实用性。方法 利用HPV通用型及亚型特异性探针 ,设定 4种杂交检测程序对 73例进展期乳腺癌和 34例乳腺良性病变进行HPVDNA原位杂交 APAAP信号放大检测。结果 在适宜的杂交程序下 ,39 19%的乳腺癌病例检测到HPVDNA ;良性病变中仅 1例 (2 94 % )纤维腺瘤检测到HPVDNA ,明显低于乳腺癌组 (P <0 0 1)。乳腺的大汗腺样化生区有细胞核阴性 细胞浆着色的假阳性反应 ,假阳性反应不足以被 1mmol L左旋咪唑阻断 ,但能被 0 2mol L盐酸前处理所消除。APAAP信号检测各步骤间的不同缓冲液可影响杂交结果。结论 只要杂交条件得当 ,原位杂交 APAAP检测技术在乳腺组织HPV感染研究中可获得满意结果。乳腺大汗腺样化生区内源性碱性磷酸酶含量较高 ,低浓度盐酸前处理有消除内源性碱性磷酸酶作用。

APAAP法测定脐血T淋巴细胞亚群水平的探讨

采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶反应（ＡＰＡＡＰ）法检测足月新生儿脐血Ｔ淋巴细胞亚群，并与健康儿童进行比较，结果显示：脐血ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ４／ＣＤ８表达率均值低于健康儿童，二者呈现显著性差异（Ｐ＜００５）；脐血ＣＤ８表达率低于健康儿童，但二者无差异（Ｐ＞００５）。

单克隆抗体用于APAAP桥联酶标技术快速检测副流感病毒3型抗原的研究

作者将副流感病毒3型(PIV-3)单克隆抗体(McAb)用于APAAP桥联酶标技术快速检测患儿PIV-3抗原100例,并与IFA技术及血凝抑制试验(HAI)作了比较,获得满意效果。其与IFA的阳性和阴性符合率均>96％。与HAI的阳性符合率为88％,阴性符合率为100％。由于呼吸道细胞内很少含有碱性磷酸酶,因此没有内源酶的干扰。另外,此技术不需荧光显微镜,一般光学镜下染色格外清晰,两小时可得到准确结果。

APAAP桥联酶标技术

当前免疫组化技术由于方法上的不断改进和革新,正以惊人的速度向前发展。多年来在实际应用中大多数人都采用辣根过氧化物酶作用于底物呈现颜色,但用碱性磷酸酶、抗碱性磷酸酶(简称APAAP)者少有报道。我室在使用该试剂后,经反复试验和对比取得了满意的染色效果。现介绍如下:

甲型肝炎患者PBMC中HAV-Ag的APAAP检测法及HAV-Ag检出的意义

目的 建立检测甲肝患者外周血单个核细胞(PBMC)中甲肝病毒抗原 (HAV- Ag)的 APAAP方法 ,并对5 2例甲肝患者 PBMC中 HAV- Ag进行动态检测 .方法 应用抗 HAV- Mc Ab,羊抗鼠 Ig G及 APAAP建立了三层重叠的APAAP法 .对 5 2例甲肝患者急性期及恢复期 PBMC进行动态检测 ,对 HAV- Ag阳性率及平均阳性细胞百分率及其与甲肝病程的相关关系进行了分析 .结果 替代试验及阻断试验证明本方法特异性及敏感性好 ,结果可靠 .甲肝患者急性期PBMC中 HAV- Ag阳性率 (5 4.7% )及阳性细胞百分率[(14.2± 8.4) % ]明显高于恢复期 [6 .45 % ,P<0 .0 5 ;(1.8±0 .8) % ,P<0 .0 1];随着病程的延长 ,HAV- Ag阳性率及阳性细胞百分率逐渐下降 ,与病程存在显著负相关 (r=- 0 .99,P<0 .0 0 1;r=- 0 .98,P <0 .0 0 1) .结论 在甲肝病发过程中 ,患者 PBMC中有 HAV- Ag一过性出现 ,提示 HAV一过性侵犯了 PBMC.

