DNA-PKcs在DNA损伤修复中的作用及机制

机体在体内因素如DNA碱基错配、自身不稳定性、机体代谢产生活性氧自由基(ROS)等,体外因素如辐射、化学毒物、药物、病毒和霉菌等作用下,可以造成DNA损伤。DNA损伤有碱基损伤、错配、DNA单链或双链断裂、嘧啶二聚体形成等多种类型。其中,DNA双链断裂(DSB)是一种非常严重的损伤类型。DSB的修复方式主要有两种,分别是同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)[1]。

NU7026抑制DNA-PKcs对辐射旁效应中L-02细胞增殖、凋亡、抗氧化的影响

目的探讨NU7026抑制DNA-PKcs对辐射旁效应中L-02细胞增殖、凋亡、抗氧化的影响。方法构建辐射旁效应模型。实验分为空白组(阴性对照)、旁效应组(辐射条件培养液处理)、联合组(辐射条件培养液+NU7026)、辐照组(直接辐照)。采用MTT法、克隆形成实验、微核实验、活性氧(ROS)试剂盒、抗氧化活性试剂盒、荧光分光光度法、流式细胞术、Western blotting分别检测细胞存活率、克隆形成率、微核率、活性氧水平、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)活性、丙二醛(MDA)含量、线粒体膜电位、细胞凋亡和周期阻滞及相关蛋白的表达。结果与空白组比较,其他3组的细胞存活率、克隆形成率、SOD和GSH活力、线粒体膜电位降低(P<0.05);微核率、MDA、ROS含量、凋亡率及G2/M期阻滞升高(P<0.05)。与旁效应组比较,联合组、辐照组的细胞存活率、克隆形成率、SOD和GSH活力、线粒体膜电位降低(P<0.05);微核率、MDA、ROS含量、凋亡率及G2/M期阻滞升高(P<0.05)。结论NU7026抑制DNA-PKcs能降低辐射旁效应中L-02细胞增殖、抗氧化和抗凋亡的能力。

ERCC1、DNA-PKcs蛋白在非小细胞肺癌中的表达与预后的关系

背景与目的已有的研究结果显示:ERCC1、DNA-PKcs是重要的DNA损伤修复因子,在肿瘤发生及预后中起着重要作用,本研究的目的是探讨DNA修复因子ERCC1,DNA-PKcs蛋白在非小细胞肺癌中表达的临床意义及其与NSCLC预后的关系。方法收集116例非小细胞肺癌组织及12例癌旁正常肺组织石蜡标本制成组织芯片,利用免疫组化SP法检测ERCC1、DNA-PKcs的表达,并分析其与临床各因素的关系。结果116例NSCLC组织中ERCC1、DNA-PKcs蛋白的阳性表达率分别为40.5%(47/116)、75%(87/116),ERCC1在肺癌组织和癌旁正常肺组织中的表达无统计学差异(P>0.05),而DNA-PKcs在癌组织中表达高于癌旁组织(P=0.000)。ERCC1的表达与肺癌分化程度、肿瘤大小和TNM分期密切相关(P<0.05),ERCC1阳性表达组5年生存率(53.2%)高于阴性表达组(26.1%)(P=0.014),但ERCC1表达不是独立的预后因素。DNA-PKcs表达与临床病理特征及预后无关。结论ERCC1阳性者预后较好,提示其表达对预后评估有一定的指导价值。

肺癌组织中DNA修复酶MGMT、DNA-PKcs和Ku的表达变化

[目的 ]检测肺癌组织中DNA损伤修复酶MGMT、DNA PKcs和Ku的表达变化 ,探讨其表达和肺癌发生发展及临床病理特征之间的关系。 [方法 ]采用免疫组织化学方法 (LSAB法 )检测 1 0例肺部良性病变和 44例肺癌标本中上述修复酶的表达情况 (每一标本同时检测正常及肿块两个部位 )。同时还检测了肺癌组织中突变型P53蛋白的表达。[结果 ]随着肿瘤的进展MGMT的表达可被诱导增强 ,DNA PKcs和Ku的表达则降低 ,三种修复酶在肺肿瘤组织的表达均较良性肺组织低 ,差异有显著性。DNA PKcs和Ku的表达具有明显相关性。突变型P53蛋白阳性标本中MGMT蛋白的平均表达得分较P53蛋白阴性标本显著降低。DNA损伤修复酶的表达和病人的年龄、性别、组织学分型、分级无关。 [结论 ]DNA损伤修复酶表达的改变在细胞的恶性转变过程中至少起到了一定的作用 。

