草鱼MHCⅠα基因克隆及其多态性特征分析

主要组织相容性复合体(MHC)是存在于脊椎动物染色体上、呈高度多态性的基因群,与机体的抗病性密切关系。MHCⅠ类分子由α链和β_(2m)微球蛋白组成,α链呈高度多态性。为探究草鱼MHCⅠα基因的多态性特征,本研究对3个草鱼个体的MHCⅠα基因进行克隆和测序,并使用生物信息学方法分析比较草鱼与小鼠、牛和鸡的MHCⅠα基因多态性特征。结果:共获得了5条草鱼MHCⅠα基因型序列,其基因编码332个氨基酸,包括信号肽、α1、α2、α3和TM/CY区域。草鱼MHCⅠα基因的氨基酸变异位点主要分布在α1和α2区域,与小鼠、牛和鸡MHCⅠα基因肽结合区(PBR)空间结构相似,多态性位点分布在抗原递呈的关键部位α螺旋或β折叠上。草鱼MHCⅠα基因的进化受自然环境的负向选择作用,而其他3个物种的进化方式均为正向选择。此外,草鱼MHCⅠα基因与其他脊椎动物亲缘关系较远,单独构成进化树上一大分支,且个体间继续分化为不同的亚支。本研究从基因层面阐述了草鱼MHCⅠα基因多态性特征和分子进化规律,为进一步探究低等脊椎动物MHCⅠα基因的生物学特征奠定基础。

尼罗罗非鱼MHCⅠa全长cDNA的克隆、多态性及组织表达特征

通过同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,获得尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的MHC ？α全长cDNA,分析其多态性和组织表达特征。获得的尼罗罗非鱼MHC？αcDNA全长为1533 bp,其ORF为1053 bp。编码的蛋白质分子包含信号肽、MHC结构域、IGc1结构域和跨膜区,并存在丰富的磷酸化位点。与其他硬骨鱼类和哺乳类的相似性在26.86%~74.0%。从6尾鱼中共分离得到6条不同的MHC ？α cDNA序列,其序列中存在多个单核苷酸多态性位点,说明MHC？αcDNA存在丰富的多态性。qPCR检测表明, MHC？α基因在脾和心中表达量较高,中等程度表达于鳃、肠和肾中,在脑、肝、胃、皮肤和肌肉中表达量较低。对尼罗罗非鱼进行人工感染无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）后, MHC？α基因的mRNA表达水平在鳃、肾、心脏和脾4个组织中均发生了不同程度的变化。结果表明MHC Iα基因参与罗非鱼免疫反应,在免疫应答中发挥重要功能。本研究通过研究尼罗罗非鱼MHC？α的生物学活性、功能和表达调控,旨在为揭示尼罗罗非鱼免疫抗感染机制提供基础资料,并为利用MHC？α作为候选基因筛选尼罗罗非鱼抗病相关分子标记、辅助抗病品系的选育奠定基础。

圆斑星鲽MHCⅠα基因的克隆与组织表达分析

采用表达序列标签法和cDNA末端快速扩增（RACE）技术,成功获得了圆斑星鲽主要组织相容性复合体MHCⅠα的全长cDNA序列。该cDNA全长2171 bp,5′UTR为20 bp,3′UTR为1053bp,开放阅读框（ORF）长度为1098 bp,可编码365个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域（α1、α2）,IGC类似区（α3）,连接肽（跨膜区）和胞质区5个结构域。同源分析表明,圆斑星鲽MHCⅠα氨基酸序列与其他硬骨鱼具有31%~74%的同源性,与人的相似性较低。利用荧光定量PCR分析组织表达发现MHCⅠα基因在健康圆斑星鲽9种组织中均有表达,但表达量存在差异,肾的表达量最高,肌肉和皮的表达量最低。

鸡MHCⅠα和β2m链基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。

健脾解毒方延长脾虚肝癌大鼠带瘤生存与MHCⅠ/MHCⅡ的关系

目的:探讨健脾解毒方延长脾虚肝癌模型大鼠带瘤生存及与MHCⅠ/MHCⅡ的关系。方法:105只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、肝癌模型组、脾虚模型组、脾虚肝癌模型组、胸腺五肽组及健脾解毒方低、高剂量组,进行造模和干预。实验中记录动物的体质量、生存时间、肝癌大鼠濒死状态时恶液质积分并采集标本。免疫组化与Western blot方法检测大鼠肝组织及肝癌组织MHCⅠ/MHCⅡ分子表达。结果:健脾解毒方高剂量组和胸腺五肽组累积生存率高于其余各组(P<0.05),且其恶液质评分低于其余各组(P<0.05)。各造模组中,MHCⅠ分子在肝组织中的表达水平高于癌组织,肝组织和癌组织中均以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01)。MHCⅡ分子在癌组织表达强于肝组织,肝组织中以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01),癌组织中以脾虚肝癌组表达最强(P<0.01)。结论:健脾解毒方能对抗移植瘤导致的恶液质的发生和进展,显著延长荷瘤鼠的生存时间,其作用可能与上调MHCⅠ/MHCⅡ有关。

