雷公藤红素增强多柔比星抑制肝癌细胞系Huh7细胞活性的实验研究

目的观察雷公藤红素增强多柔比星对肝癌细胞的杀伤活性及机制。方法设0.5、1、2μmol/L浓度的雷公藤红素为雷公藤红素1、2、3组,设0.1、1g/m L浓度的多柔比星为多柔比星1、2组;MTT法检测多柔比星单独治疗及联合雷公藤红素治疗对肝癌细胞系Huh7的杀伤活性。荧光定量PCR方法检测人正常胎肝细胞系L-O2及肝癌细胞系Huh7、Hep G2和PLC的PKM2表达水平。MTT法检测PKM2表达载体转染对雷公藤红素联合多柔比星杀伤Huh7细胞疗效的影响。结果与对照组Huh7细胞活力零抑制率比较,雷公藤红素1、2、3组分别为(2.6±0.9)%、(4.7±1.3)%(P均<0.05)、(8.8±1.9)%(P<0.05);多柔比星1、2组分别为(7.5±1.9)%、(61.4±4.2)%(P均<0.05);1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星较多柔比星1、2组,Huh7细胞活力抑制率明显上升[(58.7±3.8)%比(7.5±1.9)%,P<0.05;(89.7±6.7)%比(61.4±4.2)%,P<0.05]。PKM2相对表达水平,相对人正常肝细胞系L-O2细胞系的(1.0±0.05),Huh7细胞系为(15.2±0.6)(P<0.05),Hep G2细胞系为(11.8±0.5)(P<0.05),PLC细胞系为(13.4±0.7)(P<0.05);雷公藤红素1、2、3组分别下调为(0.70±0.05)(P<0.05)、(0.42±0.04)(P<0.05)、(0.31±0.03)(P<0.05);多柔比星组无下调作用;1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星后PKM2相对表达水平较多柔比星1、2组明显下降[(0.44±0.04)比(0.98±0.07),P<0.05;(0.41±0.03)比(1.01±0.07),P<0.05]。转染PKM2表达载体后,1μmol/L雷公藤红素联合0.1、1g/m L多柔比星对Huh7细胞活力抑制率较未转染组下降[(60.5±4.3)%比(19.3±2.0)%,P<0.05;(91.6±6.9)%比(69.6±4.5)%,P<0.05]。结论雷公藤红素通过下调PKM2的表达抑制肿瘤细胞的糖代谢,增强多柔比星对肝癌细胞系Huh7的杀伤活性。

miR-3612靶向SEMA4C调控肝细胞癌细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-3612靶向信号素(SEMA)4C对肝细胞癌细胞增殖与侵袭能力的影响。方法:收集2020年5月至2021年9月间在皖南医学院第一附属医院弋矶山医院手术切除的肝细胞肝癌的40对癌组织和相应癌旁组织,常规培养肝细胞癌Hep3B和Huh7细胞,将其分为对照组、miR-3612 mimics-NC组、miR-3612 mimics组、miR-3612 inhibitor-NC组、miR-3612 inhibitor组、si-NC组、si-SEMA4C组、mimics-NC+pcDNA-NC组、miR-3612 mimics+pcDNA-NC组和miR-3612 mimics+pcDNA-SEMA4C组,用转染试剂将相应的核酸和质粒转染各组细胞。qPCR法检测miR-3612和SEMA4C mRNA在肝细胞癌组织和Hep3B和Huh7细胞中的表达,双荧光素酶报告基因实验和免疫共沉淀(RIP)实验验证miR-3612与SEMA4C的结合及调控关系,qPCR法和WB法检测转染后各组Hep3B和Huh7细胞中miR-3612、SEMA4C mRNA和蛋白的表达,CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测各组Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果:miR-3612在肝细胞癌组织和Hep3B和Huh7细胞中呈低表达(P<0.001),而SEMA4C则呈高表达(P<0.001),过表达miR-3612可抑制Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移、侵袭和vimentin、SEMA4C蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达(P<0.05或P<0.01或P<0.001),敲低miR-3612则促进Hep3B和Huh7细胞的增殖、迁移、侵袭和SEMA4C蛋白的表达(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实miR-3612与SEMA4C可直接结合(P<0.001),miR-3612与SEMA4C的表达呈负相关也间接证明了这一点(P<0.001)。敲减SEMA4C能明显抑制Hep3B、Huh7细胞的增殖、侵袭和迁移能力(P<0.05或P<0.01或P<0.001),过表达SEMA4C可逆转过表达miR-3612对Hep3B和Huh7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结论:miR-3612通过调控SEMA4C表达影响Hep3B和Huh7细胞的恶性生物学行为,miR-3612有望成为临床肝细胞癌治疗的潜在靶点。

