CEBPs在阿霉素肾病中表达及作用机制研究

目的:研究CEBPs各亚型在慢性肾损伤动物模型中的表达情况,探讨CEBPs在慢性肾脏疾病中可能作用机制,为阻断或延缓慢性肾损伤提供新的靶点。方法:建立阿霉素肾病(ADR)模型,制作各时间点肾组织切片及留取肾组织标本。利用免疫荧光染色和western blot检测CEBPs亚型(CEBP-β/CEBP-δ)在ADR肾病模型中表达情况。结果:(1)免疫荧光染色检测发现CEBP-β转录因子主要表达在肾小球及肾间质细胞核中,在ADR模型中阳性部位随着慢性肾损伤加重表达量逐渐下降。(2)western blot检测发现CEBP-β在ADR模型的4周和8周组较正常组相比表达量下降,且差异有统计学意义(P<0.05)。(3)western blot检测发现磷酸化的CEBP-β(p-CEBP-β)在ADR模型的4周和8周组较正常组相比表达量升高,与CEBP-β表达趋势相反。(4)western blot检测发现CEBP-δ在ADR模型4周组和8周组较正常组相比表达量升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)NF-κBp65在ADR肾病模型4周组及8周组表达升高,较正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。且NF-κBp65表达趋势与CEBP-δ表达趋势相同,与CEBP-β表达趋势相反。结论:(1)CEBP-β/CEBP-δ可作为肾损伤的生物学标记物,参与慢性肾脏疾病的发生发展。(2)CEBP-β参与肾损伤机制可能与其磷酸化激活下游因子相关。(3)阻断CEBP-β/CEBP-δ转录因子的激活可能缓解肾脏炎症反应和纤维化反应的发生。(4)CEBP-β/CEBP-δ转录因子信号通路可能与NF-κB信号通路存在相互关联作用。

红景天苷通过调节Nrf2/HO-1和PPARγ/CEBPα信号通路抑制高脂诱导的大鼠肥胖

目的:观察红景天苷对高脂饲料诱导大鼠肥胖的治疗作用,并探讨其可能机制。方法:按文献方法建立肥胖模型,实验分为正常对照组、模型组及红景天苷50、100 mg/kg组;给药组灌胃给予相应的药物,1次/d,连续4 w。每周称量1次体质量和计算1次饲料消耗量和利用率。末次给药12 h后取血,进行Glu、INS、TG、TC、HDL-C、LDL-C含量检测和胰岛功能HOMA-IR、HOMA-β计算,取腹部和附睾脂肪组织计算质量指数;检测附睾脂肪组织TAC、GSH-Px、SOD活性和MDA含量并进行形态学分析;并检测附睾脂肪组织中Nrf2、HO-1、PPARγ、CEBPαmRNA表达。结果:红景天苷(50、100 mg/kg)能显著降低高脂诱导肥胖大鼠体质量、饲料利用率及血清Glu、INS、TG、TC、LDL-C水平并能降低HOMA-IR及附睾脂肪组织中MDA含量;升高血清HDL-C含量和HOMA-β及附睾脂肪组织中TAC、SOD、GSH-Px活性;降低腹部和附睾脂肪质量指数及附睾脂肪细胞大小和面积;升高附睾脂肪组织中Nrf2、HO-1 mRNA表达并降低脂肪组织中PPARγ、CEBPαmRNA表达。结论:红景天苷对高脂诱导大鼠肥胖具有较好的治疗作用,其作用机制与调节Nrf2/HO-1和PPARγ/CEBPα信号通路,增强抗氧化系统功能和抑制血糖、血脂升高有关。

