sua-CMS烟草不育系COXⅡ的功能分析

【目的】细胞质雄性不育由细胞质基因组(主要是线粒体基因组)控制,在杂交种的育种和生产中起重要作用。长期以来,我国烟草种植以不育系和杂交种为主,其面积占烟草总种植面积的80%以上,不育类型均为sua-CMS,但该不育类型的控制基因、不育机制尚不清楚。COXⅡ是细胞色素氧化酶(COX)的第二亚基,由线粒体基因组编码。在sua-CMS烟草不育系中,COXⅡ末端发生多个碱基变异,导致C端编码蛋白Thr^(257)被Ser取代。研究sua-CMS烟草COXⅡ功能,为阐明sua-CMS烟草不育分子机制奠定基础。【方法】以4组sua-CMS不育系和可育对照为材料,RNA印迹杂交和qRT-PCR方法分析COXⅡ在sua-CMS不育系和可育对照之间的转录本、基因表达差异,Western杂交、COX酶活性试验分析COX蛋白表达和COX酶活性,并测定ATP含量;将可育烟草的COXⅡ在sua-CMS不育系中过表达,研究COXⅡ过表达对COXⅡ表达量、COX酶活性、ATP含量以及烟草雄蕊发育的影响。【结果】通过对COXⅡ多序列比对,发现C端Thr^(257)在物种间高度保守,表达分析显示不育系中COXⅡ转录本显著低于可育对照,COXⅡ在不育系烟草中的表达量只有对照的0.3%—0.4%,COX蛋白表达量和COX酶活性均显著低于可育对照,ATP含量为可育对照的52%。将可育烟草COXⅡ在不育系烟草中过表达,转基因植株COXⅡ在花芽中的表达量最高提高171倍,COX酶活性提高70%,ATP含量提高90%,但转基因植株在花药中的COXⅡ表达量、COX酶活性和ATP含量等各项指标均低于可育对照。转基因植株的花药形态发生了明显的改变,并出现了花药壁的分化,但花药内无胞母细胞分化,最终也无花粉粒产生。【结论】sua-CMS烟草不育系COXⅡ变异影响COX功能,是其花药能量缺陷的重要原因,也是影响花药发育的一个重要因素。

苎麻线粒体基因CoxⅡ和atpA与细胞质雄性不育相关性分析

【目的】探讨线粒体CoxⅡ和atpA基因与苎麻CMS的关系。【方法】根据GenBank报道的双子叶植物线粒体CoxⅡ和atpA基因编码区高度保守序列设计简并引物,通过PCR技术从苎麻细胞质雄性不育系、保持系和恢复系(简称"三系")mtDNA中扩增目的基因片段;采用DNAWalking策略从3′端和5′端扩增基因片段的未知侧翼序列,分离完整的线粒体CoxⅡ、atpA基因;基于全基因序列和基因表达(RT-PCR法)分析这两个基因在苎麻"三系"间的差异。【结果】分离的苎麻CoxⅡ和atpA基因片段与GenBank中一些双子叶植物同类基因的同源性分别高达95%和97%以上,获得的CoxⅡ、atpA全基因包含了完整的开放阅读框。"三系"的CoxⅡ基因在mtDNA水平、转录水平、蛋白质水平上均无明显差异。雄性不育系atpA基因在mtDNA水平、氨基酸序列和蛋白质二级结构上与保持系和恢复系存在比较明显的差异;RT-PCR分析还表明,不育系atpA基因在现蕾期和开花后期的表达量明显低于可育系。【结论】CoxⅡ基因与苎麻CMS可能无关,而不育系atpA基因的序列变异和/或异常表达可能与苎麻CMS关系密切。