乳糖酸修饰mPEG-PLGA-PLL纳米粒靶向肝癌细胞Huh7的研究

背景与目的:去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是一种肝细胞特异性表达的膜表面蛋白,能够特异性地识别带有半乳糖残基的糖蛋白。乳糖酸含有半乳糖基团,可以作为靶向肝癌的特异性配基。该研究旨在探讨乳糖酸修饰的聚乙二醇/聚丙交酯-乙交酯/聚赖氨酸[methoxy-poly(ethylene glycol)-b-poly(D,L-lactide-co-glycolide)-b-poly(L-lysine)(mPEG-PLGA-PLL)纳米粒,mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs)]对肝癌Huh7靶向效果,为构建新型的靶向肝癌的纳米递送系统提供实验数据。方法:MTT法确定Huh7细胞摄取mPEG-PLGA-PLL NPs与mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs适当的浓度;通过激光共聚焦和荧光显微镜定性观察Huh7对罗丹明B标记的mPEG-PLGA-PLL NPs和mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs的摄取;并采用流式细胞计数仪定量研究Huh7细胞对两者的摄取差别;尾静脉注射荷Huh7瘤裸鼠研究两者体内分布情况。结果:mPEG-PLGA-PLL NPs与mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs的浓度在0.2 mg/mL时细胞存活率较高且对Huh7细胞的毒性较小。激光共聚焦断层扫描显示Huh7细胞可以较好地摄取mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs,同时流式细胞仪定量显示mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs在Huh7细胞的分布较mPEG-PLGA-PLL NPs高40%(P<0.05)。mPEG-PLGA-PLL NPs与mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs在移植瘤中的分布明显多于其他脏器,并且随时间的延长mPEG-PLGA-PLL-GAL NPs体现了更好的靶向效果。结论:体外与体内实验证明乳糖酸修饰的mPEG-PLGA-PLL NPs对肝癌细胞Huh7有很好的靶向效果,可为肝癌的靶向治疗提供较好的药物载体。

FOXK1对肝癌高转移细胞系Huh7侵袭和迁移能力的影响

目的探讨叉头框转录因子1(FOXK1)对肝癌高转移细胞Huh7侵袭和迁移能力的影响。方法采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测40例肝癌组织及其癌旁正常组织FOXK1 mRNA的表达,qRT-PCR和Western blot检测正常肝细胞HL7702、肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白的表达。小RNA干扰技术下调FOXK1表达后,qRT-PCR和Western blot检测肝癌高转移细胞Huh7 FOXK1 mRNA和蛋白的表达,Transwell实验检测其侵袭和迁移能力。结果 qRT-PCR检测结果显示,肝癌组织中FOXK1 mRNA的表达高于癌旁正常组织(2.87±0.21 vs 1.35±0.11,P=0.004);qRT-PCR和Western blot检测结果显示,相比正常肝细胞HL7702,肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.001)。下调FOXK1表达后,肝癌高转移细胞Huh7中FOXK1 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.01),侵袭和迁移细胞数目明显减少(P<0.01)。结论下调FOXK1表达能抑制肝癌高转移细胞Huh7侵袭和迁移能力。