牦牛CEBPα基因克隆及在脂肪细胞中的表达模式

以牦牛为试验对象,旨在克隆牦牛增强子结合蛋白α基因(CEBPα),预测其蛋白结构和功能,同时分离得到牦牛脂肪细胞,并检测CEBPα在牦牛不同组织中的表达及牦牛脂肪细胞诱导分化过程中的表达。采集成年牦牛(4岁)的心、肝、脾、肾、胃、小肠、皮下脂肪、内脏脂肪和肌肉组织,利用PCR技术获得CEBPα基因序列,得到其CDS序列;生物信息学的方法预测该基因的序列同源性及蛋白结构;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CEBPα在牦牛不同组织的表达;通过胶原酶消化法,分离得到牦牛前体脂肪细胞;qRT-PCR检测CEBPα在诱导分化0,3,6,9 d的表达模式。结果表明,牦牛CEBPα基因的CDS序列长度为645 bp,编码214个氨基酸;牦牛CEBPα基因与普通牛的同源性相对较高,核酸同源性为99.73%,氨基酸同源性为99.19%;构建系统进化树的结果显示,牦牛与普通牛和绵羊的相似性较高;CEBPα蛋白为具有跨膜结构、发生磷酸化/去磷酸化的不稳定亲水性蛋白,蛋白质的二级结构以α螺旋(27.10%)和无规则卷曲(67.29%)为主;qRT-PCR结果显示,CEBPα基因在牦牛皮下脂肪组织中表达最高,在肾、脾和内脏脂肪组织中低表达;CEBPα在牦牛脂肪细胞诱导分化过程中表达量逐渐升高。本试验克隆获得了CEBPα的CDS区序列,确定了其在牦牛各个组织中的表达量并明确了该基因在牦牛脂肪细胞诱导分化过程中的表达模式,为揭示CEBPα基因在牦牛脂肪组织和脂肪细胞中的功能提供基础数据。

转录因子CEBPα和p53在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因表达的调控

【目的】预测母猪Kiss1(GenBank Gene ID:100145896)上游区域潜在的转录因子结合位点,并验证部分转录因子在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因的调控作用,为研究Kiss1基因在母猪卵巢颗粒细胞中的分子调控机制提供理论基础。【方法】参考NCBI数据库中Kiss1基因上游区域的序列,通过生物信息学网站预测的Kiss1基因上游区域潜在转录因子结合的位点,结合文献阅读与资料查询,在转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域潜在结合位点附近设计引物,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,验证转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域的结合情况;参照NCBI数据库相关转录因子CEBPα和p53的mRNA序列,使用软件Primer Premier5设计引物,PCR分别扩增转录因子CEBPα(带有Kpn I和Xho I限制性内切酶的酶切位点)和p53(带有Kpn I和Hind III限制性内切酶的酶切位点)的CDS区序列,并进行测序鉴定,连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建含有潜在转录因子CEBPα和p53 CDS区序列的真核表达载体,并获得无内毒素质粒,分别命名为pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53;化学合成目标转录因子CEBPα和p53的干扰siRNA片段。屠宰场采集猪的卵巢,快速分离并培养原代猪的卵巢颗粒细胞,阳离子脂质体转染法分别将转录因子CEBPα和p53真核表达载体(pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53)或siRNA片段(CEBPα-siRNA和p53-siRNA)转染进母猪卵巢颗粒细胞,使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别验证预测的转录因子CEBPα和p53对Kiss1基因mRNA水平和蛋白水平的影响。【结果】生物信息学预测结果表明,Kiss1基因上游区域(-850—+221)存在p53(肿瘤抑制蛋白,tumor protein p53,p53)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, CEBP)、信号传导及转录活化家族Stat4(signal transducer and activator of transcription 4, Stat4)等转录因子的潜在结合位点,其中转录因子p53(GenBank Gene ID:397276,NM_213824.3)可能结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp处,转录因子CEBPα(GenBank Gene ID:397307,XM_003127015.4)可能结合在Kiss1基因上游区域-744—-733bp处;ChIP结果表明,转录因子p53和CEBPα可以特异性的结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp和-744—-733 bp处;在母猪卵巢颗粒细胞中超表达转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著下降(P<0.05),蛋白水平显著下降(P<0.05);在母猪卵巢颗粒细胞中,干扰转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著升高(P<0.05),蛋白水平显著升高(P<0.05)。【结论】在猪卵巢颗粒细胞里,转录因子p53和CEBPα能结合到Kiss1基因的上游区域降低其启动子转录活性,进而降低其mRNA和蛋白表达水平。

