CCK-8对LPS作用下巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响

目的探讨八肽胆囊收缩素（CCK-8）对LPS活化的巨噬细胞B7．1和B7．2表达及其协同刺激功能的影响。方法用CCK-8（10^-12～10^-6）mol·L^-1和（或）脂多糖（LPS）孵育小鼠腹腔巨噬细胞，采用流式细胞术分析细胞表面B7．1和B7．2含量的变化，用免疫磁珠从小鼠脾细胞分离CD4^＋T细胞，按4：1数量比与腹腔巨噬细胞[预先用LPS、CCK-8和（或）抗B7．1抗体、抗B7．2抗体、CCK1R拮抗剂CR1409、CCK2R拮抗剂CR2945孵育24h]共同体外培养，同时加入ConA5mg·L^-1，采用^3H参入法测定CD4^＋T细胞增殖反映巨噬细胞的协同刺激活性。结果CCK-8可以下调LPS诱导的巨噬细胞的B7．1和B7．2表达，抑制LPS活化的巨噬细胞的协同刺激活性。CCK-8的作用呈剂量依赖性，最大效应剂量在（10^-7-10^-9）mol·L^-1之间。CR1409及CR2945均能逆转CCK-8的上述作用，且CR1409的作用较CR2945更明显。抗B7．1抗体和抗B7．2抗体可减轻LPS活化的巨噬细胞协同刺激活性。结论CCK-8通过下调LPS诱导的巨噬细胞B7．1和B7．2表达而抑制其协同刺激活性，该作用由CCK1R及CCK2R介导，其中CCK1R起主要介导作用。

γ-干扰素诱导Jurkat细胞表达B7.1/CD80、B7.2/CD86分子

目的研究观察γ 干扰素 (γ IFN)诱导Jurkat细胞株表达B7.1、B7.2分子的作用。方法不同浓度的γ IFN体外孵育Jurkat细胞 48h后 ,流式细胞仪检测细胞表达B7.1、B7.2的百分率。结果与对照组相比 ,γ IFN在312 .5～ 10 0 0 0u/ml浓度下有轻微提高Jurkat淋巴白血病细胞表达B7.1、B7.2分子的作用。在 2 5 0 0u/ml浓度时达到高峰 ,B7.1的表达比对照组提高 3.47% ,B7.2表达提高 2 .39% ,B7.1与B7.2双表达提高 1.85 %。结论γ IFN可轻度诱导Jurkat细胞表达B7.1、B7.

同时表达4-1BBL B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠肝癌细胞系的建立和意义

目的:建立同时表达4-1BBL、B7.1及B7.2三个共刺激分子基因小鼠原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)细胞系。方法:将B7.1和B7.2全长cDNA的质粒酶切,构建pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子,酶切法鉴定。用阳离子脂质体(LipofectamineReagent)将重组子转染H22,经均霉素(Hygromycin,300!g/ml)筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86+细胞。逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测目的基因在H22-CD80/CD86+变异株的表达。采用同样方法将pCI-neo-4-1BBL质粒转入H22-CD80/CD86+细胞,G418筛选,阳性克隆命名为H22-CD80/CD86/CD137L+细胞。流式细胞仪检测三种基因在细胞克隆中的表达。结果:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子经酶切鉴定,同时获得B7.1(862bp)和B7.2(984bp)目的基因片段和5.6kbp线性化pcDNA3.1载体片段;重组子测序结果与Genebank中B7.1和B7.2序列相符,证实构建成功。RT-PCR及FCM检测结果显示B7.1、B7.2及4-1BBL基因分别在H22-CD80/CD86+细胞及H22-CD80/CD86/CD137L+细胞中获得稳定、高效联合表达。结论:pcDNA3.1-B7.1-IRES-B7.2重组子构建正确,H22-CD80/CD86/CD137L+变异株可同时稳定表达B7.1、B7.2和4-1BBL三个共刺激分子基因。

