绵羊线粒体DNA控制区5’端序列PCR-SSCP与序列分析

通过绵羊线粒体ＤＮＡ控制区左功能域（５’端序列）ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和序列分析，发现小尾寒 羊、乌珠穆沁羊、湖羊、萨福克羊和夏洛来羊以及多赛特公羊与小尾寒羊杂交家系共２０２只绵羊 可归纳为两种类型：突变型和野生型，提示现代绵羊品种在起源上存在两种主要的进化途径。

FSHβ基因PCR-SSCP多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系的研究

采用PCR-SSCP技术检测促卵泡素β亚基(follicle-stimulatinghormoneβ,FSHβ)基因5′调控区、外显子1和外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)和低繁殖力山羊品种(辽宁绒山羊、波尔山羊、安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明:山羊与绵羊的FSH基因该段核苷酸序列同源性为98%。9对引物中,只有P9的扩增片段存在多态性。P9的扩增片段在济宁青山羊和辽宁绒山羊中检测到AA、AB和AC3种基因型;在波尔山羊中检测到AA、CC和AC3种基因型;在安哥拉山羊中检测到AA、BB、CC、AB、AC和BC共6种基因型。测序分析发现BB型与AA型相比在外显子2的第94bp处有G→A突变,并引起氨基酸改变(丙氨酸→苏氨酸);CC型与AA型相比在外显子2的第174bp有一处C→T沉默突变。济宁青山羊AA、AB和AC基因型频率分别为0.686、0.137和0.177。AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.78只(P<0.05),比AC基因型的多0.64只(P<0.05)。

山羊生长分化因子9基因外显子2的PCR-SSCP分析

目的寻找与产羔数相关的遗传标记,为山羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。方法以控制Belclare绵羊和Cambridge绵羊高繁殖力的生长分化因子9(growthdifferentiationfactor9,GDF9)基因为候选基因,根据绵羊GDF9基因序列设计4对引物,采用PCR-SSCP技术检测GDF9基因外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)以及低繁殖力山羊品种(波尔山羊、文登奶山羊、辽宁绒山羊、北京本地山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果山羊与绵羊的GDF9基因外显子2核苷酸序列同源性为99%(955/965)。引物1和引物4存在多态性。对于引物1扩增片段,5个山羊品种均检测到AA、AB和BB3种基因型,测序分析发现外显子2第26bp处有1个G→A的单碱基突变,但没有引起氨基酸改变;济宁青山羊A等位基因频率为0.9128,B等位基因频率为0.0872;AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.54只(P<0.01),比BB基因型的多0.63只(P<0.01)。对于引物4扩增片段,5个山羊品种均检测到CC、CD和DD3种基因型,测序分析发现外显子2第792bp处有1个G→A的单碱基突变并且导致缬氨酸改变为异亮氨酸;济宁青山羊C等位基因频率为0.9266,D等位基因频率为0.0734;CC基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比CD基因型的多0.57只(P<0.01),比DD基因型的多0.62只(P<0.01)。结论初步表明GDF9基因可能是控制济宁青山羊多胎性能的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。

猪雌激素受体基因(ESR)点突变的PCR-SSCP检测

雌激素受体基因(ESR)是控制猪高产仔数的主效基因之一,具有明显的基因效应:BB型比AA型母猪胎总产仔数和产活仔数分别高出1 40～3 37和0 63～3 58头,是目前商品猪育种和生产中重点检测的主要基因之一。常规采用PCR -RFLPs方法区分该基因由点突变造成的3种不同的基因型。本研究建立1种基于PCR的SSCP(single-strand edconformationpolymorphism)方法对猪ESR该位置的点突变进行检测,具有操作简便、灵敏度高和不需要酶切等优点 。

松材线虫rDNA的测序和 PCR-SSCP分析

本文为克服形态鉴定的不足 ,用分子生物学的方法鉴别松材线虫。线虫核糖体 DNA(r DNA)的内部转录间隔区 (ITS1)区 (约 30 8bp)的测序结果显示 :松材线虫种内区别很小 ,不超过 1bp;拟松材线虫种内区别较大 ,最大达 7bp;这 2种线虫的种间区别为 32～ 39bp。根据以上测序结果 ,本文结合单条线虫 DNA的提取技术 ,对 14个松材线虫和拟松材线虫样本进行了单链构象多态性 (PCR-SSCP)分析 ,结果表明 PCR- SSCP分析技术可明确区分这 2种线虫 ,该技术可为单条松材线虫的鉴定提供一套灵敏而可靠的方法。