DNA-PKcs表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系

目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1(鼻咽高分化鳞癌细胞株)和CNE-2(鼻咽低分化鳞癌细胞株)中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的催化亚基DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数,并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值,以及四氮唑蓝比色分析法(MTT法)检测60Co-γ线4Gy照射后12h细胞的存活率,以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术(RT-FQ-PCR)检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平DNA-PKcs基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高,MID值分别为2.78、1.61,SF2值分别为0.627、0.341;4Gy照射后12h的存活率分别为88.2%、72.3%;RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有DNA-PKcs基因的表达,其相对表达量之比为7.54±2.71(t=4.17,P=0.014),表达差异有统计学意义,DNA-PKcs基因在CNE-2细胞中存在时间、剂量依赖关系。结论实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感,DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。

顺铂对A549细胞DNA修复酶MGMT和DNA-PKcs表达的影响

[目的]探讨在DNA损伤剂顺铂作用下 ,A549细胞内DNA修复基因六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖的蛋白激酶复合物催化亚单位 (DNA_PKcs)的表达变化。[方法]MTT法分析顺铂对A549细胞生存力的影响 ;彗星实验研究顺铂对DNA损伤的程度 ;RT_PCR分析不同顺铂作用时间修复酶mRNA水平的变化。[结果]顺铂对A549细胞的生长有明显的抑制作用 ,且为剂量依赖性。低浓度 (IC20 剂量 )顺铂作用下 ,DNA损伤程度的变化与作用时间成正比 ,且伴随MGMT和DNA_PKcs的表达上升。停止作用后 ,DNA损伤程度减轻 ,修复基因的表达也逐渐恢复至正常水平。

NSCLC中DNA-PKcs的表达及其与凋亡相关蛋白关系的研究

目的 检测非小细胞肺癌 (NSCLC)中DNA依赖蛋白激酶催化亚基 (DNA PKcs)的表达 ,探讨其与凋亡相关蛋白表达之间的关系。方法 采用免疫组化SP法检测 113例NSCLC患者肿瘤组织中DNA PKcs、p5 3和bcl 2的表达。 结果 NSCLC中DNA PKcs、p5 3和bcl 2的检出率分别为 89.3 8%、61.95 %及5 9.2 9% ;DNA PKcs的表达顺序依次为细支气管肺泡癌 >腺癌 >腺鳞癌 >鳞癌 ,而且DNA PKcs表达水平随肿瘤分化程度的增高亦逐渐增高 ,差异均具有高度显著性 (P <0 .0 5 ) ,但其表达与淋巴结转移无明显关系 ;p5 3在不同临床病理类型NSCLC中的表达无明显差别 ;bcl 2在不同组织学类型NSCLC中的表达顺序依次为鳞癌 >腺鳞癌 >腺癌 >细支气管肺泡癌 ,差异具有高度显著性 (P <0 .0 1) ,但其表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移无关 ;DNA PKcs与 p5 3 (P <0 .0 1)、p5 3和bcl 2 (P <0 .0 5 )的表达之间有显著相关性。 结论 DNA PKcs高表达导致的DNA损伤修复系统活性增高以及突变型p5 3和bcl 2过表达导致的凋亡抑制相互影响、共同作用 。