辣椒核质互作雄性不育系线粒体不育基因CoxⅡ和atp6的克隆与序列分析

以辣椒核质互作雄性不育系9704A、保持系9704B和恢复系9701(简称"三系")为材料,根据GenBank报道的茄科作物线粒体CoxⅡ和atp6基因编码序列分别设计引物,PCR扩增辣椒"三系"线粒体DNA目的基因片段,研究辣椒"三系"线粒体DNACoxⅡ和atp6基因的差异及与雄性不育的关系。结果表明:从辣椒核质互作雄性不育系中扩增到两个基因的部分序列atp6-706和CoxⅡ-708,GenBank登录号分别为FJ986191和FJ986190,生物信息学分析发现分离的atp6-706和CoxⅡ-708片段与GenBank报道的茄科作物线粒体CoxⅡ和atp6基因的相似性高达95%以上;在保持系和恢复系中均未能扩增到任何序列,说明辣椒雄性不育系的CoxⅡ和atp6基因与保持系和恢复系在线粒体DNA水平上存在差异,这种结构上的变化暗示可能与辣椒雄性不育相关。

烟草线粒体基因coxⅡ的SNP检测及其与CMS的相关性分析

对烟草胞质雄性不育性(CMS)的分子机理进行了研究。以7个CMS系及其相应的保持系为材料,利用特异引物PCR法扩增其线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(coxⅡ),通过直接测序和比对,检测到coxⅡ中有3个核苷酸位点存在碱基变异,分别是:C-770G、G-772A和G-773C,其中第770位碱基的变化导致了相应位点编码氨基酸的改变,第772和773位碱基的变化共同导致了1个编码氨基酸的改变。对coxⅡ基因中第770位C→G的突变进行了240个烟草植株个体的PCR-RFLP检测及分析,结果表明,所有保持系单株的线粒体coxⅡ基因片段都可以被HapⅡ酶切,酶切后出现2种条带;而全部雄性不育系单株的线粒体coxⅡ基因片段由于第770位C→G的突变都不能被HapⅡ酶切,电泳图中仅有1条未被切开的条带。说明coxⅡ基因第770位的SNP位点与烟草CMS特性存在极显著的相关性。

不同训练方式对骨骼肌P53调节线粒体有氧呼吸轴P53、SCO2和COXⅡ基因表达的影响

目的：比较耐力训练和间歇性速度训练对骨骼肌P53调节线粒体有氧呼吸轴影响能量代谢的运动适应及对P53、SCO2和COXⅡ基因表达的影响。方法：30只大鼠随机分为3组：安静组（C,n=10）、耐力训练组（E,n=10）、间歇性速度训练组（S,n=10）,训练6周。间歇性速度训练：每天9-10次10 s极量强度（≥42 m/min）的跑台运动,间歇时间30-60 s;耐力训练：每天30-60 min低强度（≤16.7 m/min）的持续跑台运动;每周均训练6天。最后一次训练结束后的24-48 h内切取腓肠肌,Real-time PCR检测P53、SCO2和COXⅡ的mRNA转录,Western blot检测P53、SCO2和COXⅡ的蛋白表达。结果：1）E组和S组P53 mRNA转录、蛋白表达水平与C组相比均没有显著性差异（P〉0.05）;E组和S组相比P53 mRNA转录、蛋白表达也没有显著性差异（P〉0.05）;2）E组SCO2 mRNA转录、蛋白表达水平均显著高于C组（P〈0.05）;S组SCO2 mRNA转录与C组相比没有显著性差异（P〉0.05）,但S组SCO2蛋白表达水平显著高于C组（P〈0.05）;E组和S组SCO2 mRNA转录、蛋白表达水平均没有显著性差异（P〉0.05）;3）E组COXⅡ mRNA转录水平与C组相比没有显著性差异（P〉0.05）,但E组COXⅡ mRNA转录水平非常显著低于S组（P〈0.01）;E组COXII蛋白表达水平非常显著地高于C组和S组（P〈0.01）;S组COXⅡ mRNA转录水平和蛋白表达水平均非常显著高于C组（P〈0.01）。结论：1）P53基因转录和蛋白表达具有极强的保守性,耐力训练和间歇性速度训练都不能影响其稳态效应;2）两种训练方式对SCO2和COXⅡ基因表达在转录和转译水平上影响虽然有所不同,但都呈现出促进有氧呼吸的趋同性,间歇性速度训练可能是一种更有效的时间节省化训练方式;3）P53-SCO2-COXⅡ-有氧呼吸轴对耐力训练和间歇性速度训练产生了良好的运动性适应,在制定运动处方时,可适当结合耐力训练和间歇性速度训练来提高机体有氧呼吸能力。