约氏疟原虫子孢子感染对大鼠腹腔巨噬细胞B7.1、B7.2分子表达的影响

目的研究约氏疟原虫感染后协同刺激分子B7.1、B7.2在大鼠腹腔巨噬细胞的表达情况,探讨B7.1、B7.2分子在宿主抵抗疟原虫感染免疫中的作用。方法利用约氏疟原虫感染大鼠的动物模型,分别在感染约氏疟原虫子孢子后2、12、24、48、72h分离获得大鼠腹腔巨噬细胞,通过免疫荧光及激光扫描共聚焦显微镜技术定量分析B7.1、B7.2分子表达情况。结果在宿主感染约氏疟原虫后巨噬细胞B7.1、B7.2分子表达增加;B7.1上调较缓慢,并在72h后出现回落;B7.2上调非常迅速,在48h达到峰值,从72h开始略有下降;在所选时间范围内B7.2的表达水平始终高于B7.1(P<0.05)。结论疟原虫子孢子感染大鼠后,B7.1、B7.2分子表达水平发生改变,提示协同刺激因子参与了宿主免疫系统活化,推测该现象与受疟原虫感染哺乳动物机体的免疫防御、免疫调控密切相关。

小鼠白细胞介素18基因克隆、测序及重组质粒pIRES-IL18-B7.1的构建

目的 :克隆小鼠白细胞介素 1 8( m IL- 1 8)编码区的 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用逆转录多聚酶链反应 ( RT- PCR)法 ,以小鼠脾细胞 m RNA为模板 ,扩增获得全长 m IL-1 8,与 p MD1 8T连接作全自动测序 ,并利用基因重组技术构建包含 m IL- 1 8和 B7.1的双基因表达质粒 p IRES- IL1 8- B7.1。结果 :经测序证实获得的 m IL- 1 8序列与文献报道完全一致 ,并成功构建了表达质粒。结论 :成功克隆了 m IL- 1 8的 c DNA,并构建了双基因表达载体 p IRES- IL1 8- B7.

ZnPcS_2P_2介导的光动力疗法联合mGM-CSF、mB7.1基因修饰的瘤苗治疗小鼠淋巴瘤

目的研究两亲性酞菁锌光敏剂ZnPcS2P2介导的光动力疗法(ZnPc-PDT)联合GM-CSF、B7.1基因修饰的EL-4细胞,对小鼠淋巴瘤的抑制作用。方法应用反复多次转染的方法,分别将逆转录病毒pLXSN、pLXSNmGM-CSF、pLXS-NmB7.1导入EL-4细胞,分别命名为EL-4/pLXSN、EL-4/GM和EL-4/B7。进行ZnPc-PDT时,经荷瘤小鼠的尾静脉注射ZnPcS2P2,4h后局部用波长670nm的激光照射瘤体;光源为670nm的半导体激光仪。将40只荷瘤小鼠分为5组,每组8只,即对照组(不做任何处理)、EL-4/B7+EL-4/GM对照组、ZnPc-PDT对照组、ZnPc-PDT+EL-4/pLXSN对照组、ZnPc-PDT+EL-4/B7+EL-4/GM实验组。隔天测量瘤块的大小,观察荷瘤小鼠淋巴瘤的生长情况,并计算瘤块的相对体积(RTV)。观察荷瘤小鼠的生存期及瘤组织的病理学改变。结果实验组的生存率高于各个对照组(P<0.01)。Zn-Pc-PDT组小鼠的生存期略高于EL-4/B7+EL-4/GM组(P=0.01)。结论mB7.1、mGM-CSF基因修饰的瘤苗可显著增强ZnPc-PDT的抗肿瘤效应。

