人TRF2基因有效siRNA序列的筛选

目的设计合成干扰端粒重复序列结合因子2(telomeric repeatbinding factor 2,TRF2)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制TRF2基因表达的siRNA。方法根据人TRF2 mRNA的序列,设计合成3对不同的针对TRF2的siRNA、应用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂将三对siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞,实时荧光定量RT-PCR技术检测TRF2 mRNA表达水平、Western印迹法检测TRF2蛋白表达以确定干扰效果。结果设计合成的3对TRF2 siRNA中有2对siRNA可有效抑制TRF2基因表达。结论成功设计合成了针对TRF2基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断TRF2表达的siRNA,为进一步应用RNAi技术抗TRF2基因进行肿瘤基因治疗研究奠定实验基础。

获得性再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞TRF1、TRF2、RAP1 mRNA表达研究

本研究检测获得性再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞的TRF1、TRF2、RAP1基因表达水平,探讨其与获得性再生障碍性贫血发病的关系。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测40例获得性再生障碍性贫血患者和20例正常对照组外周血单个核细胞中TRF1、TRF2、RAP1的基因表达情况。结果表明,获得性再生障碍性贫血患者的TRF1和RAP1 mRNA表达水平较正常对照组明显升高(P<0.05);TRF2 mRNA表达水平较正常对照组明显降低(P<0.01),并且TRF2与RAP1具有相关性(r=0.522,P=0.001)。结论:TRF1、TRF2、RAP1可能参与了获得性再生障碍性贫血的发病过程。

端粒结合蛋白TRF2的研究进展

端粒DNA结合蛋白TRF2(TTAGGG repeat binding factor-2)以二聚体形式通过Myb结构域与端粒重复序列TTAGGG结合,并与TRF1、TIN2、Rap1、TINT1及POT1蛋白组成Shelterin蛋白复合物,协同在端粒动态平衡维持过程中起关键作用,进而影响整个基因组的稳定性。此外,TRF2在细胞DNA损伤应答过程中可能发挥重要作用。本文将对TRF2结构和功能研究的最新进展进行综述。

端粒蛋白TRF1、TRF2和TIN2在宫颈鳞癌中的表达及意义

目的研究端粒结合蛋白TRF1、TRF2和TIN2在宫颈鳞癌中的表达及意义。方法采用免疫组化方法检测TRF1、TRF2和TIN2蛋白在15例正常宫颈上皮和35例宫颈鳞癌组织中的表达。结果 TRF1蛋白在宫颈鳞癌中阳性表达率(40.0%)低于正常宫颈上皮组织(86.7%)(P<0.01)。TRF2蛋白在宫颈鳞癌中的表达(80.0%)高于正常宫颈上皮组织(33.3%,P<0.01)。TIN2蛋白在宫颈鳞癌中表达(74.3%)高于正常宫颈上皮组织(40.0%,P<0.01)。结论 TRF1蛋白表达降低和TRF2与TIN2蛋白表达升高在宫颈癌的发展过程中起重要作用。

六味痛风饮联合苯溴马隆治疗痛风性关节炎疗效及对患者外周血TRF1、TRF2的影响

目的探讨苯溴马隆联合六味痛风饮治疗痛风性关节炎的临床疗效及对患者外周血端粒重复序列结合蛋白(TRF) 1和TRF2的影响。方法将74例痛风性关节炎患者按照随机数字表法分为对照组与研究组,对照组采用苯溴马隆治疗,研究组在此基础上加用六味痛风饮治疗。治疗4周后,对比2组患者的临床疗效、不良反应,观察治疗前后血尿酸、血清炎症因子及外周血TRF1、TRF2水平的变化。结果治疗4周后,研究组总有效率明显高于对照组(P <0. 05);研究组的血尿酸,血清IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α以及外周血单核细胞TRF1、TRF2水平均显著低于治疗前及同期对照组(P均<0. 05),TGF-β_1水平较治疗前及对照组显著升高(P均<0. 05),IL-4水平与治疗前及对照组比较差异无统计学意义(P均> 0. 05)。治疗及随访过程中,2组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P> 0. 05),研究组的复发率显著低于对照组(P <0. 05)。结论六味痛风饮联合苯溴马隆可有效降低痛风性关节炎患者的血尿酸水平,改善临床症状,降低复发率,通过抑制免疫细胞的活化增殖,调控TRF1和TRF2的高表达来降低机体免疫炎症反应可能是其作用机制之一,可考虑进一步推广使用。