淮南麻黄鸡MHCⅠα链基因的克隆及序列分析

典型的主要组织相容性复合体（MHC）是抗原递呈的关键分子,具有重要的免疫功能,与多种疾病密切相关。为深入了解地方品种鸡MHCⅠ类α分子的特征,尤其是抗原结合区域的特点,通过RT-PCR技术获得了29个淮南麻黄鸡完整的α链基因,并进行了分析。结果显示,淮南麻黄鸡MHCⅠα分子高度多态,但主要集中在α1和α2区域,该区变异氨基酸位点共68个,其中高度变异22个。淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域氨基酸序列同源性介于79.3%-99.5%之间,仅少部分序列完全一致。鸡氨基酸序列同源性与鸭较高,介于57.6%-64.1%之间;其次为人和鼠。进化分析显示,淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域分属于两个类群,但未显示明显的品种差异。此外,鸡与鸭的亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。研究结果表明,淮南麻黄鸡MHC分子在进化过程中呈现高度的多态性,但受到病原体的选择压力,多态性主要位于抗原肽结合部分的α1和α2区域。

异基因MHCⅠ修饰对骨髓细胞的免疫学特性的影响

目的 :观察异基因MHCⅠ修饰对骨髓细胞的免疫学特性的影响 ,探讨MHCⅠ类分子在诱导免疫耐受中的作用机制。方法 :由逆转录病毒载体pMSCV介导 ,将BALB C小鼠的MHCⅠ类分子H 2Dd 基因导入C5 7BL 6小鼠的骨髓细胞 ,流式细胞仪检测转染后基因的表达。MTT法检测混合淋巴细胞反应 ,乳酸脱氢酶释放法测定BALB C小鼠NK细胞对H 2Dd 修饰后C5 7BL 6小鼠骨髓细胞的杀伤活性。结果 :重组逆转录病毒感染的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞对BALB C小鼠脾细胞的刺激强度或应答程度 ,与未转染和空载体病毒感染的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞相比都显著减弱。BALB C小鼠NK细胞对转染H 2Dd 基因后的C5 7BL 6小鼠骨髓细胞的杀伤显著降低。结论 :在骨髓移植中用受者MHCⅠ分子修饰供者骨髓细胞可能诱导免疫耐受。

应用dtSCT技术制备低亲和力抗原肽InsB_(15-23)肽的MHCⅠ四聚体

目的制备低亲和力InsB15-23抗原肽的MHCⅠ四聚体。方法应用二硫键捕获型单链三聚体(disulfide-trap singlechain trimer,dtSCT)技术,将InsB15-23抗原肽、小鼠β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)和H-2Kd分子以柔性接头(linker,L)依次连接,并在抗原肽的C末端与H-2Kd分子间引入了二硫键,以提高抗原肽与H-2Kd分子结合的稳定性。融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,经过诱导表达、洗涤包涵体、稀释复性等步骤获得单体,生物素化后制成InsB15-23dtSCT型四聚体。结果我们比较了自制InsB15-23dtSCT四聚体和商品化G9V传统五聚体对小鼠外周血特异性CTLs的检出率。2种多聚体对阴性对照Balb/c小鼠都显示出很低的非特异性标记水平,都能检出4周龄NOD母鼠外周血中低水平的InsB15-23特异性CTLs,且二者的检出率无统计学差异。结论我们成功制备出稳定的InsB15-23dtSCT型四聚体。与商品化的传统五聚体相比,我们自制的四聚体具有类似的检出率和低非特异性标记水平。

非经典MHCⅠ类分子HLA-G基因多态性与广西肝癌家族聚集性的相关性研究

目的:探讨非经典组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子人类白细胞抗原(HLA)-G基因多态性与广西肝癌家族聚集性的相关性。方法:采用病例对照研究设计,收集广西地区140例来自肝癌家族的家庭成员作为实验组,同期选择相同性别、年龄±5岁、相同民族、相同生活环境、相同生活习惯的140例无癌家族家庭成员作为对照组,通过聚合酶链反应(PCR)结合测序法检测HLA-G基因多态性。结果:实验组-14 bp/-14 bp基因型频率分布高于对照组,+14 bp/+14 bp、+14 bp/-14 bp低于对照组(P<0.05);实验组-14 bp等位基因分布高于对照组,+14 bp分布低于对照组。HLA-G+3142C/G位点、+3187A/G位点和HLA-G*0105N多态性分析显示,两组基因型和等位基因的分布比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性可能与肝癌家族聚集性有关。