肝癌细胞稳定转染B7.1后的免疫学特性

目的探讨赋予肝癌细胞第二信号分子B7.1、增强癌细胞与淋巴细胞之间的识别与激活作用 ,从而达到增强淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤或抑制作用。方法利用逆转录方法 ,转染B7.1分子至包装细胞系PA317。筛选获得高滴度的克隆后 ,以病毒上清感染肝癌细胞 ,使其表达B7.1分子 ,最后以LDH释放法测定LAK细胞的细胞毒活性。结果肝癌细胞可稳定表达B7.1分子 ,阳性率达94.3% ,未转染的细胞无表达 ;其所诱发的LAK细胞的细胞毒活性明显强于未转染的肝癌细胞组(P<0.01)。结论B7.1分子在淋巴细胞与癌细胞之间的识别过程中起着重要作用 ,可介导淋巴细胞对癌细胞的粘附和识别 ,从而增强淋巴细胞的杀伤作用。这一结果可为今后进一步深入研究B7.1的作用机制 ,以及与其它细胞因子、粘附分子的相互作用打下基础。

GHA预激化疗方案对难治性急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征的疗效及其与共刺激分子B7.1表达的关系

本研究探讨G-CSF联合高三尖杉酯碱(homoharringtonine)和小剂量阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)的GHA预激化疗方案治疗难治性急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)的临床疗效和不良反应,寻求高效低毒的新型化疗方案,探索其与共刺激分子B7.1的关系。应用GHA标准预激化疗方案G-CSF[200μg/(m2·d)皮下注射,第1-14天];高三尖杉酯碱[1mg/(m2·d)静脉点滴,第1-14天];阿糖胞苷[10mg/m2,皮下注射,每12小时1次,第1-14天]治疗79例难治性急性髓系白血病和21例骨髓增生异常综合征,与传统MA方案化疗组比较,观察临床疗效和不良反应、治疗相关死亡率并随访。应用免疫荧光法检测各组肿瘤细胞上共刺激分子B7.1的表达并与临床疗效比较。结果表明:GHA预激化疗治疗后难治性AML缓解率60.7%(完全缓解率43%,部分缓解率17.7%),治疗MDS有效率52.4%。粒细胞缺乏发生率25%,平均持续时间3.5天。重症感染发生率3%,无严重出血、消化道反应,心、肝、肾功能损害轻微,患者均痊愈。治疗相关死亡率为零。AML-M2组、AML-M5组完全缓解率较高(60.9%,61.9%),最长持续缓解期已4年。各组肿瘤细胞上共刺激分子B7.1表达阳性率差异较大(0%-66.7%),正常对照组为0,AML-M2组和AML-M5组明显高于其它AML组和正常对照组,且表达率与预激化疗疗效呈正相关。结论:GHA预激化疗方案治疗难治性急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征疗效肯定,不良反应较轻,无严重毒副作用和治疗相关死亡率,无病生存期长,是高效低毒的新型化疗方案。肿瘤细胞上共刺激分子B7.1表达可能与预激化疗疗效有关,其机理尚需进一步研究。

B7.1及SEA基因共转染肝癌细胞的初步研究

目的获得可表达共刺激分子B7.1和超抗原分子SEA的肝癌细胞株，检测其表达。方法用免疫组织化学方法，筛选表达B7.1及SEA的肝癌细胞阳性克隆。用流式细胞仪检测B7.1表达的阳性率，ELISA检测上清中SEA的含量。结果获得表达B7.1和SEA的肝癌细胞株，培养上清中SEA的含量达10～14×10-8g/L。结论建立了免疫细胞在肝癌细胞上的SEA和B7.1联合识别效应系统。