siRNA-TRF2对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的构建表达端粒重复序列结合因子2基因小干扰RNA的腺病毒表达载体(rAd-shR-NA-TRF2),探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法根据预实验筛选出的针对人TRF2 mRNA的特异性siRNA靶序列,构建表达siRNA-TRF2的重组腺病毒载体rAd-shRNA-TRF2,转染人乳腺癌MCF-7细胞后,用MTT比色法检测MCF-7细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布情况。结果 rAd-shRNA-TRF2转染MCF-7细胞后,MCF-7细胞增殖抑制、细胞周期阻滞于G0/G1期、增殖指数显著下降。结论通过RNAi抑制TRF2基因表达进而抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖的方法有望成为肿瘤基因治疗的一个新策略。

应用实时荧光定量PCR筛选TRF2 siRNA最佳靶序列

有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。[目的]筛选有效的TRF2 siRNA,为应用RNAi技术抗TRF2研究提供实验基础。[方法]采用化学合成法合成3段针对TRF2的siRNA、应用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂将3段siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞、实时荧光定量RT-PCR技术检测TRF2 mRNA表达水平以确定干扰效果。[结果]3段TRF2 siRNA中有2段siRNA可有效降低TRF2 mRNA表达。[结论]利用化学合成法合成siRNA,应用实时荧光定量PCR技术检测目的基因干扰效果可用于快速、高效筛选特异性基因表达抑制的siRNA。

P53与TRF1、TRF2的体外结合及P53结合功能区的分析

通过分析端粒结合蛋白TRF1、TRF2与P5 3的体外结合 ,探讨P5 3 端粒途径调节细胞生命活动的分子机制 .GST和 4种人P5 3 GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽 SepharoseTM4B纯化后 ,进行SDS PAGE和考马斯亮篮染色 .人P5 3包括野生型 (1～ 393)、C端缺失体P5 3N5 (2～ 2 93)、N端缺失体P5 32C(95～ 393)、单个氨基酸突变体P5 3R175H(175R→H) .各纯化蛋白的分子量与预计的完全一致 ,且纯化率达 90 %以上 .将纯化的GST和P5 3 GST融合蛋白与人乳腺癌细胞MCF 7细胞蛋白进行体外结合反应 ,Western印迹检测反应物中P5 3和TRF1、TRF2的结合 .野生型P5 3和P5 3 R175H均能沉淀MCF 7中的TRF1、TRF2 ,且结合力相似 ,而单独的GST则无沉淀TRF1、TRF2的作用 .与野生型P5 3和P5 3R175H相比 ,P5 32C与TRF1、TRF2的结合力明显增加 ,P5 3N5与TRF1、TRF2的结合力大大减弱 .表明P5 3和TRF1、TRF2可以进行直接而特异的体外结合 ,且它们的结合为P5 3C端 (2 93～ 393)结构域依赖性 .P5 3和TRF1、TRF2这种结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关 .

牛Trf2基因的cDNA克隆和生物信息学分析

[目的]探讨牛Trf2基因的生物学功能,为进一步研究该基因对牛精液品质的影响奠定基础。[方法]以牛睾丸组织为材料,根据GenBank中发表的人Trf2基因序列,结合生物信息学技术,设计并合成3对引物,采用RT-PCR方法克隆牛Trf2cDNA,并运用DNA-MAN软件及在线工具对所得到的序列进行生物信息学分析。采用牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、瘤胃、子宫、小肠、心脏、脾脏、卵巢和脂肪组织共11个组织,以牛-βactin基因为内参基因,对牛Trf2基因的组织表达谱进行分析。[结果]牛Trf2基因cDNA长度为1 701 bp(Gen-Bank登录号EU140625),包含由561个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF包含1个UGA终止密码子,编码186个氨基酸;在进化关系上,牛首先和人、大鼠、狗聚成一类,然后与袋鼠聚成第1群,再与小鼠聚成第2群。Trf 2蛋白含有2个结构域TLF和SPT15。牛Trf2基因在各个组织中都有表达,在睾丸组织中表达最高。[结论]获得了牛Trf2基因的cDNA序列(GenBank登录号EU140625);牛Trf 2蛋白可能对牛精液品质有影响。