“祛风通窍方”对血管性痴呆大鼠海马线粒体COX活性及COXⅡmRNA表达的影响

目的:观察祛风通窍方对血管性痴呆(Vascular dementia,VD)大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶(COX)及细胞色素氧化酶Ⅱ亚型(COXⅡ)mRNA表达的影响,探讨祛风通窍方对VD可能的保护机制。方法:大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组和祛风通窍方高、中、低剂量组。除假手术组外,其余各组大鼠采用经典的永久性结扎双侧颈总动脉法制备VD模型。假手术组、模型组用等体积蒸馏水灌胃,各给药组予相应药物灌胃,连续30d。ELISA法检测海马线粒体COX活性;RT-PCR法检测COXⅡmRNA表达水平。结果:与假手术组比较,其余各组大鼠COX活性明显降低,COXⅡmRNA表达明显降低;与模型组比较,尼莫地平组和祛风通窍方高、中剂量组COX活性明显升高,COXⅡmRNA表达明显增加。结论:祛风通窍方对VD大鼠线粒体功能具有一定的保护作用,可能与其改善VD大鼠线粒体COX活性,增加COXⅡmRNA的表达有关。

大熊猫等8种野生哺乳动物蛔虫的线粒体COXⅠ和COXⅡ基因的亲缘关系分析

为了探讨寄生于大熊猫、小熊猫、北极熊、棕熊东北亚种、棕熊西藏亚种、黑熊四川亚种、黑猩猩和白眉长臂猿体内蛔虫的分类地位,采用PCR技术扩增了这些野生动物体内寄生蛔虫的线粒体COXⅠ、COXⅡ基因序列,并与GenBank中注册的同源性序列进行了分析。序列分析结果显示:扩增的8种野生哺乳动物蛔虫的COXⅠ、COXⅡ基因长度均分别为393和582bp,其中大熊猫与小熊猫及4种熊科动物蛔虫COXⅠ和COXⅡ基因的相似性分别为94.8%～95.0%和94.9%～95.5%;黑猩猩和白眉长臂猿蛔虫的COXⅠ、COXⅡ基因的相似性分别为99.8%和99.5%。分子系统树(NJ/MP/ML)表明,寄生在大熊猫、小熊猫和4种熊科动物体内的蛔虫均为贝蛔属(Baylisascaris)蛔虫;而黑猩猩和白眉长臂猿体内寄生的蛔虫应为蛔属(Ascaris)蛔虫。同时,分析结果也揭示了蛔虫与宿主之间存在协同进化关系。

幽门螺杆菌对食管癌细胞凋亡及表达COXⅡ、Bax、Caspase-3的影响

目的:观察幽门螺杆菌(H.pylori,HP)作用于食管癌细胞(ECa-109)后细胞凋亡的情况以及细胞色素氧化酶Ⅱ(cytochrome oxidaseⅡ,COXⅡ)、Bax、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达的变化,探讨H.pylori致癌的分子机制。方法:将H.pylori与ECa-109分别作用4、8、24 h,收集各组细胞,流式细胞术(FACS)检测凋亡情况;Real-Time PCR和Western blot法检测各时间点COXⅡ、Bax、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达。结果:随着共培养时间的延长,COXⅡmRNA和蛋白的表达逐渐下降,而Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达逐渐上升,ECa-109凋亡增加。结论:H.pylori可抑制食管癌细胞线粒体编码基因COXⅡmRNA的表达,从而影响线粒体功能;H.pylori在体外可通过线粒体途径上调Bax、Caspase-3表达,从而诱导ECa-109凋亡。