肝癌及不同发育阶段小鼠肝组织中DNA-PKcs的表达及其对细胞增殖作用的研究

目的:研究DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)在小鼠不同发育阶段肝脏组织和肿瘤组织中的表达,明确其促细胞增殖和在肿瘤发生发展中的作用及机制。方法:采用免疫组织化学方法和蛋白印迹检测小鼠不同发育阶段肝脏组织和肿瘤组织中DNA-PKcs的蛋白表达。通过干扰RNA技术沉默肝肿瘤HepG2细胞中DNA-PKcs的表达,通过细胞增殖实验和裸鼠致瘤实验观察肿瘤细胞增殖和致瘤能力的变化。蛋白印迹法检测细胞增殖相关信号通路蛋白p-GSK3β和c-myc的表达水平。结果:在发育过程中,随着细胞增殖能力降低,肝组织中DNA-PKcs表达水平下降,在成年鼠肝组织中DNA-PKcs只有微弱表达。而在肿瘤组织细胞中DNA-PKcs表达显著增高(P<0.01)。细胞生长曲线结果显示,DNA-PKcs表达抑制后,HepG2细胞增殖能力受到明显抑制(P<0.01),致瘤能力也显著降低。信号通路蛋白分析发现DNA-PKcs抑制导致GSK3β磷酸化水平和c-myc蛋白水平降低(P<0.01)。结论:DNA-PKcs表达水平与肝脏细胞的增殖能力密切相关。DNA-PKcs的高表达可能通过调节细胞的增殖,参与肝脏肿瘤的发生和发展过程,作用机制和Wnt/GSK/c-myc信号通路相关。

siRNA抑制DNA-PKcs表达及对HeLa细胞增殖的影响

背景与目的:建立抑制DNA_PKcs表达的细胞模型,以此探讨DNA_PKcs的功能。材料与方法:构建DNA_PKcs的siRNA抑制表达载体,利用Lipofectamine介导,转染HeLa细胞,筛选稳定表达的转化克隆。Westernblot检测DNA_PKcs表达。通过细胞生长速度检测细胞辐射敏感性变化。结果:设计了作用于DNA_PKcs不同位点的3条siRNA,并构建表达质粒,转染HeLa细胞,获得了3个稳定转化克隆,Westernblot分析表明其DNA_PKcs表达受到明显抑制,细胞对γ射线和紫外线的敏感性增加,接种裸鼠后的肿瘤生长速度减慢。结论:成功建立了DNA_PKcs表达抑制细胞模型,并且发现DNA_PKcs表达抑制后除影响细胞的辐射敏感性外,还可能与肿瘤细胞增殖有关。

DNA-PKcs表达与乳腺癌临床病理特征关系的研究

目的:研究DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)表达与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系。方法:应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测101例浸润性乳腺癌中DNA-PKcs以及ER、PR、c-erbB-2的表达情况,采用χ2检验及Spearman秩和相关检验分析结果。结果:DNA-PKcs表达与浸润性乳腺癌的肿瘤大小、淋巴结转移数量、TNM分期均呈负相关(分别为r=-0.319,P=0.001;r=-0.378,P=0.000;rs=-0.428,P=0.000);与ER表达呈正相关(rs=0.279,P=0.005);与患者年龄、肿瘤组织学分级、及PR、c-erbB-2表达的关系无统计学意义(P>0.05)。结论:DNA-PKcs低表达与浸润性乳腺癌的进展及淋巴结转移关系密切,有可能成为预测乳腺癌预后重要的生物学指标。

DNA-PKcs在复发性卵巢癌中的表达及意义

目的:检测初发与复发卵巢癌组织中DNA-PKcs的表达,探讨DNA损伤修复与卵巢癌耐药的关系。方法:用免疫组化SP法测定36例卵巢癌的初发和复发肿瘤组织中DNA-PKcs的表达。结果:初发肿瘤组织中DNA-PKcs表达为中度及强阳性者占36%;复发肿瘤组织中表达为中度及强阳性者占83%。36例中29例复发癌组织DNA-PKcs的表达较自身初发癌组织增强,这种表达的变化与肿瘤初发时的病理类型、病理分级和临床分期无关。结论:在卵巢癌的化疗过程中肿瘤细胞的DNA修复能力增强,这可能是卵巢癌顺铂耐药产生的重要机理之一。