瘢痕疙瘩Fas基因突变的银染PCR-SSCP检测

以前的研究提示：瘢痕疙瘩成纤维细胞的Ｆａｓ 受体可能处于无功能状态。进一步探讨导致无功能Ｆａｓ分子的可能机制。取瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者的组织及外周血标本，ＰＣＲ特异性扩增Ｆａｓ 分子外显子９ 的编码区，扩增产物经银染ＳＳＣＰ筛选，最后可疑阳性的ＰＣＲ样本进行ＤＮＡ 测序。经ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测，２０％ （２／１０）的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带，经ＤＮＡ 测序证实，这２ 例突变均为位于Ｆａｓ ｃＤＮＡ的７５５ｂｐ 处的“Ａ”缺失而导致的移码突变。结果提示：编码Ｆａｓ分子死亡域结构基因的移码突变可能导致Ｆａｓ受体功能丧失，从而导致成纤维细胞的凋亡异常；该研究从基因水平阐述了瘢痕疙瘩发生的分子机制。

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。

中国人CTLA-4基因的PCR-SSCP和DNA序列分析

ＣＴＬＡ４是主要表达于成熟Ｔ细胞表面的蛋白分子，与Ｔ细胞参与的免疫应答负调控有关，目前有关ＣＴＬＡ４的分子生物学资料多为外国提供，为了掌握中国人ＣＴＬＡ４基因的第一手资料，我们对５０例中国人（其中２５例为正常人，２５例为类风湿性关节炎患者）的ＣＴＬＡ４基因Ｖ区进行了ＰＣＲ扩增，并对其中４例正常人进行了ＤＮＡ序列分析，结果显示中国人ＣＴＬＡ４Ｖ区的ＤＮＡ序列与国外报道有两个位点存在差异，其中第５４位密码子处中国人为ＡＴＧ（甲硫氨酸），第１１０位密码子处为ＡＣＣ（苏氨酸），进一步对正常人和类风湿性关节炎病人进行ＰＣＲＳＳＣＰ分析，结果显示在所分析的人群中不存在多态性，表明ＣＴＬＡ４分子具有高度保守性。

二花脸猪FSH β亚基位点PCR-SSCP标记与产仔数关系初探

采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ－ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）作为遗传标记，对二花脸猪ＦＳＨβ亚基位点与产仔数性状的关系进行了研究。二花脸猪在被扩增位点有较大的变异，而在作为对照品种的大约克猪中则完全纯合。两品种在该位点基因频率差异显著。以标记基因型为因子，分别对二花脸猪群体的头胎产仔数、头三胎产仔数之和以及最高产仔数进行方差分析。结果表明，该标记位点与产仔数性状显著相关，其贡献率达到１０％以上。本文还就产仔数指标的选择作了讨论。

绵羊GDF9基因PCR-SSCP分析

生长分化因子 9(GDF9)是由卵母细胞分泌的一种生长因子 ,它对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用PCR SSCP技术分析了GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊和萨福克羊 4个绵羊品种的多态性。结果表明 :GDF9基因在两对引物扩增片段中均存在PCR SSCP多态性。对于引物 1扩增片段 ,4个绵羊品种均检测到AA基因型 ,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中 ,仅在萨福克羊中检测到BB基因型 ;在 4个绵羊品种中 ,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。对于引物 2扩增片段 ,4个绵羊品种均检测到AA基因型 ,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中 ,4个绵羊品种均没有检测到BB基因型 ;在 4个绵羊品种中 ,AA基因型频率最高 ,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。引物 1的多态性片段测序分析表明 :位于GDF9基因cDNA第15 2处发生了单碱基的改变 (A→G) ,并导致了氨基酸的改变 (天冬酰胺→天冬氨酸 )。