中国恒河猴MHC Ⅰ型部分等位基因的分析

目的对中国恒河猴主要组织相容性复合体(MHC)I型部分基因进行携带情况调查与分析。方法采用序列特异性引物(PCR-SSP)分型方法对华南灵长类动物研究中心繁殖的30只谱系清晰的中国恒河猴(Macacamulatta)的32个MHC I型分子位点进行检测。结果采用的32对引物中,中国恒河猴可检出携带23个MHC I等位基因,但基因携带频率存在很大的差异,由3.57%至82.14%不等。结合遗传谱系分析,判断A1*21和A2*05之间以及B*04和B*30之间可能就是连锁的。结论中国恒河猴携带能控制病毒复制的MHC I型基因位点的频率较高,其基因携带频率与已发表的印度恒河猴携带频率存在明显差异。本研究为促进中国恒河猴在AIDS研究中的应用,以及为建立携带特定MHC I基因实验猴小种群提供了依据。

畜禽MHCⅠ分子抗原结合槽研究进展

主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex,MHCⅠ)结构的解析可直观地阐释其结合抗原表位的机理,进而有效利用其特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答。目前已报道的畜禽MHCⅠ精细结构包括牛(N*01301、N*01801)、猪(SLA-1*0401)和鸡(BF2*2101、BF2*0401、BF2*0201、BF2*1401),以上MHCⅠ复合体结构由α1、α2和α3共3个α链和β2m组成。其抗原结合槽多肽由A、B、C、D、E、F 6个口袋组成,一般B、F口袋决定了不同MHCⅠ分子结合不同性质的抗原多肽。鉴于同一物种不同的MHCⅠ等位基因及不同物种MHCⅠ基因的序列差异性,使得不同的MHCⅠ分子结合不同性质的抗原多肽片段,此外,不同MHCⅠ分子也可递呈同样的抗原多肽,实现不同MHCⅠ分子的交叉递呈。畜禽MHCⅠ的结构清晰地阐释其递呈抗原多肽的机理,促进了畜禽免疫学和疫苗应用的研究。

鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的克隆、序列分析及表达载体构建

【目的】克隆鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pET/DuMHC-Ⅰ。【方法】依据GenBank/DDBJ/EMBL基因库中公布的鸭MHC-Ⅰ基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中扩增MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA,T-A克隆到pGEM-T Easy载体中,并进行测序。通过PCR和酶切的方法,将鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ,并进行PCR、NcoⅠ和NotⅠ双酶切及测序鉴定。【结果】测序结果表明,获得了MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,其长度为813 bp,编码271个氨基酸。MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因与GenBank中登录的鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因序列的同源性为89.4%~91.7%,氨基酸同源性为78.2%~83.7%;与鸡、鹅、鹌鹑、草鱼、狗、猪、鼠和人的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽氨基酸序列的同源性分别为64.6%,79.3%,59.4%,41.0%,26.6%,45.0%,12.5%和22.1%,这表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种属多样性,且...

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病毒载体

目的：为使外源性 Ｔ Ｎ Ｆ， Ｉ Ｆ Ｎ 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类（ Ｍ Ｈ ＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应，构建在 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子调控、 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ连接下协同表达 Ｔ Ｎ Ｆα和 Ｉ Ｆ Ｎβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果：从ｐ Ｇ Ｌ３ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｆ及ｐ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ中切下 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ和 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段，先后插入ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ （＋ ）， 构建成ｐ Ｂ Ｌ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ。回收 Ｔ Ｎ Ｆα Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段，连入 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｌｉｎｋ１ 中，构建成 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（＋ ）。回收 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段，连入缺失 Ｅ１ 和 Ｅ３ 区及启动子的 Ａｄ ＢｇｌⅡ中， 构建成 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（－ ）。结论：此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。

