An Effective Method for Depleting MatureT Lymphocytes from Bone Marrow Cells──Two－step Percoll Centrifugation

In the present paper we have observed the effect of discontinuous gradient two-step Percoll centrifugation on depleting mature T lymphocytes from normal bone marrow. The pre-/post-Percoll percentage of CD34+, and Leu4+ cells in MNC was counted by using APAAP technique. As the two-step Percoll centrifugation is simple,and time saving, and decreases the incidence of contamination of cultured cells as well,This technique may be of value in serum-free culture of hematopoietic cells and immunological studies.

不同条件下Percoll密度梯度离心分离组织细胞浮游生物的比较

目的实验评估不同条件下Percoll密度梯度离心分离组织中浮游生物的效果。方法大白兔肝组织匀浆后与3种藻类混合物混匀,分为混匀高速分离组、混匀低速分离组、叠加高速分离组、叠加低速分离组和未分离组(对照组)进行Percoll密度梯度离心分离浮游生物,镜检并提取其DNA,用PCR技术分别检测浮游生物16S rDNA和叶绿素基因特异性片段。结果混匀高速分离组有较多浮游生物呈分层条纹状分布于离心管中部,叠加高速分离组浮游生物紧邻组织细胞层下,低速分离组见较少浮游生物紧邻于组织细胞层之下,未分离组见浮游生物和组织细胞混杂沉于管底;经DNA检测,各分离组组织细胞层下液体均可检出浮游生物的1条447bp 16S rDNA片段及1条194bp叶绿体/叶绿素脱辅基蛋白基因片段,未分离组均未检出扩增产物且背景较深。结论混匀加样方式进行高速Percoll密度梯度离心,合并收集组织细胞层下所有液体,是分离浮游生物的最有效方法。

Percoll梯度离心前后精子功能指标分析

目的 :通过分析Percoll梯度离心法处理前后精子相关功能指标 ,评价该法在精子体外处理中的作用。 方法 :采用多次曝光摄影技术、瑞 姬氏染色法、低渗肿胀实验 ,观察处理前后精子运动速度、顶体完整率和低渗肿胀率的变化。 结果 :2 5例不育病人精液标本经Percoll梯度离心法处理前后 ,精子运动速度 (2 0 .5 6± 8.13μm/s和 2 5 .18± 8.30 μm/s ,P <0 .0 5 )、顶体完整率 (6 1.2 0 %± 2 1.11%和 70 .36 %± 17.70 % ,P <0 .0 1)和低渗肿胀率 (6 8.2 8%±17.33%和 76 .76 %± 17.10 % ,P <0 .0 5 )均有显著差异。 结论 :精液标本经Percoll梯度离心法处理后 ,各项精子功能指标均较处理前有明显改善 ,该法可广泛应用于辅助生殖医学中。

Ficoll和Percoll法分离结直肠癌相关巨噬细胞的比较

目的：比较Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离结直肠癌中的巨噬细胞的效果，并进一步探讨贴壁分离巨噬细胞的最适宜贴壁时间。方法：取结直肠癌患者的肿瘤组织，制成单个细胞的悬液，分别使用100％ Ficoll、35％ Percoll 以及25％与65％双梯度 Percoll 进行巨噬细胞分离，37℃培养2 h后，去除未贴壁的细胞，使用免疫荧光实验来检测巨噬细胞的纯度。之后，将Ficoll分离得到的单个核细胞，分别培养1、2、4和9 h后比较巨噬细胞的纯度。结果：Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离的巨噬细胞的纯度为60．18％，Percoll 非连续密度梯度离心法分离的巨噬细胞的纯度分别为54．33％和10．93％，均低于Ficoll法分离所得到的巨噬细胞的纯度（P ＜0．05）。 Ficoll分离后贴壁1、2、4 h 分离得到的巨噬细胞纯度均达到60％以上，高于贴壁培养9 h得到的巨噬细胞的纯度（34．67％）。结论： Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离巨噬细胞，纯化程度好，是一种简单、高效的巨噬细胞分离方法，适于临床和科研中广泛应用。贴壁培养2～4h是贴壁分离巨噬细胞最适宜的时间。