水稻线粒体coxⅡ基因转录本的编辑位点研究

RNA编辑是指由RNA水平的核苷酸改变所引起的密码子发生变化的一种预定修饰,它的发现是近年来对分子生物学中心法则的重要补充。本文以红莲型(HL)水稻细胞质雄性不育系粤泰A,保持系粤泰B和杂种F_1(不育系A与恢复系71068的杂交一代)为材料,首次研究了线粒体基因coxⅡ转录本的编辑位点。coxⅡ基因的转录本有15个编辑位点,其中有14个发生在密码子的第一和第二位点。这14个位点的编辑可改变氨基酸的种类,并导致所编码蛋白的疏水性以及所编码蛋白在氨基酸序列上的保守性增加。

大豆细胞质COXⅡ基因的分离及序列分析

目前关于细胞质雄性不育的机理研究主要集中在植物线粒体上,通过参考大豆线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(COXⅡ)基因序列,合成保守基因引物,从供试材料中克隆到了COXⅡ基因,对基因序列分析表明:该基因编码了一个有280个氨基酸组成的蛋白,推测其可能与大豆细胞质不育有关。

葱白提取物对非酒精性脂肪肝大鼠COX-Ⅱ表达的影响

目的观察葱白提取物对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠COX-Ⅱ表达的影响。方法采用脂肪乳灌胃法复制非酒精性脂肪肝大鼠模型,同时施加不同剂量的葱白提取物进行治疗,并与易善复胶囊、绞股蓝总甙片做对照,观察不同处理组大鼠肝脏病理形态学的变化,应用免疫组化法观察大鼠肝内COX-Ⅱ的表达情况。结果与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织可见重度脂肪变,炎症细胞浸润,肝细胞坏死,汇管区渗出,大鼠肝内COX-Ⅱ表达明显增高。与模型组相比,鲜葱白提取物低、中、高剂量组能显著减轻肝脏脂肪变性(P<0.01),COX-Ⅱ表达明显下降(P<0.01)。结论鲜葱白提取物可以减轻灌胃脂肪乳诱导的NAFLD大鼠COX-Ⅱ的表达,从而减轻NAFLD的炎症。

G-CSF受体胞内区结合蛋白COXⅡ的分子克隆及相互作用验证

为寻找与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白,探讨其可能的信号传导机制,应用酵母双杂交技术从小鼠胎肝文库中筛选到与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白—细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基(COXⅡ);采用PCR技术从小鼠肌肉cDNA中克隆到全长COXⅡ,并应用哺乳动物细胞双杂交实验验证了COXⅡ与G-CSF受体胞内区相互作用;构建了一系列G-CSF受体胞内区短截体,应用细胞双杂交技术确定COXⅡ主要结合于G-CSF受体的Box3区;随后构建了COX Ⅱ-GFP融合表达载体,观察到COXⅡ在COS_7细胞中为全细胞分布。这些结果为揭示COXⅡ的新功能及发现G-CSFR新的信号传递通路提供了线索。

IL-4下调COPD肺泡Ⅱ型上皮细胞中COX-2和PDGF的表达

目的:探讨COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)中环氧合酶-2(COX-2)及血小板源性生长因子(PDGF)的表达及IL-4对其表达的影响。方法:用雄性Wistar大鼠建立吸烟大鼠COPD模型后取整肺做原代培养,培养出肺泡Ⅱ型上皮细胞。随机分为对照组和模型组,并用IL-4干预模型组的肺泡Ⅱ型上皮细胞。用免疫组化法检测细胞爬片COX-2、PDGF-A及PDGF-B的表达。结果:模型组COX-2和PDGF-A、PDGF-B表达明显增高;IL-4干预组表达显著降低。结论:COPD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中COX-2和PDGF的表达显著增高,IL-4可降低其表达。