采用UPPCR-SSCP技术快速鉴定水产养殖病原性弧菌的研究

采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPPCR SSCP技术 ,对弧菌科弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、费尼斯弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌的 1 6S RNA基因进行检测。结果发现 ,UPPCR SSCP技术能较好地鉴别细菌的不同种 ,但对同种不同株细菌的区分较困难。认为PCR SSCP是将病原菌判定至种的有力工具。此研究对水产养殖病原菌的快速诊断与及时防治有重要意义。

PCR-SSCP与测序技术相结合检测小麦耐盐突变体

根据位于小麦第四同源群上与耐盐有关的ｇｆ－２．８基因的编码区序列设计１对引物，分别以两个耐盐突变体及其亲本的总ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，在５个供试材料中均扩增出１条约６８５ｂｐ的目的条带。ＳＳＣＰ电泳显示突变体９７４９１５与其他供试材料之间存在差异。测序表明冀麦２４和其耐盐突变体８９０１－１７的扩增产物序列与ｇｆ－２．８基因的发表序列相同，这表明突变体８９０１－１７的突变位点不在该基因上；而另一耐盐突变体９７４９１５的序列中则至少存在２个单碱基突变，有一处突变导致了氨基酸的变化，该突变位点位于ｇｆ－２．８基因的保守区域内。

PCR-SSCP技术用于脱臭微生物群落结构的研究

采用PCR-SSCP（单链构象多态性）技术对脱臭生物滤池中填料生物膜微生物群落结构进行了研究.生物滤池对臭气中的污染物随驯化时间逐渐增强,去除率从50%升高到89%.对2种填料树皮和秸秆上生物膜的分析结果表明,滤池内微生物多样性随运行时间先降后升,从1.6-1.9上升到2以上;而2种填料上微生物的相似性逐渐增加,表明随着驯化进程,生物填料上的微生物能够利用臭气污染物进行生长,并随运行时间逐渐趋于丰富和稳定;树皮比秸秆具有较高的生物多样性,平均值分别为2.2和2.0,说明树皮上容易附着多种微生物生长,电镜照片也显示2种填料生物膜的增长和生物多样性的提高.SSCP条带测序结果表明生物滤池生物膜优势微生物种属为芽孢杆菌属,占33.3%;条带中不可培养细菌占44.4%;填料生物膜上的细菌绝大多数是广泛存在于土壤、水体及生物体中的微生物,它们对环境适应能力强,在臭气的污染物去除中扮演重要角色.

牦牛GH基因多态性的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术对天祝白牦牛和青海高原牦牛的生长激素基因(GH基因)5个外显子及部分内含子序列进行遗传变异分析,以探讨牦牛GH基因的遗传特性.结果表明:2个牦牛群体GH基因第1、第2和第4外显子无多态性,第3内含子1694bp处均发生T→C转换,形成A、B2个等位基因,并检测到AA、AB和BB共3种基因型;天祝白牦牛第5外显子2373bp处发生G→T碱基颠换,形成C、D2个等位基因,检测到CC和CD2种基因型,但碱基改变并未引起氨基酸变化,因此这种碱基转换为沉默突变;天祝白牦牛和青海高原牦牛均为低度多态,经Hardy-Weinberg平衡检验2个牦牛群体均处于非平衡状态.

山羊生长激素基因部分序列的PCR-SSCP分析

以鲁北白山羊、波尔山羊和波尔山羊与鲁北白山羊的杂交一代、回交一代共计 2 74个个体为研究材料 ,对山羊生长激素基因 5′调控区 - 4 0 6～ - 1 93片段进行PCR扩增 ,扩增产物经SSCP分析发现存在多态性。结果表明发现波尔山羊及杂交后代以AA型占多数 ,而鲁北白山羊则BB型个体较多 ,基因型频率在品种间存在显著差异 (P <0 .0 5 )。对该片段的两种纯合型克隆测序发现 :AA型在第 6 0位发生了C→T的突变 ,第 2 1