腺病毒载体介导的人类B7.1基因修饰的肿瘤细胞疫苗

为了证明腺病毒载体可做为将Ｂ７基因导入肿瘤细胞的替代载体，达到提高肿瘤细胞疫苗效应的目的，且不存在逆转录病毒载体的局限性，用同源重组的方法构建了表达人类Ｂ７．１ｃＤＮＡ的重组人类５型腺病毒（ＡｄＢ７．１），并用它感染小鼠乳腺癌细胞系ＥＭＦ６和大鼠神经胶质瘤细胞系Ｃ６，检测Ｂ７．１基因在感染过的肿瘤细胞中的表达；用ＡｄＢ７．１感染过的肿瘤细胞给同基因宿主（ＢＡＬＢ／ｃ小鼠和Ｗｉｓｔａｒ大鼠）接种，观察它们在体内的致瘤性及对肿瘤的防治作用；用５１Ｃｒ－释放法对用各种肿瘤细胞免疫后３周的动物脾淋巴细胞进行ＣＴＬｓ杀伤活性的测定，来检测其细胞免疫活性。结果的Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明：ＡｄＢ７．１感染过的肿瘤细胞表达了Ｂ７．１基因。接种／侵袭实验和ＣＴＬｓ杀伤活性的测定实验表明，与野生型肿瘤细胞相比，表达Ｂ７．１的肿瘤细胞在动物体内的致瘤性降低（Ｐ＜０．０１），能诱导针对野生型肿瘤的高水平的系统性免疫应答和细胞毒Ｔ细胞活性，对肿瘤也有一定的防治作用。本研究的结论是，腺病毒载体可代替逆转录病毒载体将Ｂ７．１基因导入肿瘤细胞，提高肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤作用。它操作简单，感染效率高。

抗CD28+B7.1单抗共刺激T细胞诱导肝癌细胞凋亡的第二信使系统研究

目的 :探讨T淋巴细胞活化、增殖、诱导肝癌细胞凋亡过程中第二信使系统的调控机制。方法 :用CD2 8+B7 1(CD80 )单克隆抗体共刺激T淋巴细胞诱导肝癌细胞 (BLE 740 2 )凋亡 ,测定不同诱导时间T细胞内cAMP、cGMP和Ca2 + 的浓度改变及肝癌细胞凋亡情况。结果 :活化的T淋巴细胞中 ,cAMP浓度在初期短暂升高 ,继而快速下降 ,作用于肝癌细胞后逐步回升至 1～ 2倍 ,而细胞内cGMP的浓度急剧升高 6～ 7倍 ,Ca2 + 浓度也显著增加 2～ 3倍 ,且均在第 4天达最高值 ,与癌细胞的凋亡呈正相关。结论 :T淋巴细胞内第二信使系统cAMP、cGMP和Ca2 + 的水平与细胞的活化增殖、杀伤效应密切相关。

小鼠肝癌细胞系Hepa16 B7.1瘤苗抗肿瘤免疫的实验研究

目的 :研究小鼠肝癌细胞系Hepa1 6转染B7.1基因后在体内外抗肿瘤免疫的作用 .方法 :采用脂质体介导的方法用pLXSNB7.1转染PA3 17包装细胞 ,经G4 18筛选出高滴度阳性的细胞克隆 ,以流式细胞仪检测B7.1分子的表达情况 ;用所获病毒上清进一步感染Hepa1 6细胞 ,观察转染B7.1基因后Hepa1 6细胞作为肿瘤疫苗在体内外诱发抗肿瘤免疫的情况 .结果 :Hepa1 6/B7.1高表达B7.1分子 ,其致瘤性明显降低 ,接种小鼠后成瘤率为 2 0 % ,而亲代Hepa1 6细胞成瘤率为 10 0 % .转B7.1基因肿瘤细胞疫苗可抑制肿瘤生长速度 ,延长荷瘤小鼠生存期 ;且转B7.1基因肿瘤细胞疫苗具有保护性免疫反应 .结论 :转B7.