Percoll梯度离心与精子运动轨迹图像分析

目的：研究Percoll梯度离心后精子运动轨迹的变化。方法：Percoll梯度离心法处理精子运动状况较差的精液标本，分析精子运动轨迹的变化。结果：在24例精液标本中，Percoll处理前后的精子平均运动速度分别为18.4±4.6μm／s和25.7±5.4μm／s.二者之间具有显著差异（P＜0.01）。结论：用Percoll梯度离心法处理精子，可提高精子运动速度，改善精子质量。

酵母同步细胞的Percoll连续密度梯度改良方法分离及其单细胞拉曼光谱鉴别

利用改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,分离不同酵母菌株稳定期的同步细胞,并在单细胞水平上,应用激光光镊拉曼光谱对分离的同步细胞进行鉴别。采用高速离心机角式转头和2mL聚丙烯离心管,20℃,19 320g离心15min,将大约1.75mL Percoll溶液形成1.00～1.31g·mL^-1连续密度梯度;将样品均匀铺加在离心管连续密度梯度液顶层,20℃,400g离心60min,酵母分成明显的2层细胞带;微分干涉差显微镜（DIC）、相差显微镜以及同步生长曲线分析显示,下层酵母细胞以单个细胞为主,大小均匀、致密,折光性强,生长呈现阶梯式增长,具有同步细胞生长的特性,确定其为同步的G0细胞。利用单细胞光镊拉曼光谱系统对所分离的G0同步细胞与非G0细胞进行分析,结果显示G0同步细胞和非G0细胞的特征峰位置基本一致,但G0细胞对应的蛋白质、糖类、核酸等生物大分子特征峰强度大于非G0细胞,说明G0细胞大分子物质含量要比非G0细胞的高;对G0细胞和非G0细胞进行主成分分析,结果显示,分离的同步化G0细胞之间成分含量差异少,比较均一,而非同步细胞之间内含物质差异大,呈不均一性,说明单细胞光镊拉曼光谱系统可以鉴别同步和非同步细胞。改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,能够分离多数酵母菌株同步化细胞,是一种易操作、成本低、效率高的细胞分离方法。

Percoll梯度离心前后精子功能参数的分析

作者通过Percoll梯度离心技术观察处理前后精子相关功能的指标 ,以评价该技术在精子体外处理中的效果 .方法 采用精子前向运动试验 (PMS)、精子尾部低渗肿胀试验 (HOS)和DNA荧光染色有效精子计数试验 (ESC) ,观察精子处理前后PMS ,HOS和ESC的变化 .结果 32例不育病人精液标本经Percoll梯度离心法处理后 ,精子的PMS ,HOS及ESC等指标均明显高于处理前(P <0 .0 1) .该结果表明 ,体外精液标本经Percoll梯度离心法处理后 ,各项精子功能指标均较处理前有明显提高 .

Percoll密度梯度离心法分离大鼠肺Ⅱ型上皮细胞

目的建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)的改良体外原代培养法。方法采用循环冲洗、支气管灌洗、胰蛋白酶消化、滤网过滤并用轻比重及重比重Percoll密度梯度离心,分离AT-Ⅱ。原代培养后通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)法和电镜鉴定AT-Ⅱ。结果经AKP染色和电镜鉴定所得的AT-Ⅱ纯度为(80.2±6.3)%,每只大鼠可分离出1×107AT-Ⅱ。结论采用Percoll密度梯度离心法能分离出较高纯度的AT-Ⅱ。