DNA损伤诱导胃癌细胞端粒酶活性和TRF2表达增高

目的:检测在化疗药引起胃癌细胞DNA损伤过程中端粒酶、TRF1和TRF2的表达.方法:用不同浓度足叶乙甙处理胃癌细胞SGC7901和MKN28,分别在3,6,12,24和36h进行检测.采用实时定量TRAP分析检测端粒酶活性;用实时RT-PCR检测hTERTmRNA表达;用Westernblot和实时RT-PCR检测TRF1和TRF2表达.结果:两种细胞端粒酶活性及TRF2mRNA表达均在药物处理的早期明显增高(P<0.05),且显示明显的药物浓度依赖性(P<0.05);TRF1表达稍增高,但无统计学意义(P>0.05).hTERTmRNA表达无明显改变(P>0.05).TRF2表达在蛋白和mRNA水平均增高(P<0.05).结论:端粒酶和TRF2参与化疗药引起的胃癌细胞DNA损伤反应.

子宫内膜非典型增生中TRF1、TRF2和H3K27me3的表达及意义

目的探讨端粒重复序列结合因子1(TRF1)、端粒重复序列结合因子2(TRF2)和组蛋白H3K27三甲基化(H3K27me3)免疫组化在子宫内膜非典型增生组织中的诊断作用。方法收集2016年3月至2018年11月广东省韶关市第一人民医院诊断的不伴子宫内膜非典型增生标本30例和子宫内膜非典型增生标本60例及子宫内膜样癌30例。利用免疫组化SP法检测TRF1、TRF2及H3K27me3在这些标本中的表达情况。结果TRF1、H3K27me3、TRF2在子宫内膜非典型增生组中的表达率分别为35.00%(21/60)、43.33%(26/60)、71.67%(43/60),在不伴非典型子宫内膜增生组的表达率83.33%(25/30)、73.33%(22/30)、30.00%(9/30),在子宫内膜样癌组中的表达率为30.00%(9/30)、36.67%(11/30)、76.67%(23/30)。子宫内膜非典型增生与不伴非典型子宫内膜增生表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜非典型增生与子宫内膜样腺癌表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论子宫内膜非典型增生TRF1及H3K27me3低表达,TRF2高表达,联合TRF1、TRF2和H3K27me3有助于鉴别不典型子宫内膜增生与不伴有非典型子宫内膜增生,有助于子宫内膜非典型增生的早期诊断,推荐在常规病理工作中使用。

TRF2在食管鳞癌中的表达及意义

目的:探讨端粒重复序列结合因子2(Telomeric repeat binding factor2,TRF2)在食管病变中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化ABC法检测60例食管鳞状细胞癌、30例食管上皮内瘤变和20例食管正常组织中TRF2的表达,并探讨与食管癌临床病理特征之间的关系。结果:在正常上皮组织、上皮内瘤变和食管鳞癌组织中,TRF2的阳性表达率分别为35%、56.7%和96.7%。食管鳞癌组织中,TRF2的表达与淋巴结转移和病理分级呈轻度正相关(P<0.01)。结论:TRF2在食管癌组织中表达异常增高,提示TRF2与食管癌的发生、发展有密切的关系,检测TRF2的表达可能成为判断食管鳞癌生物学行为的重要指标。

端粒结合蛋白TRF1和TRF2表达水平在炎症性肠炎患者中的意义

目的探讨端粒结合蛋白TRF1和TRF2表达水平在炎症性肠炎患者中的意义。方法检测14例溃疡性结肠炎,13例克罗恩病患者体内TRF1和TRF2表达水平,并与正常人群比较。结果 B组TRF1的mRNA表达水平显著低于A组(P<0.05),同时A组TRF1的mRNA表达水平亦显著低于C组(P<0.05),A组与B组TRF2的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),C组TRF2的mRNA表达水平均高于A组和B组。结论炎症性肠炎的发生发展与患者体内端粒融合以及染色体突变互为因果。