B7.1基因的表达对肝癌细胞生物学特性的影响

目的 观察B7 1基因表达对肝癌细胞增殖特性的影响及诱发杀伤性T淋巴细胞 (CTL)细胞毒活性的变化。方法 用细胞计数法和流式细胞仪 (FCM)测定细胞生长曲线、DNA含量及细胞周期的变化。同时测定CTL对转染B7 1基因前后肝癌细胞的细胞毒作用。结果 转染B7 1基因后 ,肝癌细胞的增殖受到一定影响 :生长延缓、增殖幅度降低和倍增时间延长。CTL对转染B7 1基因的肝癌细胞杀伤明显增强。结论 转染B7 1基因的肝癌细胞出现了一定的增殖抑制现象 ,提示B7

人B7.1真核表达载体的构建、鉴定及其在白血病细胞上表达的实验研究

本研究构建包含人B7.1cDNA的重组真核表达载体pDisplay-hB7.1并鉴定,实现其在白血病细胞株HL-60细胞上的表达,获得HL60-hB7.1。应用分子克隆、PCR法扩增人B7.1基因片段,采用ApaI、SalI分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产物由T4DNA连接酶连接,转导大肠杆菌DH5α;应用ApaI、SalI双酶切和DNA序列分析技术进一步鉴定阳性克隆pDisplay-hB7.1,应用脂质体转化技术将B7.1转染HL-60细胞,同一标本分别采用直接免疫荧光法、SABC法及FACS法鉴定hB7.1在HL-60细胞上的表达,阳性细胞命名为HL60-hB7.1。结果表明,PCR法扩增出约620bp的基因片段;连接产物转导感受态细胞后,共筛选出5个阳性克隆,均可经ApaI、SalI双酶切出大小约620bp的基因片段,与人B7.1基因片段大小相符,提示重组载体构建成功。进一步DNA序列分析证明人B7.1基因序列和读码框架正确,与文献报道人B7.1cDNA序列一致,无基因突变。直接免疫荧光法鉴定表明,HL60-hB7.1阳性细胞数为70%,SABC法鉴定为65%,FACS法鉴定为92.7%。经以上鉴定证实hB7.1cDNA已成功转染HL-60细胞株并在其膜上高效表达,获得了HL60-hB7.1。结论:应用分子克隆方法可成功构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并稳定、高效表达B7.1-于HL-60细胞胞膜上,推测应用这种方案制备的瘤苗可能具有免疫治疗和免疫保护作用。

HLA-I分子对B7.1共刺激作用的影响

目的 :研究HLA I分子表达与B7 1分子的共刺激作用的相互关系 ,以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排斥反应中共刺激分子对抗原递呈机制的影响。方法 :通过流式细胞仪 (FCM)检测转染共刺激分子B7 1编码基因前后其表面HLA I分子的表达情况。利用单克隆抗体阻断细胞表面HLA I分子 ,以外周血混合淋巴细胞对阻断前后的细胞行杀伤实验。结果 :表达B7 1的肝癌细胞其表面HLA I分子表达明显增高 (P <0 0 1) ,而γ INF刺激对细胞表面HLA I分子的表达情况并无影响(P >0 0 5 )。T淋巴细胞对转染后细胞的杀伤作用远远大于未转染组 (P <0 0 1) ,当表面HLA I分子被阻断后 ,T淋巴细胞的杀伤效应几乎降至零点。结论 :转染B7 1后肝癌细胞高表达HLA I分子 ,增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号—共刺激分子B7 1,从而可诱发更强的免疫排斥反应。

抗CD28+B7.1单抗共刺激PBLs诱导肝癌细胞凋亡的蛋白激酶信号转导

目的研究 T淋巴细胞活化、增殖、介导肝癌细胞凋亡过程中其蛋白激酶 C(PKC)和酪氨酸蛋白激酶 (TPK)的活性变化。方法用抗 CD2 8+ B7.1(CD80 )单克隆抗体共刺激正常人外周血淋巴细胞 (PBL s)后作用于肝癌细胞 (BEL -740 2 )。结果激活的 T细胞中 PKC、TPK活性明显增强 ,并与肝癌细胞凋亡程度呈正相关。结论 PKC、TPK在 T细胞活化。