Percoll密度梯度离心法分离中枢神经系统组织中的单个核细胞

目的建立快速分离小鼠中枢神经系统(CNS)组织中单个核细胞的方法。方法以正常C57BL/6小鼠、实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)和阿尔茨海默病(AD)模型小鼠为研究对象,通过70%~30%Percoll密度梯度离心法,获取小鼠脑组织和脊髓中单个核细胞,利用台盼蓝染色检测细胞存活率后,通过流式细胞术进一步分析细胞的表型特点。结果分离得到的单个核细胞存活率在90%以上;流式细胞术分析结果表明,EAE和AD小鼠中浸润到CNS的淋巴细胞群比例明显升高,且介导炎症反应的Th1和Th17细胞亚群比例明显升高,而具有免疫调节作用的Treg细胞亚群比例明显下降。结论采用70%~30%Percoll密度梯度离心法从小鼠CNS中分离的单个核细胞存活率高,细胞活性不受分离过程的影响,可进一步利用流式细胞术分析细胞的表型特征。此方法操作简单快速,适用于对CNS淋巴细胞等单个核细胞的分析。

Effect of Swim-Up and Percoll Treatment on Sperm Quality and In vitro Embryo Development in Yak

This study was designed to determine the effect of different sperm preparation treatments on yak sperm quality and in vitro embryo development.Frozen-thawed semen samples were treated using swim-up or percoll gradient centrifugation methods.Sperm concentration,progressive motility,recovery of motile sperm,membrane integrity,acrosome and chromatin integrity were scored and compared in recovered samples and controls.In addition,the effects of two sperm separation treatments on embryos capable of cleavage and in vitro development to the blastocyst stage were evaluated.Swim-up separated sperm showed a higher motility,while the concentration of spermatozoa recovered and percent recovery of motile sperm were higher with percoll gradient centrifugation separation.According to the optical and electron microscopies,swim-up produced higher percentage of sperm with intact plasma membrane and acrosome than percoll gradient centrifugation separation.However,there was no difference in the percentage of sperm with intact chromatin between two treatment groups.Cell numbers in the blastocysts of two groups were not different.The blastocyst rate was similar in both groups,whereas cleavage rate was higher when swim-up was used.

Percoll离心结合免疫磁珠分选的方法从外周血分离单核细胞

目的探讨采用Percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选从人外周血富集白细胞层中分离提纯单核细胞的方法。方法采用Ficoll密度梯度离心分离淋巴细胞得到外周血单个核细胞,Percoll密度梯度离心从外周血单个核细胞中富集单核细胞,免疫磁珠阴性分选纯化单核细胞。流式细胞术检测细胞CD14和CD16的表达,分析单核细胞分离纯度。M-CSF诱导单核细胞分化为巨噬细胞。IFN-γ诱导巨噬细胞促炎性分化后,流式细胞术分析共刺激分子及HLA-DR的表达,RT-qPCR检测其细胞因子表达。结果Percoll分离结合免疫磁珠阴性分选分离出纯度为93.1%±1.5%的单核细胞。分离出的单核细胞呈煎蛋形,能成功分化为体积大、黏附力强、且呈纺锤状的巨噬细胞。与对照组相比,巨噬细胞在IFN-γ刺激下促炎性分化后,共刺激分子及HLA-DR表达显著上调,TNF-α、IL-6、CXCL10和CXCL11 mRNA表达也均显著上调。结论Percoll密度梯度离心结合免疫磁珠阴性分选能分离出高纯度且具有功能活性的单核细胞。

Percoll、白蛋白处理前后精子低渗肿胀百分率的比较

本文报告了用低渗肿胀试验观察经Percoll梯度离心和白蛋白柱处理前后的精子低渗肿胀率，结果显示：Percoll、白蛋白柱处理前精子低渗肿胀率为73．8±8．0％。处理后的精子低渗肿胀率分别为84.6±72％、87．7±8.1％．与处理前比较差异均非常显著。提示精液经体外处理后再行人工授精是治疗不育症的一种手段。