缺血再灌注前后MHCⅠ,Ⅱ类抗原表达的实验研究

目的 :建立大鼠缺血再灌注 (I/R)和预处理 (IP)模型 ,了解I/R和IP前后MHCⅠ ,Ⅱ类抗原的表达。方法 :用逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)方法对I/R术后 0 ,1,3,5 ,7,14 ,2 1,35d大鼠肝组织和IP术后MHC抗原进行检测并与未缺血组比较。结果 :I/R可导致MHCI和MHCⅡ类抗原表达增高 ,IP可以在一定程度上减轻MHCⅠ和MHCⅡ类抗原过度表达。结论 :该实验表明缺血再灌注后MHCⅠ ,Ⅱ类抗原的表达有助于对排斥反应的监测 ,并有助于缺血再灌注损伤程度的判断。

syk真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响

目的:构建非受体蛋白酪氨酸激酶Syk的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞,使其在细胞中稳定表达,以研究Syk对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响。方法:以RT-PCR法从人乳腺癌细胞株MDA-MB-468扩增出syk编码序列基因片段,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中。对重组质粒进行酶切、PCR及测序鉴定后,以脂质体介导法转染Syk缺失的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,经G418筛选,构建syk基因稳定表达的细胞株,通过Western blot、RT-PCR和流式细胞术检测转染乳腺癌细胞Syk、MHC-Ⅰ及ICAM-Ⅰ的表达。结果:构建了hsyk真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/hsyk,并在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中获得稳定表达。表达Syk的MDA-MB-231细胞同时可以高表达MHC-Ⅰ和ICAM-Ⅰ。结论:成功地构建了syk真核表达载体并在真核细胞中表达,为进一步的肿瘤免疫研究奠定了实验基础。

鸡MHCⅠ分子二聚体融合基因的构建及表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(major histocompatibility complex,MHCⅠ)的作用机制,提高其抗原呈递的效率,获得生物活性较好的鸡MHCⅠ分子二聚体,采用4个不同长度的连接肽G_4S、(G_4S)_2、(G_4S)_3和(G_4S)_4,通过基因重组技术将MHCⅠα和β2m链基因共价连接,随后插入带有绿色荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了4个重组质粒pEGFP-MHCⅠβ_2m-α。真核细胞表达后,荧光显微镜观察可见,各重组MHCⅠ二聚体分子均主要分布于真核细胞的内膜系统。此外,Western Blot检测均可见蛋白大小约80.0 k D左右的特异反应带,表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应。研究结果表明各连接肽的重组质粒p EGFP-MHCⅠβ_2m-α均能够在真核细胞中顺利表达,且融合蛋白具有良好的免疫学活性。

重组MHCⅠ类分子K^b-EGFP分子的构建及表达

目的 构建绿色荧光蛋白标记的MHCⅠ类分子Kb(Kb EGFP融合蛋白 ) ,并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法 RT PCR的方法获得小鼠MHCⅠ类分子KbcDNA ,克隆入真核表达载体pEGFP N1中EGFP分子的上游 ,脂质体转染COS 7细胞 ,G4 18加压筛选获得抗性重组细胞。荧光显微镜下观测重组分子的表达及胞内定位情况。结果 分子克隆的方法获得了预期的重组质粒 ,质粒经DNA序列测定证实阅读框无误 ,转染COS 7细胞后的抗性克隆胞浆内可以观察到明亮的绿色荧光 ,特征性地分布于细胞质膜 ,及核周、膜下的囊泡结构中。结论 所构建的Kb EGFP融合蛋白在细胞内表达后具有MHCⅠ类分子的特征性分布 ,提示该重组分子具有野生型MHCⅠ类分子的生物学特性和胞内分布特征 。

中国西南地区猕猴MHCⅠ类部分等位基因调查

采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)分型方法对中国西南地区猕猴的MHCⅠ类A*01、A*02、A*08、B*01和NA7等共5个等位基因进行检测。结果显示,在云南猕猴群体中测出了A*01、A*02、A*08、B*01和NA7等位基因,检出率分别为1.27%(2/157)、69.43%(109/157)、11.46%(18/157)、21.02%(33/157)、31.21%(49/157);四川猕猴群检测出了A*02、B*01和NA7等位基因,检出率分别为46.67%(7/15)、13.33%(2/15)、46.67%(7/15);贵州猕猴群检出了A*01、A*02、A*08、B*01和NA7等位基因,其检出率分别为2.5%(2/80)、65%(52/80)、1.25%(1/80)、25%(20/80)、72.5%(58/80);广西猕猴检测出了A*02、B*01和NA7等位基因,检出率分别为60%(6/10)、10%(1/10)、50%(5/10)。中国西南地区猕猴群携带的MHCⅠ类等位基因的频率存在显著性差异(P<0.05)。本研究初步分析了MHCⅠ类等位基因分布情况,为今后开展相关研究奠定了基础。