B7.1、GM-CSF基因修饰的EL-4细胞激发小鼠抗淋巴瘤免疫反应

目的 研究B7.1、GM CSF基因修饰的淋巴瘤瘤苗进行恶性淋巴瘤免疫基因治疗的有效性。方法 用逆转录病毒载体分别将B7.1和GM CSF基因导入小鼠淋巴瘤细胞EL 4中 ,得到EL 4 /B7和EL 4 /GM转基因瘤苗细胞。观察EL 4 /B7和EL 4 /GM瘤苗细胞对荷淋巴瘤小鼠的免疫治疗作用 ,以及预先接种过EL 4 /B7或 /和EL 4 /GM瘤苗的小鼠 ,对野生型EL 4细胞致瘤性作用的影响 ,并检测接种EL 4 /B7或 /和EL 4 /GM瘤苗的小鼠血浆IL 2及TNF α的水平 ,及其脾淋巴细胞对野生型EL 4的细胞毒效应。另外 ,检测经EL 4 /B7、EL 4 /GM刺激后的小鼠脾淋巴细胞的增殖程度。结果 ①经EL 4 /B7、EL 4 /GM细胞注射后 ,荷瘤小鼠的淋巴瘤生长速度变慢、生存时间延长 ,淋巴瘤组织中出现大量的炎症细胞 ;②接种一定数量的EL 4 /B7、EL 4 /GM细胞的小鼠 ,能抵抗野生型EL 4细胞的攻击 ;③接种瘤苗的小鼠血浆IL 2的水平明显升高 ,而TNF α的水平无明显变化 ;④接种瘤苗的小鼠脾淋巴细胞 ,对野生型EL 4细胞有明显的细胞毒效应 ;EL 4 /B7、EL 4 /GM细胞能刺激小鼠脾淋巴细胞明显增殖。结论 B7.1、GM CSF基因修饰的EL 4细胞 ,能有效地激发C5 7BL/ 6小鼠的抗淋巴瘤免疫反应 ,且B7.1基因与GM

人B7.1基因cDNA的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的 克隆人 B7.1全长 c DNA及构建相应的逆转录病毒表达载体。 方法 应用逆转录多聚酶链反应从人 B淋巴瘤细胞系 Raji中克隆 B7.1全长 c DNA ,再将 c DNA插入到质粒 p Bluescript中 ,经自动荧光测序证实无误后 ,再通过定向克隆构建相应的逆转录病毒表达载体 PL XSNh B7。 结果 逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的 889bp一致 ;用 M13正、反向引物进行荧光测序证实 ,克隆出的序列与 Gen Bank的 B7.1c DNA序列完全一致 ;人 B7.1全长 c DNA被成功地插入到质粒 PL XSN中。 结论 人 B7.1全长 c DNA的克隆及相应逆转录病毒表达载体的构建为今后应用 B7.1进行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。

人肿瘤组织中B7.1和MHC抗原表达及其意义

肿瘤免疫主要由细胞免疫介导，研究证实抗原特异性Ｔ细胞的活化需要共刺激信号的参与，缺乏共刺激信号将导致受抗原刺激的Ｔ细胞发生免疫无能，耐受甚至凋亡。Ｂ７．１是目前研究最多也是最重要的共刺激分子，已有的动物实验证明肿瘤细胞缺乏Ｂ７．１表达是其逃逸免疫监视...

B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性

目的 真核表达B7.1细胞外编码区以研究其生物学活性。方法 电穿孔法将重组质粒pDisplay/B7.1(V +C)导入人子宫颈癌细胞株 ,免疫组化及核酸原位杂交法分别检测其蛋白及mRNA表达 ,3 H TdR掺入法测定表达物对T细胞的刺激作用 ;MTT法研究转染细胞 T细胞混合培养引发的细胞毒性杀伤作用。结果 B7.1细胞外区在Hela细胞表面表达 ,所表达的B7.1细胞外区在抗CD3单抗存在的情况下具有刺激T细胞活化的特性 ,重组质粒转染的Hela细胞与T细胞混合培养可引起细胞毒性杀伤。结论 真核表达的B7.1(V +C)具有T细胞共刺激活性 ,可用于构建肿瘤免疫治疗之双功能分子。