腺病毒3、7型单抗制备及用于IFA和APAAP快速诊断

人类的腺病毒(Adenovirus Adv)至今已发现42个血清型,其中AdV 3、7型在人群中流行最为广泛,是引起婴幼儿肺炎和成人呼吸道感染的重要致病原。Adv肺炎的婴儿,病情重,病死率高,且75％的患儿出现持续高热,具有较强的传染性。为了临床快速诊断此病,作者制备出Adv-McAb,运用APAAP桥联法和IFA法,同时对180例标本进行抗原检测,获满意效果。

单克隆抗体连接APAAP桥联酶标技术用于单疱性角膜炎的病毒抗原检测

将单克隆抗体连接APAAP桥联酶标技术用于免实验性Ⅰ型单纯疱疹病每性角膜炎病毒抗原的检测,确定了该方法的敏感性和诊断效果,通过与组织培养病毒分离法和间接免疫荧光法比较,提示APAAP复合物免疫酶标技术是用于诊断实验性单疱性角膜炎的一种简便、快速、特异和敏感的方法。

应用APAAP桥联酶标法快速检测呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(RSV)足婴幼儿下呼吸道感染的主要病原之一有关RSV的免疫荧光和ELISA的快速检测国内外已有报导。免疫荧光和ELISA需要一定的仪器。而APAAP桥联酶标技术只需一部普通的显微镜。更适合一般的基层使用。我们从1989—1990年应用此技术检测了230人份,现将结果报告如下:

APAAP、SP和SAP法检测TL-亚群的观察评价

目的:对 TL-亚群的三种免疫细胞化学检测方法:APAAP、SP 和 SAP 法进行比较分析并做出评价,以提高 TL-亚群检测工作的质量。方法:分别以 APAAP 与 SP 配对检测30例标本,SP 与 SAP 配对检测30例标本,将 SP 法固定液由95%乙醇改为1%戊二醛,并对两组配对检测结果进行统计分析。结果:APAAP 与 SP 配对组中,CD_3^+和 CD_4^+的测定结果有显著性差异(P<0.01和P<0.05),但两法检测结果相关分析有显著意义(P<0.01),SP 与 SAP 配对组中,两法检测结果配对 t 检验无显著性差异(P>0.05),且显著相关(P<0.01)。结论:SAP和 SP 是目前免疫细胞化学染色法(人工计数)测定 TL-亚群的最好方法,SP 法的固定液改用1%戊二醛效果较好。

APAAP桥联酶标技术快速诊断合胞病毒

本文报告应用 APAAP 桥联酶标技术,对116例急性下呼吸道感染的患儿,进行合胞病毒抗原快速诊断研究,并与免疫荧光(IFA)技术对照.二者阳性符合率98.00%,阴性符合率95.38%,准确性为96.55%.进一步证明:APAAP 桥联酶标技术特异性好、敏感性高,用于呼吸道细胞检测,无内源性酶的干扰,且操作简便,无需荧光显微镜,利于基层推广应用,优于 IFA 技术,是较为理想的合胞病毒感染的快速诊断技术;若与 IFA 技术联用,可提高阳性检出率.

用改良的APAAP法检测精神分裂症病人外周血T淋巴细胞亚群

用改良的APAAP法检测41例精神分裂症患者T淋巴细胞亚群，结果I型精神分裂症组外周血CD3^+、CD4^+明显减少（分别为P＜0．01，P＜0．05），CD8^+虽有增高但无显著性差异（P＞0．05），CD4^+／CD8^+比值明显下降（P＜0．01）。Ⅱ型精神分裂症组外周血CD3^+、CD4^+无明显降低（P＞0．05），CD8^+明显升高（P＜0．01），CD4^+／CD8^+比值明显下降（P＜0．01）。提示精神分裂症患者存在细胞免疫功能障碍，而这种免疫功能障碍与精神分裂症分型有关。

RSV-McAb用于APAAP桥联酶标快速诊断

作者将抗合胞病毒单克隆抗体用于APAAP(硷性磷酸酶抗硷性磷酸酶)桥联酶标诊断109例,同时全部以IFA(免疫荧光)技术作对照,获得满意效果(其阳性符合率达97.2％)。用APAAP技术来诊断RSV-Ag主要优点是:它不需要特殊设备,在普通光学镜下(10×40),结果清晰易辨,整个操作只需1 1/2小时,适于在基层医院进行呼吸道合胞病毒抗原的快速诊断。 由于呼吸道细胞内几乎不含有硷性磷酸酶,所以勿需担心内源酶对诊断的干扰,作者认为这是APAAP技术来诊断患儿鼻咽部脱落细胞内的RSV-Ag获得满意效果的主要原因之一。

APAAP—ELISA试验条件的优选

报导了APAAP—ELISA的影响因素,优选了实验最佳条件,在此基础上完成了与传统ELISA的平行对比实验,指出了APAAP—ELISA之优缺点,强调了发展和推广该技术急需克服的问题。