WWP2干扰对Huh7肝癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究

目的探讨WWP2对Huh7肝癌细胞系的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究。方法通过实时定量PCR(q PCR)、RNA干扰、流式细胞仪分析细胞周期及凋亡,了解WWP2在Huh7肝癌细胞周期的中作用。结果在肝癌组织中,WWP2 mRNA水平显著性表达;敲除细胞中的WWP2会抑制细胞增殖、使细胞停滞在G1期,并诱导细胞凋亡。结论 WWP2有可能通过调控细胞凋亡而促进肝癌细胞生长。

丹参酮ⅡA对人肝癌细胞Huh7增殖与凋亡的影响

目的验证丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TanⅡA)对人肝癌细胞Huh7增殖和凋亡的影响。方法使用CCK-8法检测丹参酮ⅡA对Huh7细胞增殖活力的影响;在倒置显微镜下观察细胞形态学的变化;流式细胞仪分析丹参酮ⅡA对Huh7细胞凋亡与周期的影响;Western blotting法检测丹参酮ⅡA对Huh7细胞内活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PARP)、半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9)和p53表达的影响。结果与对照组相比,丹参酮ⅡA显著降低Huh7细胞的增殖活力,给药24小时后,其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值为8.76μmol/L。细胞凋亡率随着丹参酮ⅡA浓度的增大而升高,细胞周期阻滞在G1期;能够显著促进凋亡蛋白P53、cleaved-PARP和caspase-9的表达。结论丹参酮ⅡA能够显著抑制Huh7细胞增殖,促进其凋亡。

miR-29b的作用靶点及其对Huh7细胞增殖及凋亡的干预作用

目的探讨mi R-29b(micro RNA-29b)的作用靶点及其对肝肿瘤细胞系Huh7细胞增殖及凋亡的干预作用。方法荧光定量PCR检测正常肝细胞系LO2及肝癌细胞系Huh7的mi R-29b和Mcl-1表达水平。通过生物信息学分析预测Mcl-1基因是否受micro RNA调控。将mi R-29b模拟物通过Lipofectamine 2000顺时转染Huh7细胞,检测mi R-29b对Mcl-1表达水平的影响。MTT法检测mi R-29b模拟物转染对Huh7细胞增殖的影响。Annexin V/PI染色法检测mi R-29b对Huh7细胞凋亡的影响。结果肝肿瘤细胞相比于正常肝细胞高表达Mcl-1(3.42±0.15比1.00±0.04,P<0.05)低表达mi R-29b(0.43±0.04比1.00±0.06,P<0.05),在肝癌细胞中转染mi R-29b可使Mcl-1的表达水平下降(0.37±0.03比1.03±0.07,P<0.05),转染mi R-29b可抑制Huh7细胞的增殖(0.85±0.11比1.68±0.17,P<0.05)并诱导其发生凋亡[(28.4±2.10)%比(3.6±0.06)%,P<0.05]。结论 Mi R-29b下调Huh7细胞Mcl-1蛋白的表达并诱导其发生凋亡。

克班宁对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究异喹啉生物碱克班宁对肝癌细胞株Huh7的生长抑制作用及促凋亡作用。方法用不同浓度的克班宁作用于Huh7细胞后,按照CCK-8法检测克班宁对肝癌细胞增殖的影响,并据此将后面的实验分为对照组和给药组(36、48、60μg·mL^(-1));利用形态学实验观察克班宁对肝癌细胞生长和状态的影响,平板克隆实验观察细胞克隆形成能力;Hoechst 33258实验和流式细胞术检测细胞凋亡状态和水平;Western blot检测细胞中BAX、Bcl-2、PARP凋亡相关蛋白及AKT、p-AKT、FoxO3a、p-FoxO3a的表达情况。结果 与对照组相比,克班宁可明显抑制Huh7细胞的增殖能力,抑制作用呈剂量和时间依赖性;且可诱导Huh7细胞出现明显的形态学变化;并在长时间内影响其克隆形成能力;同时还显著促进细胞凋亡,上调PARP、BAX蛋白的表达,下调Bcl-2、p-AKT、p-FoxO3a蛋白的表达。结论 克班宁不仅能抑制肝癌细胞株Huh7的增殖,还能促进细胞凋亡,且其促凋亡作用有可能是通过抑制AKT/FoxO3a信号通路产生的。

