BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。

不同生物型BVDV感染宿主细胞后差异基因分析

为深入研究牛场中普遍存在的持续性感染,探讨不同生物型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)转化的分子机制,本试验将致细胞病变型BVDV(CP型BVDV)和非致细胞病变型BVDV(NCP型BVDV)感染MDBK细胞,观察细胞变化,感染后12~72h期间每间隔12h收集1次细胞,同时对24、48h收集的细胞进行转录组学分析。结果显示,不同生物型BVDV感染宿主细胞24h后,与感染NCP型BVDV的细胞相比,感染CP型BVDV的MDBK细胞中上调差异表达的基因2 849个,下调差异表达的基因3 347个,48h后,上调差异表达的基因2 933个,下调差异表达的基因2 831个。对差异基因的GO功能分析结果表明,差异基因参与的分子功能主要有催化活性、结合活性、酶调节活性、分子转导活性和蛋白结合转录因子活性等;Pathway显著性富集分析结果显示,差异表达基因主要参与细胞自噬、细胞凋亡、免疫调节因子等相关的信号通路。本试验结果可为进一步揭示病毒致病的分子机制、控制BVDV和研制其候选疫苗奠定基础。

云南省部分地区猪感染BVDV流行病学调查

为了解云南省部分地区猪感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的情况,对来自散养户和规模猪场的211份不同年龄段粪便样品进行RT-PCR分子生物学鉴定。结果显示,散养户和规模猪场的BVDV阳性率分别为16.67%和5.83%,哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和种母猪样品阳性率分别为7.58%、20.83%、11.76%和0,总阳性率为11.37%,表明云南省普遍存在猪感染BVDV情况。该研究结果为多种家畜混养情况下的BVDV防控提供了理论依据,今后应当提高BVDV与猪瘟病毒(CSFV)二者混合感染检测及其防控的意识。

2021年度宁夏回族自治区科学技术进步奖三等奖获奖项目——宁夏地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)遗传演化及疫病防控技术研究

该项目针对牛病毒性腹泻病多发、毒株高度变异、防控难度大等突出问题开展攻关,取得一系列突破性成果。1.在国际上首次建立基于Erns、E2基因的BVDV进化分析方法,分离获得BVDV亚型毒株10株,厘清了毒株的差异性;在国际上定义BVDV-1q亚型,在全基因组水平厘定BVDV-1c亚型株;在国际上首次发表双峰驼自然感染BVDV,被国际国内引用61次,为国内和国外防控BVD提供了技术支撑。2.首次分离和测定宁夏BVDV-1m、BVDV-1v新业型代表性毒株(NX2019/01、NX2019/02)全基因组序列,并发现同亚型的1m株基因重组现象,同时筛查鉴定宁夏地区流行的BVDV-1a、-1d、-1m、-1q、-1v及BVDV-2型6种基因(亚)型毒株。

一步法RT-PCR检测大缸奶在BVDV清除计划中的应用

本文利用一步法RT-PCR对28个牛场共计50份大缸奶样进行了BVDV核酸检测。在与全群抗原检测结果对比后发现,9个已知存有PI牛的泌乳牛群,其大缸奶核酸检测均为阳性,其余41个已知无PI牛的泌乳牛群,除1个因为存在急性感染牛造成阳性结果外,其余40个均为阴性。由此可见,本方法对与泌乳牛群内是否存在PI牛可以做出准确判断,其检测灵敏度和特异性均为100%,阳性预测结果可信度为0.9(9/10),阴性预测结果可信度为0.98(40/41)。此外,针对50个大缸奶样进行的抗体检测表明,对于已感染牛场,泌乳牛群是否存在PI牛,抗体水平没有明显差异(OD1.12±0.12vsOD1.34±0.23,P>0.05)。实验室条件下,本试验使用的RT-PCR方法对于阳性乳的最低检出限为50μL/头,因此理论上,最多可从1000份样品中检出阳性乳成分(总体积为50mL)。综上可知,本试验确立的RT-PCR方法灵敏度高、特异性强,可对泌乳牛群是否存在PI牛进行准确预测,相比大缸奶抗体检测更具实际指导意义,联合ELISA-Ag使用时还可大幅度降低泌乳牛群BVDV清除计划的检测成本,因而值得推广使用。