宫颈鳞癌和上皮内瘤变组织中TRF1、TRF2及HPV16、HPV18的检测及其意义

目的研究端粒结合蛋白TRF1、TRF2在宫颈鳞癌发生发展中的作用并分析HPV16、HPV18感染与TRF1、TRF2蛋白表达的关系。方法随机选择南华大学附属第一医院病理科2005年9月至2006年10月期间的组织石蜡块标本共86例,采用原位杂交方法检测HPV16、HPV18在15例正常宫颈上皮、36例宫颈上皮内瘤变(CIN)和35例宫颈鳞癌组织中的感染情况;采用免疫组化方法检测所有组织标本中TRF1、TRF2蛋白的表达。结果(1)HPV16、HPV18阳性感染率CIN组[63.9%(23/36)]和宫颈鳞癌组[97.1%(34/35)]显著高于正常组[20.0%(3/15)](χ2=30.639,P<0.01)。(2)TRF1阳性表达率宫颈鳞癌组[40.0%(14/35)]显著低于CIN组[63.9%(23/36)]和正常组[86.7%(13/15)](χ2=10.237,P<0.01);CINⅢ组[42.9%(6/14)]显著低于CINⅠ组[90.0(9/10)](χ2=5.531,P<0.01)。TRF2阳性表达率宫颈鳞癌组[80.0%(28/35)]显著高于CIN组[52.8%(19/36)]和正常组[33.3%(5/15)](χ2=11.096,P<0.01)。(3)HPV16、HPV18感染与TRF1蛋白的表达强度负相关(Rs=-0.302,P<0.05),与TRF2蛋白的表达强度正相关(Rs=0.452,P<0.01)。结论TRF1、TRF2在宫颈鳞癌的发展中起重要作用。TRF1表达的下调和TRF2表达的上调与HPV16、HPV18感染致宫颈鳞癌密切相关。

人乳腺癌MCF-7细胞的TRF2 siRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建表达端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因小干扰RNA(siRNA-TRF2)的腺病毒表达载体(rAd-shRNA-TRF2),并检测该载体对人乳腺癌(MCF-7)细胞TRF2基因表达的沉默效应。方法:采用同源重组法构建重组腺病毒rAd-shRNA-TRF2表达载体,鉴定正确后转染MCF-7细胞,用FQ-RT-PCR和Western blot检测转染后48 h TRF2基因的表达,MTT法和克隆形成实验检测细胞生长状况。结果:重组腺病毒rAd-shRNA-TRF2包装成功,转染MCF-7细胞后,TRF2基因的表达明显被抑制,细胞生长显著抑制,细胞克隆形成能力显著下降。结论:腺病毒介导的TRF2 RNAi表达载体rAd-shRNA-TRF2构建成功,可有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞TRF2基因的表达,抑制细胞生长。

端粒重复序列结合蛋白TRF1及TRF2在前列腺癌中的表达及临床意义

目的：探讨端粒重复序列结合蛋白（telomere repeat binding factor 1,TRF1）及TRF2在前列腺癌中的差异性表达及临床意义。方法：选取我院2015年1月~2016年4月住院的前列腺癌患者及前列腺增生患者各50例,采用免疫组织化学方法检测各组患者TRF1及TRF2的表达,并对其表达水平与临床指标及Gleason评分进行相关性分析。结果：前列腺癌组织中TRF1蛋白表达水平明显高于前列腺增生组织,差异具有统计学意义（χ^2=62.69,P〈0.01）;TRF2蛋白在两组中均呈现高表达,差异未见明显统计学意义（χ^2=1.13,P=0.76）;单因素分析发现TRF1表达水平与有无外科包膜侵犯（Spearman＇s r=0.43,P=0.002）、精囊浸润（Spearman＇s r=0.35,P=0.01）及淋巴结转移（Spearman＇s r=0.41,P=0.003）、TPSA水平（r=0.61,P〈0.05）、Gleason评分（r=0.47,P=0.01）具有显著相关性,而与前列腺体积大小（r=0.06,P=0.75）及年龄（r=0.14,P=0.09）无明显相关性。结论：TRF1及TRF2在前列腺癌中均呈现高表达,但TRF2的表达无特异性,TRF1的表达对预测前列腺癌预后具有一定价值。