大波斯菊苷抗肝癌活性及作用机制

目的探讨大波斯菊苷(Apigenin-7-O-Glucoside,AGL)对肝癌Huh7细胞活性和Huh7细胞荷瘤裸鼠肿瘤增长的抑制效果。方法CCK-8法检测AGL对Huh7细胞的增殖抑制作用及半数抑制浓度,线粒体膜电位测定方法分析经AGL处理后Huh7细胞的早期凋亡程度,流式细胞术分析AGL对Huh7细胞凋亡的影响,结合Western blot检测凋亡与炎性反应相关蛋白的表达水平,探讨其可能的作用机制;分析AGL对荷瘤裸鼠肿瘤增长速度的影响,HE染色观察给药后小鼠脏器的病理状态,ELISA试剂盒测定血清中的炎性反应相关因子。结果Huh7细胞经AGL处理后,线粒体膜电位显著降低,细胞内ROS含量升高,其中Huh7细胞经50μmol/L AGL处理后凋亡率增加至25.23%,同时细胞中Bax、Bad、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达升高,Bcl2和Bcl-xL的表达降低,NF-κB、IKKα/β和IκBα的磷酸化水平明显降低;肿瘤的增长速度降低,血清中IL-6和TNF-α的含量显著降低,IL-2和IL-10的水平升高。结论AGL能够促进Huh7细胞的凋亡,阻碍Huh7荷瘤裸鼠的肿瘤发展,其机制可能与NF-κB通路相关。

GPC3特异的siRNA筛选和对肝癌细胞增殖能力的影响

目的筛选特异靶向GPC3的siRNA和探讨GPC3在肝癌中的作用机制。方法设计靶向GPC3的siRNA,转染huh7细胞后荧光定量PCR检测其对GPC3表达的抑制效果;选用抑制效果明显的siRNA下调GPC3表达后,WesternBlot检测GPC3的蛋白表达水平,并用Edu检测方法对Huh7细胞的增殖能力进行检测。结果成功筛选出一条抑制效率达到74.87%的特异靶向GPC3的siRNA,其可以显著抑制GPC3的转录翻译;同时,Edu检测发现当GPC3表达下调后,Huh7细胞的增殖能力下降。结论 GPC3的表达有利于HCC的增殖,而有效靶向GPC3的siRNA可为更进一步的研究提供有利手段。

HBx蛋白羧基端30个氨基酸缺失对肝癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨羧基端缺失了30个氨基酸的乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)突变体ΔHBx和野生型HBx对肝癌细胞Huh7生物学行为的影响。方法:脂质体介导pcDNA3ΔHBx和pcDNA3HBx重组体转染人HBV(-)的肝癌细胞Huh7。PCR扩增Neo基因及Western blot检测转染重组体。运用细胞生长曲线绘制、平板克隆形成、流式细胞仪和裸鼠成瘤实验对转染pcDNA3ΔHBx、pcDNA3HBx和pcDNA3的细胞生物学活性进行检测。结果:pcDNA3ΔHBx组细胞生长速度较pcDNA3HBx组和pcDNA3组减慢,其倍增时间延长;pcDNA3ΔHBx组克隆形成率较pcDNA3HBx组和pcDNA3组下降;细胞周期检测显示pcDNA3ΔHBx表达使Huh7细胞G0/G1期→S期的进程明显减慢。结论:HBx羧基端缺失了30个氨基酸的突变体比野生型HBx具有明显抑制细胞增殖的能力,提示该区域对于HBx功能发挥起着至关重要的作用。