BVDV-1E2蛋白抗原表位的串联表达及其多克隆抗体的制备

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白具有部分同源性,可导致血清学交叉反应。为准确检测BVDV,排除CSFV的干扰,以柔性氨基酸(GSGS)将BVDV-1NADL株E2蛋白的5个特异性抗原表位(E1~5)串联(E1-E1-GSGS-E2-E2-GSGS-E3-E3-GSGS-E4-E4-GSGS-E5-E5,命名为5BE),构建原核表达载体pET-28a-5BE,诱导表达重组蛋白His-5BE;将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并以间接ELISA和WesternBlot方法检测多克隆抗体的效价及反应性。结果显示:体外表达获得的重组蛋白His-5BE大小为22kD;经ELISA检测,制备的His-5BE多抗血清效价至少达到1:160000;经WesternBlot检测,制备的抗血清1:500稀释时具有良好的反应性。结果表明,本研究成功获得了BVDV5BE重组蛋白及其多克隆抗体,为后续BVDV单克隆抗体制备及检测方法建立奠定了基础。

北京地区规模化牛场BVDV持续感染牛清除方案的初步实施

BVDV持续感染牛(persistently infected,PI)是造成牛群内BVD难以根除的重要原因。为摸清北京地区BVDV-PI牛分布情况,探索BVD清除方案,本次筛查利用抗原捕获ELISA,对北京地区7个规模化奶牛场共14028头荷斯坦奶牛进行BVDV抗原检测。共检出PI牛58头,其中成母牛9头,后备牛49头;场内阳性率0.04～1.02%;PI牛与健康牛相比,平均出生体重相差5.9kg(P<0.05),15月龄时体重相差94.6kg(P<0.05),平均初配月龄和首次怀孕月龄分别延迟2.9个月和4.9个月(P<0.05)。结果表明,PI牛个体发育缓慢且繁殖性能低下,但部分牛临床表现正常。以抗原捕获ELISA为主要检测手段的清除方案是控制BVD的有效方法。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosaldiseasevirus,BVDV/MDV)是引起牛病毒性腹泻/粘膜病的病原,与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属.其基因组由5′非翻译区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3′非编码区(3′NCR)组成,编码结构蛋白P14、gP48、gP25、gP53及几种非结构蛋白.下面就BVD/MD的分子生物学研究进展做一综述,以便给该病的进一步防制奠定理论基础.

BVDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用

利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。

分泌抗BVDV McAb杂交瘤细胞株的建立

用牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ） 感染ＭＤＢＫ 细胞，将感染细胞培养物冻融后离心取上清经ＰＥＧ 沉淀浓缩抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取血清抗体效价高的免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ 细胞在ＰＥＧ作用下融合，产生杂交瘤细胞，用间接ＥＬＩＳＡ 法检测杂交瘤细胞生长孔上清，筛选阳性杂交瘤细胞株。以有限稀释法克隆２ ～３次，得到８ 株分泌抗ＢＶＤＶ 的单克隆抗体（ＭｃＡｂ） 杂交瘤细胞株。８ 株ＭｃＡｂ 对ＢＶＤＶ、猪瘟（ＣＳＦＶ） 均呈阳性反应。杂交瘤细胞核内染色体数为９８～１０５ 条。ＭｃＡｂ 属性为：６ 株属ＩｇＧ１ ，２ 株属ＩｇＧ２ａ 。经抗原结合位点分析，８ 株ＭｃＡｂ 可识别３ 个不同的抗原决定位点。将杂交瘤细胞注射ＢＡＬＢ／Ｃ 小鼠腹腔诱生腹水，其抗体效价提高３ ２００ 倍以上，有３ 株腹水单抗的ＥＬＩＳＡ 效价在１∶１０ 万以上，最高ＭｃＡｂ 株达１∶２０ 万。杂交瘤在液氮中保存１～２ ａ 后复苏仍能稳定地分泌抗ＢＶＤ 病毒的ＭｃＡｂ 。所有腹水ＭｃＡｂ 对ＢＶＤＶ 的中和指数均大于５０（ｌｏｇ１０１ ．７），最高达５０１１８（ｌｏｇ１０４．７） 。ＭｃＡｂ

荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测BVDV方法的建立及应用比较

为建立一种快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的方法,试验采用RT-LAMP和荧光定量RT-PCR两种检测方法,与通用RT-PCR方法在特异性、灵敏性、样品检出率、试验设计复杂程度、扩增反应效率、使用仪器简单程度和检测成本高低七个方面对BVDV进行了综合性比较分析。结果表明:试验建立的RT-LAMP方法与荧光定量RT-PCR、通用RTPCR方法相比具有特异性强、灵敏度高、样品检出率和扩增反应效率高、操作简便快速、低成本等特点。说明RT-LAMP方法对快速、灵敏诊断牛病毒性腹泻病、防止疫情的扩散具有重要意义。

BVDV与BRV二温式多重PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛轮状病毒(BRV)的保守基因设计了两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立了用于同时检测BVDV和BRV的二温式多重PCR方法,扩增长度分别为244和385 bp。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV和BRV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;检测灵敏度高,最低能检测到BVDV和RBV各1 pg病毒RNA。建立的BVDV和BRV二温式多重PCR方法,是一种快速、特异、敏感的检测方法。

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SW E2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21(DE3)表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化入大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDSPAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。

抗BVDV卵黄抗体的制备

采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)免疫产蛋母鸡,然后用水稀释法成功地从卵黄中分离出抗BVDV免疫球蛋白(抗-BVDV IgY)。建立起测定鸡蛋中特异性抗BVDV活性的间接ELISA方法,并采用此方法检测每次免疫后第10天的抗体滴度。结果表明,蛋鸡在首次免疫后第10天,卵黄中可以检测到抗-BVDV IgY;5次免疫后,抗体效价达到1:6400,半年后仍能维持在该水平。

人参皂苷抗梅花鹿源BVDV研究

[目的]研究人参皂苷抗BVDV作用,为人参的开发与利用提供参考。[方法]采用中性红染料法,研究了人参皂苷的抗BVDV作用。[结果]人参皂苷对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是12.80μg/m l,在1.60～12.80μg/m l范围内人参皂苷抗BVDV效果显著。[结论]人参皂苷具有显著的抗BVDV病毒作用,在安全浓度范围内,人参皂苷抗病毒的作用随浓度的提高而增强。

BVDV基因E_0在人参发根的转化及其分子检测

将重组鹿源BVDV基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源BVDV基因E0人参发根,鹿源BVDV基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为研制转基因人参发根疫苗提供了科学依据和材料。

青海牦牛BVDV E0基因的表达与抗原性检测

将青海牦牛病毒性腹泻病毒(BVDV)QHZK株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(α),构建了重组表达载体pET-32(α)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠杆菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为BVDV亚单位疫苗的研究奠定了基础。

五味子乙素抗梅花鹿源BVDV的实验研究

采用中性红染料法,测定了五味子乙素对MDBK细胞的最大安全浓度,探讨了五味子乙素抗梅花鹿源BVDV病毒的作用。结果表明:五味子乙素对MDBK细胞无损伤的最大安全浓度是19.53μg/mL;五味子乙素具有显著抗梅花鹿源BVDV作用,且有一定的量效关系,在安全浓度范围内,随浓度的提高,五味子乙素抗病毒的作用增强。

BVDV对后备牛生长发育状况及繁殖性能的影响

牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)是一种严重危害奶牛健康的病毒性传染病,其病原为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。BVDV感染牛后主要表现两种状态,即一过性感染(TI)和持续性感染(PI)。BVD在牛场的流行,可严重影响奶牛的生产性能、繁殖性能及牛群健康状况,对奶牛的影响可表现为流产、胎儿畸形、腹泻和免疫抑制等。怀孕母牛在特定妊娠阶段感染BVDV后,可娩出PI犊牛,部分PI犊牛能像正常犊牛一样生长发育至成年,但其生长发育状况和繁殖性能较同龄健康牛差异十分明显。为评价BVDV对后备牛生长发育及繁殖状况的影响,笔者采用ELISA方法检出北京地区28个规模化奶牛场141头BVDV-PI牛,并与同龄健康牛生长发育及繁殖数据相比较,结果表明,BVDV-PI后备牛各月龄段的体高、体重均低于健康后备牛,其首次输精日龄、配准日龄、耗精量明显高于健康后备牛,而一次情期受胎率显著低于健康后备牛。数据显示,BVDV严重影响后备牛的生长发育及繁殖状况。

BVDV-2 E2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆SW分离株E2基因进行RT-PCR扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入华赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-E2。用SalⅠ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2,电转化酵母GS115,通过G418筛选重组酵母菌GS115-pPIC9K-E2,用φ=1.5%甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为23.2ku;Western blot分析表明,该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。