^(60)Coγ射线诱导人淋巴细胞线粒体COXⅡ基因表达改变的研究

目的:研究电离辐射诱导人外周血永生化淋巴细胞株中线粒体COXⅡ基因表达水平的变化,以期为探索放射敏感生物标志物和解决放射生物学领域中快速剂量估算的难题提供科学依据。方法:采用不同剂量(0～15 Gy)^(60)Coγ射线照射指数生长期的人淋巴细胞株,于照射后不同时间点(0～72 h)收集细胞提取总RNA和总蛋白,分别用实时荧光定量PCR和Western blot方法测定COXⅡ基因表达水平的变化。结果:^(60)Coγ射线照射后的各个时间点上,COXⅡ基因在mRNA水平的变化无明显规律性。在蛋白水平上,与对照组相比,^(60)Coγ射线照射4和12 h后COXⅡ基因表达水平无显著变化(P>0.05),照射后24、48和72 h COXⅡ基因表达水平显著上调并且在不同范围内呈现良好的剂量-效应关系(P<0.05)。对比相同照射时间点COXⅡ基因的mRNA和蛋白水平的表达水平变化发现,两者无必然一致的趋势,但照射后48和72 h,COXⅡ蛋白的表达水平与照射时间呈良好的线性关系。结论:^(60)Coγ射线照射后48和72 h,COXⅡ蛋白表达水平与照射时间呈良好的线性关系,可作为新的辐射损伤标志物进一步研究验证。

胡黄连苷Ⅱ对脑缺血损伤后COX-2表达的影响及意义

目的探讨胡黄连苷Ⅱ对脑缺血损伤后COX-2表达的影响及其神经保护作用机制。方法应用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,按照随机对照原则,动物分为对照组、模型组、胡黄连苷组、LPS组和U0126组,每组再分为缺血6 h、12 h和24 h三个亚组。改良的神经功能评分(m NSS)法评价大鼠神经行为功能;原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹法检测脑组织COX-2表达水平。结果大鼠脑缺血损伤后,随着时间的延长模型组大鼠神经功能评分升高,皮质区神经凋亡增多,COX-2蛋白表达增强。胡黄连苷组和U0126组大鼠皮质区神经细胞凋亡和COX-2表达较模型组明显降低,LPS组大鼠早期神经细胞凋亡细胞与COX-2表达水平较高,但后期COX-2表达水平有所下降,损伤略有恢复。结论胡黄连苷Ⅱ可能通过降低COX-2通路的活化,抑制脑缺血后神经细胞凋亡和炎性反应而保护神经系统。

足月妊娠子宫蜕膜组织环氧化酶Ⅱ与前列腺素E合成酶2的表达与引产成功率的关系

目的研究足月妊娠人子宫蜕膜组织中环氧化酶Ⅱ(COXⅡ)与前列腺素E合成酶2(PTGES2)蛋白的表达与缩宫素引产成功率的关系。方法选择缩宫素引产成功与缩宫素引产失败的孕妇,于剖宫产术中取子宫蜕膜组织。行Western blot检测子宫蜕膜中COXⅡ与PTGES2蛋白的表达。结果缩宫素引产成功组与引产失败组子宫蜕膜组织COXⅡ蛋白的表达水平无明显差异。缩宫素引产成功组比引产失败组子宫蜕膜PTGES2蛋白的表达明显增高(P<0.05)。结论子宫蜕膜组织中PTGES2蛋白的表达量与缩宫素引产成功率关系密切。

环氧合酶-2与亚临床动脉粥样硬化关系的临床研究

目的:探讨亚临床动脉粥样硬化(AS)患者血清或血浆中环氧合酶Ⅱ(COX-2)的水平;COX-2水平与亚临床AS影响因素的关系;COX-2抑制剂对预防AS有潜在的临床应用价值。方法:应用酶联免疫法(ELISA)检测亚临床AS患者100例和40名健康人为正常对照组的血浆COX-2水平,并结合临床资料进行分析。结果:亚临床AS组COX-2水平[(10.84±3.11)U/L]明显高于正常对照组[(6.97±1.25)U/L],两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:COX-2水平与亚临床AS水平有明显相关性,测定血浆COX-2活性可作为亚临床AS的诊断、预后判断的参考指标;临床进行早期干预,拮抗COX-2的治疗可能有助于降低心血管意外发作风险。

