小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析

淀粉合成酶SSⅡa基因是小麦淀粉合成中的关键酶基因。为了从分子水平上了解造成不同小麦品种(系)淀粉含量差异的原因,本研究根据GeneBank中的SSⅡa基因序列AF155217.2设计引物,对8个不同抗性淀粉含量的小麦品种(系)SSⅡa基因进行克隆和多态性分析,并对其氨基酸序列进行结构域预测。结果表明,8个品种的SSⅡa基因序列高度保守,与GeneBank中已发表的序列相似度达98.19%以上,共发现40个单核苷酸变异,导致20个氨基酸发生了变异。蛋白结构域分析发现这些变异位点均位于α-淀粉催化酶氨基N-末端外侧,而在α-淀粉催化酶的催化区域并未发现变异位点。另外,在新春12中,还发现了一个缺失位点,缺失片段为249bp,该缺失片段包含了糖基转移酶的部分位点。本研究为进一步从分子水平理解SSⅡa基因的结构与抗性淀粉含量之间的关系及开发分子标记辅助选择育种提供了序列信息。

小麦SBEⅡa、SSⅡa基因片段的克隆及VIGS重组载体的构建

【目的】克隆小麦SBEⅡa、SSⅡa基因部分序列并构建二者的VIGS重组载体,为在小麦上利用VIGS技术研究SBEⅡa、SSⅡa基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础。【方法】根据GenBank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)、SSⅡa(AF155217.2)基因序列分别设计特异引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa、SSⅡa基因的特异片段。然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接用SBEⅡa、SSⅡa基因片段分别将原载体中的PDS基因进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体。【结果】克隆的SBEⅡa和SSⅡa基因片段长分别是178 bp和171 bp。序列分析表明:SBEⅡa基因片段与小麦SBEⅡa(AF286319.1)序列同源性为100%;、SSⅡa基因片段与SSⅡa(AF155217.2)序列同源性也为100%;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体。【结论】构建的BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体将为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡa、SSⅡa基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础。

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。

小麦SSⅡ-A基因片段的克隆及其RNAi表达载体的构建

可溶性淀粉合成酶Ⅱ(SSⅡ)是小麦籽粒支链淀粉合成的主要角色,但是其三个部分同源基因(SSⅡ-A、SSⅡ-B和SSⅡ-D)对支链淀粉合成的贡献大小目前还未见报道,探究它们对支链淀粉合成的作用,对小麦淀粉合成的遗传操纵和淀粉品质改良具有重要意义。此文通过RT-PCR方法克隆了小麦SSⅡ-A基因cDNA的部分序列(长度为539bp),经序列比对发现,它与AB201445.1(Triticum aestivumwSSII-A gene for starch synthase II-A,complete cds)的同源性为100%。以H质粒为中间载体,构建了SSⅡ-A基因片段的发夹结构,并将之连接到pBAC47P上高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)1Dx5启动子的下游,得到了高效特异的SSⅡ-A RNAi表达载体。这些工作为下一步遗传转化获得转基因植株以深入探究SSⅡ-A基因对支链淀粉合成的贡献大小奠定了基础。

玉米SSⅡb蛋白多克隆抗体的制备及其应用

抗体是蛋白质功能研究的重要试剂。玉米蛋白的功能研究因缺乏相应的抗体而难以开展。玉米淀粉合酶Ⅱb与淀粉合酶Ⅱa均属于淀粉合酶,其主要负责支链淀粉的延伸。但对淀粉合酶Ⅱb的报道较少,本研究以原核表达的淀粉合酶Ⅱb的C端(455~704 aa) GST融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,分离血清制备SSⅡb多克隆抗体。Western blot试验发现, SSⅡb多克隆抗体不但能识别SSⅡb-C (455~704 aa)抗原,而且能识别玉米不同发育阶段胚乳中SSⅡb蛋白。利用该多克隆抗体的Western blot试验表明,玉米SSⅡb蛋白的表达在授粉后10 d到30 d的胚乳中表达模式是先增后降,授粉后15 d表达量最高,而半定量RT-PCR的结果表明授粉后20 d SSⅡb的转录水平最高。这些结果表明成功制备了特异的玉米SSⅡb的多克隆抗体,并能在Western blot中特异识别玉米内源SSⅡb蛋白,为进一步深入研究SSⅡb蛋白功能奠定基础。

SS115—31.5Ⅱ减速器输入轴轴承箱内轴承轴向游隙的确定

介绍了ＳＳ１１５－３１．５Ⅱ型减速器输入轴轴承箱内轴承的安装结构，分析了影响轴承轴向游隙的原因，最后确定地轴承轴向的游隙。

大豆皂甙对肝癌H_(22)小鼠的抗肿瘤研究(英文)

以肝癌H22荷瘤小鼠为模型,观察大豆皂甙级分SSⅡ对H22抑瘤率、细胞免疫以及抗氧化水平的影响。结果表明,大豆皂甙能显著抑制移植性肿瘤H22的生长,同时能显著提高迟发型超敏反应强度,促进T淋巴细胞增殖和NK细胞活性。抑制H22生长的同时能降低荷瘤小鼠肝中MDA含量,升高SOD活性。大豆皂甙增强H22荷瘤小鼠细胞免疫功能和提高机体抗氧化能力是其抑制肿瘤效应的机制。

稻米糊化温度的遗传与分子机理研究进展

糊化温度(gelatinization temperature,GT)是衡量稻米蒸煮品质和口感的重要参数之一。低GT稻米比高GT稻米蒸煮时需要较少的能量投入。支链淀粉的结构,特别是其分支链分布与GT密切相关,短链的含量越高,淀粉的GT越低。数量性状基因定位已经将GT相关基因定位在第6染色体的编码淀粉合酶Ⅱa(SSⅡa)的alk基因位点。SSⅡa基因的若干功能性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与GT和支链淀粉结构有关。这些SNPs已经用于标记辅助育种来改良稻米品质。提出了通过SSⅡa控制高或低GT的分子机理。