TRF2通过调节HIF-1α介导的血管生成对宫颈癌细胞上皮-间质转化的影响

目的探讨TRF2调节HIF-1α介导的血管生成对宫颈癌细胞上皮-间质转化的影响。方法选择2018年3月至2020年2月在黄石市爱康医院经病理检查确诊,手术切除治疗的18例宫颈癌患者为研究对象。采用免疫组织化学法检测TRF2在宫颈癌组织及癌旁正常组织中的表达,采用Western blot检测TRF2在宫颈癌细胞Hela与宫颈上皮细胞Hcer Epic中的表达。将Hela细胞分为si-NC组(转染si-NC)与si-TRF2组(转染si-TRF2),采用克隆形成实验、Transwell实验和划痕闭合实验检测Hela细胞增殖、侵袭及迁移能力,采用小管形成实验检测人脐静脉上皮细胞(HUVEC)毛细管壁形成情况;采用Western blot检测Hela细胞中TRF2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、HIF-1α及VEGF-A的表达。结果 TRF2在宫颈癌组织及细胞中高表达;与si-NC组相比,si-TRF2组Hela细胞的增殖、侵袭及迁移能力均降低,HUVEC血管壁的形成能力降低,EMT相关蛋白E-cadherin的蛋白表达水平升高,而N-cadherin、Vimentin及Snail的蛋白表达水平降低,血管形成相关分子HIF-1α与VEGF-A的表达水平降低。结论沉默TRF2的表达可能会通过抑制HIF-1α介导的血管生成而抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭、转移及上皮-间质转化。

Fas及TRF1、TRF2在亚硒酸钠诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡过程中的表达

目的通过检测Fas蛋白及端粒结合蛋白TRF1、TRF2在亚硒酸钠诱导胃癌细胞SGC-7901细胞凋亡过程中的表达,探讨硒抗癌的机制。方法用含不同浓度亚硒酸钠(0.5、2.5、5.0、.8.0μmol/L)的培养液分别培养人胃癌细胞株SGC-7901细胞24、48、72、96h后,用流式细胞仪检测Fas蛋白的表达;链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法和Western blot法检测TRF1、TRF2蛋白的表达。结果亚硒酸钠能提高Fas蛋白阳性表达细胞百分比(P<0.05)。免疫细胞化学法检测结果显示:亚硒酸钠可以降低TRF1蛋白和提高TRF2蛋白的灰度值(P<0.05)。Western blot检测结果显示:亚硒酸钠可以提高TRF1和降低TRF2蛋白表达强度(P<0.05)。它们都具有剂量依赖性。结论亚硒酸钠诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的机制可能跟上调Fas蛋白和TRF1蛋白表达,下调了TRF2蛋白表达有关。

实时定量PCR检测TRF1、TRF2和hRAP1基因在急性髓细胞性白血病中mRNA表达

目的:建立一种实时荧光RT-PCR方法,定量检测急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血白细胞细胞TRF1、TRF2和hRAP1mRNA的表达水平及相互关系。方法:选取48例初治AML患者和21例健康志愿者,采用实时荧光RT-PCR与Lightcyeler荧光PCR仪定量检测TRF1、TRF2和hRAP1mRNA的表达水平;采用2-△△Ct法处理实时荧光定量RT-PCR数据。结果:AML首治患者TRF1、TRF2和hRAP1mRNA表达水平较对照组健康志愿者分别下降了2.9倍,2.2倍和16.6倍,且差异有统计学意义;AML患者组TRF1和TRF2mR-NA的表达改变具有一定的相关性(r=0.57,P<0.01)。结论:成功利用患者外周血检测出端粒结合蛋白TRF1,TRF2在白血病细胞中mRNA的表达水平下降,并首次检测发现hRAP1在AML患者细胞中存在表达下降,间接说明了hRAP1的表达下降也是白血病的发病原因之一。

子宫内膜癌组织中端粒蛋白TRF1和TRF2的表达及意义

目的研究子宫内膜癌组织内端粒蛋白TRF1、TRF2的表达水平及临床应用意义。方法选取韶关市第一人民医院2015年1月-2016年12月住院部收治的60例子宫内膜癌患者作为病例组,同时选取同期在我院行诊断性刮宫术治疗的30例健康子宫内膜患者作为对照组。采用免疫组化方法对两组患者的端粒蛋白TRF1、TRF2及细胞分化水平进行检测,并比较两组患者端粒蛋白TRF1、TRF2阳性率。结果子宫内膜癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移、肌层浸润等情况与端粒蛋白TRF1、TRF2的表达水平无明显相关性;TRF1、TRF2在子宫内膜癌、健康子宫内膜内表达相关性明显(Rs_1=0.519,P_1=0.000;Rs_2=0.541,P_2=0.000)。结论临床医学可根据端粒蛋白TRF1、TRF2表达水平进行早期子宫内膜癌防治,为临床医学研究提供分子生物学机制,降低子宫内膜癌发生风险,改善治疗效果。