下调microRNA-10b通过靶向调控CEBPα表达促进脂肪干细胞的成骨分化

目的探讨下调microRNA-10b(miR-10b)对小鼠脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化的影响。方法分离培养小鼠ADSCs,对其进行细胞形态学及流式细胞术鉴定;应用脂质体稳定转染法转染小鼠ADSCs,将转染miR-10b inhibitor、si-CEBPα及miR-10b inhibitor+si-CEBPα的ADSCs依次设为miR-10b inhibitor组、si-CEBPα组及miR-10b inhibitor+si-CEBPα组;同时将上述对应的阴性对照序列转染入ADSCs中,分别记为miR-NC组、si-NC组及miR-NC+si-NC组,正常对照组(control组)为无任何特殊处理的ADSCs;采用RT-PCR法检测转染后ADSCs中miR-10b的表达;生物信息学预测miR-10b与CEBPα的靶向关系,并采用双荧光素酶基因报告实验、实时荧光定量PCR及Western blot验证两者的靶向关系;利用茜素红染色及碱性磷酸酶(ALP)活性检测实验明确miR-10b对小鼠ADSCs成骨分化的影响及CEBPα在其中的作用。结果与control组和miR-NC组相比,miR-10b inhibitor组小鼠ADSCs中miR-10b的表达显著较低(P<0.05);双荧光素酶基因报告实验、RT-PCR和Western blot实验结果表明,miR-10b可在小鼠ADSCs中靶向调控CEBPα基因的表达,且与miR-NC组相比,miR-10b inhibitor组ADSCs中CEBPα的mRNA及蛋白表达均显著增加(P<0.05);茜素红染色及ALP活性检测结果表明,与control组和miR-NC组相比,miR-10b inhibitor组ADSCs细胞形成的矿化结节及ALP活性均显著增加(P<0.05)。功能挽救实验证实,在小鼠ADSCs细胞中同时转染沉默CEBPα的si-CEBPα及miR-10b inhibitor后,miR-NC+si-NC组和miR-10b inhibitor+si-CEBPα组ADSCs细胞形成的矿化结节与ALP活性均较si-NC+miR-10b inhibitor组低(P<0.05),且前2组之间无明显差异(P>0.05)。结论在小鼠ADSCs中,下调miR-10b通过靶向调控CEBPα的表达促进脂肪干细胞的成骨分化。

Identification of target genes of transcription factor CEBPB in acute promyelocytic leukemia cells induced by all-trans retinoic acid

Objective:To indentify target genes of transcription factor CCA AT enhancer-binding protein P(CEBPB) in acute proinyelocytie leukemia cells induced by all-tram retinoie acid.Methods: A new strategy for high—throughput identification of direct target genes was established by combining chromatin immunoprecipitation(ChIP) with in vitro selection.Then,106 potential CKBPB binding fragments from the genome of the all-trans retinoie acid(ATRA)-treated NB4 cells were identified.Results:Of them,82 were mapped in proximity to known or previously predicted genes;7 were randomly picked up for further confirmation by ChlP-PCR and 3 genes (CALM,1TPR2 and 0RM2) were found to be specificaUy up-regulated in the ATRA-treated NB4 cells,indicating that they might lie the down-stream target genes of ATKA.Conclusions:Our results provided new insight into the mechanisms of ATRA-induced granulocytic differentiation.

电信码号变换类业务研究

近年来传统企业逐步向互联网转型,企业用户围绕号码资源,如一号多端、一卡多号、号码隐藏、号码定制等需求越来越多,运营商的号码资源越来越受到互联网企业的青睐,通过研究运营商号码资源业务的现状和互联网对于号码变换业务需求,结合技术演进发展,分析和梳理运营商开展电话号码变换业务的技术方案,为电信运营商后续部署和发展电信号码变换业务提出发展建议。