蒙古马马胃蝇幼虫形态学及线粒体基因的研究

为了研究目前蒙古马马胃蝇流行种类,2019年1月在内蒙古呼和浩特市四子王旗收集到感染马胃蝇的8匹蒙古马,剖检后获取胃蝇幼虫。利用解剖镜、光学显微镜和扫描电镜对蒙古马马胃蝇幼虫进行形态学观察。同时选取20个蒙古马马胃蝇三龄幼虫,通过PCR方法,扩增蒙古马马胃蝇线粒体细胞色素氧化酶亚基(COXⅡ)基因、16S rRNA基因。利用MEGA 6.0软件对蒙古马马胃蝇细胞色素氧化酶亚基(COXⅡ)基因、16S rRNA基因与GenBank数据库中胃蝇属的其他种类同源序列进行比较并构建系统发育树。结果表明:蒙古马马胃蝇幼虫三龄幼虫领部棘刺,体节上的棘刺底部宽、刺尖细,口脊骨页部形态平滑,伪头小刺结构清晰,这些特征与黑腹胃蝇三期幼虫的形态相似。蒙古马马胃蝇与GenBank数据库中狂蝇属、黄蝇属、胃蝇属(肠胃蝇、黑腹胃蝇、红尾胃蝇)和皮蝇属的昆虫在系统发育树中分开,有一定遗传距离,且单独成一个分支。鉴于分离到的蒙古马马胃蝇形态上与黑腹胃蝇相似,但是线粒体基因存在变异,可能代表黑腹胃蝇的一个新变种。

大通犊牦牛组织线粒体COX酶活性与亚基COX-Ⅰ、Ⅱ mRNA表达的相关性研究

为探讨"大通犊牦牛"组织线粒体COX活性与亚基COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量之间的关系。采用酶联免疫分析法(ELISA)对犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性进行测定;绝对定量荧光PCR(Real-time PCR)检测组织中COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量。结果显示:大通犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性高于乐都犊牦牛;大通犊牦牛组织间COX-Ⅰ基因拷贝数明显高于乐都犊牦牛(P<0.05);大通犊牦牛组织间COXⅡ拷贝数以及乐都犊牦牛COXⅡ拷贝数均差异显著(P<0.05),大通犊牦牛不同组织中的COX-Ⅰ、Ⅱ的表达量与乐都犊牦牛相比差异显著(P<0.05)。结果表明:含野血的大通犊牦牛组织线粒体COX的氧化磷酸化作用要强于家犊牦牛;线粒体COX两种亚基mRNA变化与组织和品种有关;COX活性变化可使COX-Ⅰ、ⅡmRNA发生失调。

^(60)Coγ射线诱导L02人正常肝细胞COXⅡ基因表达、ATP水平和细胞活力改变

目的探讨照射剂量和照射时间对电离辐射诱导L02人正常肝细胞(简称"L02细胞")的线粒体编码基因细胞色素c氧化酶(COX)Ⅱ基因表达、三磷酸腺苷(ATP)水平和细胞活力变化的影响。方法 采用2×7析因设计方法。0、1、3、5、8、10、15 Gy剂量60Coγ射线分别照射L02细胞24、48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR法检测COXⅡmRNA表达水平,蛋白质印迹法检测COXⅡ蛋白表达水平,ATP发光检测试剂盒和CCK-8试剂盒检测细胞内ATP水平和细胞活力。结果 照射时间与照射剂量对L02细胞的COXⅡmRNA及蛋白表达水平上调、ATP水平升高和细胞活力下降的影响存在交互作用(F值分别为92.43、267.40、6.99、116.11,P<0.05或P<0.001)。在一定照射剂量范围内,照射后24 h COXⅡ蛋白表达水平、照射后24、48 h ATP水平和细胞活力分别与照射剂量存在剂量-效应关系(P<0.05或P<0.01)。结论 照射剂量和照射时间的交互作用影响60Coγ照射诱导的L02细胞COXⅡ基因表达和细胞内ATP水平与细胞活力。