DNA-PKcs的研究进展

DNA-蛋白激酶（catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs）是DNA依赖蛋白酶（DNA-dependentprotein kinase,DNA-PK）的催化亚单位,属于PI3K家族,主要从事双链DNA断裂修复,在细胞的凋亡和防止肿瘤形成及肿瘤的耐药、耐辐射中起着作用。我们对DNA-PKcs的结构功能、作用机制及在肿瘤中的作用作一探讨。现将其综述如下。

DNA-PKcs在乳腺癌组织中的表达与分期相关性研究

目的:探讨乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)的催化亚单位DNA-PKcs的表达变化与分期的相关性。方法:采用免疫组化SP法检测30例Ⅰ期乳腺癌组织,11例ⅢB、ⅢC期乳腺癌组织及19例Ⅳ期乳腺癌组织中DNA-PKcs的表达情况。结果:DNA-PKcs在Ⅰ期乳腺癌组织中和其癌旁正常组织中均呈高表达,两者表达具有一致性(P>0.05)。DNA-PKcs在ⅢB、ⅢC期和Ⅳ期乳腺癌组织中的表达明显低于Ⅰ期乳腺癌(P<0.05和P<0.01)。同时,把ⅢB、ⅢC期和Ⅳ期合并后,与Ⅰ期比较,DNA-PKcs表达差异有极显著性意义(P<0.01)。结论:DNA-PKcs的低表达在乳腺癌发生进展和远处转移中有重要意义,对乳腺癌的分期有一定指导意义,可能成为乳腺癌分期的生物学指标。

用酵母双杂交系统鉴定DNA-PKcs磷酸化簇区域和DNA-PKcs单链抗体anti-DPK3-scFv间的相互作用

目的:构建DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)磷酸化簇区域的酵母双杂交诱饵载体及针对该区域的单链抗体anti-DPK3-scFv的猎物蛋白的表达载体,并进行活性和相互作用鉴定。方法:应用PCR方法扩增DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并将它们分别克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7中,经酶切和测序鉴定正确后,用LiAc法转化到酵母菌株AH109中,鉴定诱饵蛋白和猎物蛋白的毒性和自激活活性,并通过酵母双杂交方法验证DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv的相互作用。结果:扩增出DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并分别将它们克隆至p GBKT7和p GADT7载体中,转化酵母细胞发现它们对酵母细胞的生长均无毒害作用,自激活活性分析显示诱饵质粒和猎物质粒均无自激活活性,并证实DNA-PKcs磷酸化簇区域能够与anti-DPK3-scFv在体外直接相互作用。结论:构建了DNA-PKcs磷酸化簇的诱饵质粒p GBKT7-DPC,为后续筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白奠定了实验基础。

RNA干扰抑制胰腺癌细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性的影响

目的探讨稳定表达的siRNA抑制DNA-PKcs基因表达对胰腺癌细胞BxPC-3放射敏感性的影响。方法以人胰腺癌细胞BxPC-3为研究对象,将预先设计的siRNA与质粒连接。构建质粒与阴性对照质粒分别转化大肠杆菌,经克隆、扩增、纯化后转染BxPC-3细胞,潮霉素筛选,以半定量Westernblot检测靶蛋白表达变化,用细胞克隆计数实验检测放射敏感性变化。结果成功构建以DNA-PKcs基因mRNA为靶序列的pSilencer2.1质粒,经潮霉素筛选出稳定的整合目的质粒的BxPC-3细胞,DNA-PKcs蛋白被抑制最大达到83%,实验组D0、Dq及SF2(1.284±0.017、4.006±0.023和0.567±0.045)均明显低于阴性对照组(1.458±0.026、4.840±0.019和0.833±0.076)(P<0.001)。SER为1.47。结论针对DNA-PKcs基因的siRNA表达载体稳定转染人胰腺癌细胞BxPC-3,能够引发DNA-PKcs表达抑制,进而产生放射增敏作用。