Percoll等密度梯度离心法分离利什曼原虫细胞核

分离纯化锥虫类原生动物细胞核存在着许多困难,阻碍了人们对这类单细胞生物的细胞核在各方面作进一步研究。本文提出一个从破碎细胞开始的分离核的完整程序。采用起始密度为1.083的Percoll工作液作等密度梯度离心,获得了纯度较高的利什曼原虫(Leishmania gerbilli)细胞核。经测定,L.gerbilli细胞核在Percoll中的浮力密度为1.048—1.051。

血细胞的Percoll不连续密度梯度分离法

以Percoll作为分离介质,采用60%SIP、50%SIP2种浓度,经2次离心,成功地分离了12名健康供血者周周血的单核、淋巴和粒细胞,纯度分别为83%、85%和98%;得率分别为48%、49%和47%。常规涂片、瑞氏染色后形态学观察示细胞形态完整,台盼蓝拒染实验示细胞活力良好(拒染率>95%).

用percoll密度梯度离心法快速分离提纯大鼠再生肝细胞

报导一种分离和纯化大鼠再生肝细胞的新方法——percoll密度梯度离心法。本方法快速稳定,而且便于提纯和体外培养,细胞成活力高。

大鼠骨髓单个核细胞诱导扩增为内皮祖细胞的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件

目的筛选大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)诱导扩增为内皮祖细胞(BM-EPCs)的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件,构建一个高效、高产量、高纯度的骨髓来源BM-EPCs分离培养诱导扩增方法。方法取2周龄雄性SD大鼠,脱颈处死后分离大鼠双侧胫骨和股骨,收集骨髓细胞悬液。配制30%、50%、60%和70%浓度的Percoll细胞分离液,通过Percoll密度梯度离心法分离出大鼠BMMNCs种子细胞,并计算活细胞比例。将获得的BMMNCs分为1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)、2.5×10^(6)、5×10^(6)、1×10^(7)六个组别,分别接种于25 cm^(2)无菌培养瓶中,培养7 d后镜下观察各组细胞集落形成数目,并计算每10^(6)细胞的集落形成数。运用Graphpad prism9.5软件进行Logistic拟合曲线,根据相关系数R^(2)确定相关性,根据其P值将有统计学差异的接种数目纳入范围,随后使用R语言编程定义计算函数,根据已知种子细胞总数及相关性函数限制下,通过迭代寻找最佳的BMMNCs细胞接种数目。分别配制20、50、100 nmol/L浓度的人纤连蛋白(FN)溶液,以不添加FN的空白溶液为对照,分别包被空白培养瓶2、6、12、24 h,将收集的48 h未贴壁BMMNCs接种于FN包被的各培养瓶中,静置培养3 d后计算各组集落形成数目,确定FN包被的最佳浓度与时间。接种48 h未贴壁BMMNCs于25 cm^(2)培养瓶底,使用EGM-2完全培养基定向诱导,于显微镜下观察集落形成及诱导扩增进程。取培养14 d的BM-EPCs,分别采用双阳性染色法和流式细胞术鉴定BM-EPCs的纯度。结果使用Percoll分离法可把BMMNCs细胞清晰的分为5层,其中30%与50%Percoll细胞分离层之间为BMMNCs活细胞比率最高。BMMNCs的最优接种数目为2.5×10^(6)个。以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h皆可有效促进细胞集落形成。细胞接种7 d后获得形态良好的铺路石样细胞并建立生长优势,表明BMMNCs已经诱导成为形态良好的BM-EPCs。Dil-Ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞占比为91.89%±5.77%,CD31+KDR阳性率为90.73%±0.61%、CD14阳性率为0.53%±0.17%、CD45阳性率0.77%±0.34%,说明获得的BM-EPCs纯度良好。结论大鼠BMMNCs诱导扩增为BM-EPCs过程中,可使用Percoll密度梯度离心法分离BMMNCs,BMMNCs的最优细胞接种数目为2.5×10^(6)个,细胞培养瓶包被条件为以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h,分离培养诱导获得的BM-EPCs形态和纯度均良好。