黄连解毒汤对大鼠营养性肥胖的影响

目的:观察黄连解毒汤低、中、高剂量组给药时间长短对营养性肥胖大鼠的影响。方法:100只SD雄性大鼠按体重随机分为正常组、模型组、黄连解毒汤组(高、中、低剂量组),每组20只,除正常组外,其余各组用"高脂乳剂+碳酸饮料+普通饲料"混合喂养造大鼠营养性肥胖模型,连续3周,3周后分别于给药22d、42d,每组各处理10只大鼠,分离血清,剥离肾及生殖器周围脂肪组织,检测血清GLU、TG、TC、HDL-C、LDL-C和脂肪组织CEBPα含量,计算脂肪指数。结果:与模型组比较,各给药组可明显降低肥胖大鼠体重、脂肪指数,明显升高肥胖大鼠HDL-C水平,其中黄连解毒汤中剂量组能明显降低TG、TC、LDL-C、CEBPα水平。以上结果均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:黄连解毒汤对大鼠营养性肥胖具有一定的干预作用,其中中剂量组作用尤为突出,除HDL-C,对其它指标的影响给药时间均不宜过长。

小檗碱激活AMPK抑制3T3-L1脂肪细胞分化

目的:探讨小檗碱对3T3-L1脂肪分化的作用是否与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有关。方法:在3T3-L脂肪细胞分化全程加入小檗碱,以油红O染色检测3T3-L1脂肪细胞胞浆中脂肪的堆积,实时定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)、CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)和AMPK的mRNA表达,以Western印迹法检测AMPK和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化水平。结果:小檗碱剂量依赖性地抑制3T3-L1脂肪细胞分化,10μmol/L小檗碱几乎完全抑制胞浆中脂肪的堆积。5μmol/L小檗碱在脂肪细胞诱导分化1、3、5、7d后均显著降低CEBPαmRNA表达(P<0.05或P<0.01),诱导分化3、5、7d时显著降低PPARγ2的mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。AMPK的mRNA水平在分化过程中未受小檗碱的明显影响,而小檗碱明显增加其蛋白磷酸化水平,其下游靶基因ACC磷酸化水平也明显增加。结论:小檗碱抑制3T3-L1脂肪细胞的分化可能与其激活AMPK有关。

脉搏轮廓心输出量监测联合连续血液净化治疗在急性呼吸窘迫综合征中的临床体会

目的探讨PiCCO(脉搏轮廓心输出量监测)联合连续血液净化(CEBP)在治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的临床疗效。方法 2008年5月～2011年6月间收治的42例ARDS患者在常规治疗的基础上采用PiCCO指导下CEBP治疗,观察患者治疗前后的生命体征、血气分析指标、生化指标、炎症因子、病死率。结果治疗后患者的氧合,呼吸,心率,炎症因子、PiCCO指标血管外肺水(EVLWI)等较治疗前有显著好转,病死率低,对循环影响小。结论 PiCCO联合CEBP治疗能降低ARDS患者的血管外肺水,清除炎症介质,改善氧合,维护内环境,显著降低病死率,改善了ARDS的预后,是治疗ARDS的有效方式。

紫花苜蓿对杂交猪育肥性能和相关基因表达量的影响

为了研究紫花苜蓿对猪生长及肉质性能的作用,选用16头长×大外二元育肥猪,在基础饲料中添加4%苜蓿,应用免疫组织化学、酶联免疫吸附试验、实时荧光定量PCR研究脂肪代谢相关因子在mRNA水平和蛋白质水平表达的差异。结果显示:饲料中添加苜蓿后,杂交猪骨骼肌细胞中瘦素(leptin)基因(P<0.05)和蛋白(P>0.05)的表达量下降,与日增重呈轻度负相关(r=-0.314);转录因子C/EBPβ(CCAAT/en-hancer binding proteins,CEBPβ)基因和蛋白的表达量变化不明显;过氧化氢酶体激活增殖受体(peroxisome proliterator actiated receptors,PPARr)基因和蛋白水平高于对照组(P>0.05),与日增重(r=-0.837)、瘦肉率(r=-1.000)、pH1(r=-1.000)呈高度负相关,与脂率(r=1.000)、熟肉率(r=1.000)高度正相关;脂联素(adiponectin)基因(P>0.05)和蛋白(P<0.05)表达量高于对照组,与脂率(r=-1.000)、熟肉率(r=-1.000)、胴体重(r=-0.500)、屠宰率(r=-0.500)、肉色评分(r=-0.500)、pH24(r=-0.500),肌内脂肪含量(r=-0.500)负相关,与日增重(r=0.837)、瘦肉率(r=1.000)、pH1(r=1.000)、眼肌面积(r=0.500)、失水率(r=0.500)正相关;脂肪分化相关蛋白(adiposedifferentiation-related protein,ADFP)基因(P>0.05)和蛋白(P<0.05)表达量上调,但与肉质、体增重等指标相关性不大;脂蛋白脂酶(lipo-protein lipase,LPL)基因和蛋白变化不明显,与各项屠宰指标不相关。这些结果表明一定量的紫花苜蓿下调Leptin、通过CEBPβ上调PPARr、ADFP和Adiponectin 3个基因和蛋白的表达,增加猪的日增重、肌内脂肪,影响肉质性状,对LPL的作用较小。这些研究为紫花苜蓿在养猪业中的开发利用奠定了理论基础。