Bcl-x_L及DNA-PKcs在ⅡB期骨肉瘤中的表达及临床意义

目的 探讨Bcl-xL及DNA-PKcs在ⅡB骨肉瘤中的表达及与预后的关系。方法 应用免 疫组化方法检测40例ⅡB期骨肉瘤中Bcl-xL及DNA-PKcs的表达,并分析其与无瘤生存率及生存时间 的关系。结果 Bcl-xL及DNA-PKcs表达阳性率分别为55%及60%;复发转移组Bcl-xL表达阳性率 明显高于无瘤生存组(P=0.001);Bcl-xL表达阳性者无瘤生存率较阴性者低(P=0.0039)。复发转移者 DNA-PKcs阳性率同样显著高于无瘤生存者(P=0.002);DNA-PKcs阳性组累计无瘤生存率也明显低于 阴性组(P=0.0078)。多因素分析提示Bcl-xL及DNA-PKcs的表达是影响无瘤生存率的预后因素。结 论 Bcl-xL阳性表达者预后差,其作用与抑制肿瘤细胞凋亡及化疗耐药相关。DNA-PKcs的表达与骨肉 瘤的不良预后关系密切,表明骨肉瘤细胞中的凋亡抑制普遍存在,并使肿瘤细胞修复化疗药物所致DNA 损伤的能力增强。

DNA-PKcs及S100A9表达水平对术后放化疗宫颈癌患者4年期预后评价

目的评估术后放化疗宫颈癌患者S100A9与DNA-PKcs表达水平,探讨两种指标与患者预后的相关性。方法选取该院2014年1月—2015年3月诊断的宫颈癌患者80例,所有患者均在该院接受同步化放疗。采用免疫组化检测并比较宫颈癌及癌旁组织的S100A9与DNA-PKcs表达水平。随访4年,对患者中位生存时间进行统计。结果S100A9阳性组中位生存时间(34.3月)显著高于其阴性组(14.6月),差异有统计学意义(Z=6.251,P=0.012);DNA-PKcs阳性组的中位生存时间(17.2月)显著低于其阴性组(28.4月),差异有统计学意义(Z=5.856,P=0.019)。多因素Cox回归分析显示,DNA-PKcs表达水平是宫颈癌患者随访4年预后危险因素,而S100A9是保护性因素(P<0.05)。结论宫颈癌组织中S100A9与DNA-PKcs表达状态与患者放化疗疗效和预后相关,可作为患者放化疗敏感性的预测分子,具有重要临床意义。

DNA-PKcs在乳腺浸润性导管癌中的表达与病理分级的关系

目的探讨乳腺浸润性导管癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)的催化亚单位DNA-PKcs的表达变化情况与病理分级的关系.方法采用免疫组化SP法检测37例Ⅰ级分化乳腺癌组织,44例Ⅱ级分化乳腺癌组织及39例Ⅲ级分化乳腺癌组织中的DNA-PKcs的表达情况.结果DNA-PKcs在Ⅰ级分化乳腺癌组织中呈高表达,在Ⅱ级分化乳腺癌组织中的表达有降低趋势(与Ⅰ级分化乳腺癌组织比较P>0.05,与Ⅲ级分化乳腺癌组织比较P<0.01),在Ⅲ级分化乳腺癌组织中的表达明显低于Ⅰ级分化乳腺癌(P<0.01).结论DNA-PKcs在乳腺癌组织中的表达情况是随着乳腺癌的病理分级变化而变化的,从高分化癌到中分化癌到低分化癌呈逐渐降低趋势,DNA-PKcs与乳腺癌的预后有一定相关性,可能成为一个判断乳腺癌预后的分子生物学指标.

Cancer Cell:DNA-PKcs是驱动前列腺癌转移的关键分子

大多数癌症从其原发位置扩散到全身各处时,才会变得致命。最近,美国托马斯杰弗逊大学的研究人员发现,一个分子可能是驱动前列腺癌转移的重要调控因子。