PureSperm离心法在宫腔内人工授精周期中优选精子的应用

目的 :探讨PureSperm离心法在宫腔内人工授精 (IUI)周期中优选精子的效果。 方法 :采用PureSperm单、双梯度离心法及Percoll双梯度离心法分别处理精液 ,比较 3种方法的处理效果 ,并将处理后的精子悬液施行夫精IUI。 结果 :单梯度PureSperm较双梯度的PureSperm及Percoll洗涤后精子密度显著增加 (P <0 .0 1) ,双梯度PureS perm及Percoll离心法两者差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,3种方法在洗涤后精子活率、畸形率及妊娠率比较差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。洗涤后正常形态的精子数量明显增加 ,白细胞、上皮细胞及细胞碎片等非精子成分明显减少。 结论 :PureSperm离心法是一种高效、简便、安全的IUI精液处理方法。

1层和2层梯度离心法分离精子的效果评价

目的:评价1层和2层Percoll密度梯度离心法分离精子的效果。方法:20份精液标本分别行50%1层,90%和45%Percoll2层密度梯度离心分离,处理前后应用SCA(sperm class analyzer)精子质量分析仪分析精子密度、活力和圆形细胞密度。结果:1层法分离后精子回收率为(65.5±12.8)%,明显高于2层法(P<0.01);1层和2层法分离后a级精子百分率明显高于处理前(P<0.05,P<0.01),而1层法分离后a级精子百分率明显低于2层法(P<0.05);1层法分离精子后c级精子百分率明显高于2层法(P<0.05),与处理前相比没有明显差异(P>0.05);2层法分离后a+b级精子百分率明显高于处理前(P<0.05),1层法分离后a+b级精子百分率与处理前相比没有明显差异(P>0.05);1层和2层法分离后圆形细胞密度明显低于处理前(P<0.05,P<0.01),两种方法之间没有差异(P>0.05)。结论:1层法分离后精子回收率较高,精子的活力改变不大;2层法分离后精子回收率较低,精子的活力明显改善;1层和2层法都可以较好地把精子与圆形细胞分开。两种方法各有优势,在精子体外处理中都有着重要的应用价值。

Percoll密度梯度离心技术分离纯化豚鼠表皮Langerhans细胞

表皮Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ细胞（ＬＣ）仅占表皮细胞的２％～４％，但在免疫系统中占重要作用。为了对ＬＣ的表型、功能特点及分子生物学水平等作进一步研究，有必要获得高纯化率且具有活性的ＬＣ。我们采用连续、间断Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心相结合的方法分离、纯化豚鼠表皮ＬＣ。结果表明ＬＣ纯化率超过６０％，产率超过８０％，细胞活性超过９０％。自体混合白细胞应答检测证实纯化的ＬＣ仍保持功能活性。该方法简单、快速、价廉，且获得非表面标记性的ＬＣ。

小鼠睾丸精子细胞的分离与鉴定

目的 :建立一种简单、可有效分离小鼠睾丸精子细胞的方法。 方法 :用组合酶消化成年小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液 ,然后经 6层非连续Percoll梯度 (15 %、2 2 %、30 %、4 0 %、5 0 %和 6 0 % )离心法分离 ,通过形态学和流式细胞术鉴定各个Percoll梯度中精子细胞的含量 ,并以伊红Y排斥试验测定细胞的存活率。 结果 :组合酶消化后获得的睾丸细胞悬液中 ,97%以上细胞仍然存活。经Percoll梯度离心 ,共形成 6条细胞带 ,其中 2 2 %梯度中主要为精子细胞 (平均 86 .7% ,P <0 .0 5 ) ,85 .5 %以上细胞存活 ;而 30 %梯度中细胞密度最高 (P <0 .0 5 ) ,含有各级未成熟生精细胞 ,存活细胞超过 92 %。 结论 :采用组合酶消化结合非连续Percoll梯度离心法 。