我国不同流行区内脏利什曼原虫分离株kDNA的PCR-SSCP分析

目的： 分析我国不同类型流行区内脏利什曼原虫 （Ｌ．ｄ．） 分离株ｋＤＮＡ。方法： 应用利什曼原虫属特异引物１３Ａ， １３Ｂ及据杜氏利什曼原虫四川人分离株ｋＤＮＡ 微环特异片段序列设计合成的引物Ⅰ、引物Ⅱ， ＰＣＲ扩增不同流行区利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ， 获特定片段， 进行ＳＳＣＰ分析。结果： 用引物Ⅰ和引物ⅡＰＣＲ扩增内脏利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ， 在同样试验条件下， 山丘地区和荒漠地区Ｌ．ｄ． 分离株扩增出２９７ ｂｐ 特定片段， 而平原地区Ｌ．ｄ．分离株及新疆皮肤利什曼原虫未扩增出２９７ ｂｐ 特定片段。将上述各虫株的２９７ ｂｐ 特定片段进行ＳＳＣＰ分析， 可见两个山丘地区的Ｌ．ｄ．分离株ｓｓＤＮＡ 迁移率相同， 而与荒漠地区新疆７７１分离株则相差较大。用引物１３Ａ， １３ＢＰＣＲ 扩增平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株、山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株、Ｌ．ｄ．甘肃分离株，均扩增出１２０ ｂｐ 特定片段。经ＳＳＣＰ分析，平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株的ｓｓＤＮＡ迁移率完全相同； 山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株和Ｌ．ｄ． 甘肃分离株ｓｓＤＮＡ迁移率相同， 但与平原地区者明显不同；

家兔MITF基因部分外显子多态性的PCR-SSCP分析

小眼畸形相关转录因子MITF是色素细胞的发育成熟中的重要因子,可调控酪氨酸基因家族的表达,参与黑素生成的调控,从而影响动物的毛色。本实验采用PCR-SSCP技术,检测白色獭兔、海狸色獭兔和闽西南黑兔群体中家兔MITF基因的5个外显子和部分内含子区域的多态性,结果发现,引物1、2、5、7的扩增片段均未表现出多态,在获得的大小为255 bp的引物4扩增片段中发现一个SNP(C43T)位点,在各群体中表现为3种等位基因型AA、BB、AB。测序结果表明第4外显子扩增片段的突变位于5′端的内含子区域,不影响氨基酸序列。统计结果显示,白色獭兔群体不处在哈代温伯格平衡状态(P<0.05),其余群体则均处于平衡状态。闽西南黑兔群体表现出中度多态(0.5>PIC>0.25),其余群体为低度多态。

弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与PCR-SSCP分析

利用营养琼脂、MaC培养基从草鱼肠道中分离到3株细菌,暂时编号为TC-1、TC-2和TC-3,通过形态学观察、生理生化特征、药敏试验、动物试验、构建系统发育进化树及PCR-SSCP分析等系统鉴定,结果表明3株菌株均为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),其中TC-2菌株对小鼠、斑马鱼有致病性;3株杆菌均对头孢噻肟、头孢曲松、洛美沙星、诺氟沙星等多种药物敏感;系统发育分析表明,3株弗氏柠檬酸杆菌16S rDNA序列与DSM30039模式株同源性分别为99.59%、99.47%和99.53%,且位于系统发育树的同一分支;进一步采用V3区PCR-SSCP分析结果显示弗氏柠檬酸杆菌SSCP图谱中菌株间带型存在差异。

应用RT/PCR-SSCP法分析传染性法氏囊病病毒的变异性

根据传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) c DNA序列 ,在病毒 VP2区域设计 1对引物 ,应用 RT/PCR-SSCP方法对 4个不同时间及不同地域从传染性法氏囊病 ( IBD)病鸡法氏囊组织中分离的 IBDV分离物进行了分析 ,发现 4个 IBDV分离物的 SSCP图谱均存在明显差异。本试验表明 ,IBDV变异在我国普遍存在 ,SSCP方法可用于 IBDV的变异性分析。

PCR-SSCP分析条件的优化

聚合酶链式反应及单链构象多态性 (PCR-SSCP)技术作为一种区分检测基因组之间微小差异的有效方法 ,具有快速、简便、灵敏和适用于大样品量筛选的特点 .本研究从变性剂类型、电泳缓冲液的离子强度、交联度、电泳温度、甘油浓度及变性剂类型等方面对影响 PCR-SSCP的电泳条件进行分析 。