一例伴t（14；14）（q11;q32）易位的B细胞急性淋巴细胞白血病的临床和分子细胞遗传学研究

目的报告1例伴t（14；14）（q11；q32）易位的罕见B细胞急性淋巴细胞白血病（B-lineage acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）病例，阐明其临床和分子细胞遗传学特征。方法分析1例伴t（14；14）（q11；q32）易位B-ALL患者的临床资料；将患者骨髓细胞24h培养后按常规方法制备染色体标本，采用R显带技术进行核型分析；分别应用IGH双色断裂点分离探针、CEBPE双色断裂点分离探针、4号全染色体涂染探针和ALL组合探针进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）分析。结果常规细胞遗传学分析显示患者核型为47，XX，＋4，t（14；14）（q11；q32）[20]，FISH分析进一步证实了这种核型异常。IGH双色断裂点分离探针FISH分析表明t（14；14）（q11；q32）易位累及IGH基因，CEBPE双色断裂点分离探针FISH分析提示t（14；14）（q11；q32）易位中IGH的伙伴基因为CEBPE基因。结论在昏ALL中t（14；14）（q11;q32）易位同时累及IGH和CEBPE基因为少见的再现性遗传学异常，该异常可定义辟ALL中一种新的亚型。伴有t（14；14）（q11；q32）IGH／CEBPE易位的昏ALL患者可能预后较好。

miR-155在细胞因子诱导的杀伤细胞诱导白血病细胞凋亡中的作用及其机制

目的 观察细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）对白血病细胞凋亡的影响,探讨miR-155在此过程中的作用.方法 MTT法检测CIK细胞对白血病NALM-6和Jurkat细胞的细胞毒作用,实时定量反转录PCR检测白血病细胞miR-155表达,流式细胞术检测miR-155对CIK细胞诱导白血病细胞凋亡的影响,构建包含miR-155作用位点的CEBP/β基因3＆#39;-UTR区的质粒,转染白血病细胞,双荧光素酶报告基因试剂盒检测白血病细胞CEBP/β荧光素酶活性.结果 CIK细胞对NALM-6和Jurkat细胞具有强大的细胞毒作用,且呈时间与剂量依赖性（P＜0.05）,同时CIK细胞能上调NALM-6和Jurkat细胞中miR-155的表达,其中NALM-6细胞上调（2.87±0.19）倍（t=2.787,P＜0.05）,Jurkat细胞上调（1.98±0.25）倍（t＝ 3.513,P＜ 0.05）.另外,miR-155 mimics能促进CIK细胞对NALM-6和Jurkat细胞诱导的凋亡作用（t=4.239,P＜0.05;t=3.565,P＜0.05）,而miR-155抑制剂能够拮抗此过程（t=3.772,P＜ 0.05;t=4.017,P＜ 0.05）.miR-155直接作用于CEBP/β基因3＆#39;-UTR区,且CIK细胞降低白血病细胞荧光素酶活性,其中NALM-6细胞下降（42.89±2.07）％（t=3.578,P＜0.05）,Jurkat细胞下降（37.02±1.95）％（t=4.393,P＜ 0.05）.结论 CIK细胞通过上调miR-155促进白血病细胞凋亡,这为CIK细胞治疗白血病提供新的数据.