GPR49基因对肝癌细胞增殖侵袭能力的影响

目的探讨肝癌细胞系Huh7细胞中G蛋白偶联受体49(GPR49)基因对肝癌细胞侵袭能力的影响及其分子生物学机制。方法根据转染的小干扰RNA(si-RNA)不同,将Huh7细胞分为GPR49-siRNA(si-GPR49)组和阴性对照NC-siRNA(si-NC)组,另设未转染Huh7细胞为对照组(control组)。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blot法分别检测3组细胞GPR49、细胞周期素D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达。采用MTT法和Transwell法分别检测各组细胞增殖能力和侵袭能力。结果 si-GPR49组GPR49 mRNA的相对表达量为control组的(23.8±3.1)%(P<0.05)。与control组相比,si-GPR49组GPR49、cyclin D1、MMP9蛋白的表达量均明显降低(均为P<0.05)。MTT检测细胞增殖能力实验结果显示,si-GPR49组细胞在72 h的吸光度(OD)值(0.53±0.12)明显低于control组(1.35±0.28),差异有统计学意义(P<0.05)。si-GPR49组平均穿膜细胞数为(13.6±2.5)个,明显低于control组的(65.3±6.1)个,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPR49-siRNA可抑制Huh7细胞GPR49基因表达。其机制可能是通过降低cyclin D1水平抑制Huh7细胞的增殖能力,通过影响MMP9蛋白表达水平抑制Huh7细胞的迁移和侵袭能力。

毛兰素对人肝癌Huh7细胞的抑制作用

研究了从鼓槌石斛中分离得到的低分子量天然化合物毛兰素在体外对人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用,并探讨其诱导细胞凋亡的分子机制.实验结果显示:毛兰素能显著抑制肝癌Huh7细胞的增殖,且随着药物浓度与时间增加其抑制率呈明显的剂量时间效应,其48 h半数抑制浓度IC50为37.4 nmol/L;毛兰素能诱导人肝癌Huh7细胞凋亡并使其细胞周期阻滞于G2-M期;分子机制研究显示毛兰素可抑制Akt激酶活性、下调Mcl-1蛋白表达以及激活PARP活性从而导致其对Huh7癌细胞的增殖抑制作用.以上结果初步表明毛兰素对肝癌防治具有潜在药用价值.

华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/Ras/Raf/ERK信号通路对肝癌Huh7细胞增殖与凋亡的影响

目的研究华蟾毒配基联合索拉非尼对肝癌Huh7细胞增殖与凋亡的影响及作用机制。方法 MTT法检测Huh7细胞增殖;Hoechst33342/PI荧光双染法检测Huh7细胞凋亡形态变化;流式细胞仪检测细胞周期;免疫细胞化学法检测Ki67蛋白表达;Western blotting法检测Bax、Bcl-2、Caspase-8、极光激酶A(AURKA)、Ras、Raf、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p-ERK蛋白的表达变化。结果华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药对Huh7细胞的增殖均有抑制作用,联合用药组的增殖抑制作用更明显,具有协同效应;荧光染色可见细胞凋亡形态变化;索拉非尼引起Huh7细胞周期S期阻滞,华蟾毒配基和联合用药引起Huh7细胞周期G2/M期阻滞,联合用药组G2/M期阻滞较单药组更明显;华蟾毒配基和索拉非尼均能减弱Ki67表达,联合用药组的作用更为显著;华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药上调Bax和Caspase-8蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax/Bcl-2比例,对ERK蛋白表达无明显影响,显著下调AURKA、Ras、Raf和p-ERK蛋白表达,联合用药组的作用更为显著(P<0.05)。结论华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/Ras/Raf/ERK信号通路抑制肝癌Huh7细胞增殖,诱导其凋亡。

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的小干扰RNA筛选和对肝癌细胞的作用

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）在肝细胞癌（HCC）发生发展中的作用机制。方法设计靶向GPC3的siRNA，转染Huh7细胞后实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测其对GPC3表达的抑制效果；选用抑制效果明显的小干扰RNA（siRNA）下调GPC3表达后，Westernblot法检测GPC3的蛋白表达水平，并用流式细胞仪、荧光显微镜观察及Transwell法分别对Huh7细胞的周期、增殖和侵袭进行检测。结果成功筛选出1条抑制效率达到74．87％的特异靶向GPC3的siRNA，可以显著抑制GPC3的转录翻译；同时，可见Huh7细胞的增殖和侵袭受到抑制，但并不影响细胞周期。结论GPC3的表达有利于HCC的增殖侵袭，其表达降低不利于HCC的发生发展。