钙通道TRPV6基因在子宫内膜癌表达及其临床意义的初步研究

目的:研究TRPV6在子宫内膜癌组织的表达及其与临床病理特征的关系。方法:选取58例子宫内膜癌石蜡切片,用免疫组化法测定TRPV6的分布及表达,分析其与临床病理之间的关系;另取31例正常子宫内膜及13例不典型增生内膜石蜡切片为对照。选取15例子宫内膜腺癌及11例正常子宫内膜新鲜组织标本,以实时定量PCR方法检测TRPV6的表达。结果:(1)TRPV6在子宫内膜癌组织的表达主要位于胞膜及胞浆内,阳性表达率77.6%,显著低于非绝经期子宫内膜组织(100%)及不典型增生子宫内膜组织(100%)(P<0.05),且前者表达强度显著低于后二者(P<0.01)。mRNA水平研究表明TRPV6在内膜癌组织中的表达也显著低于正常内膜组织(P<0.05);(2)绝经后子宫内膜癌患者TRPV6阳性表达率为71.8%,显著低于未绝经患者(89.5%);(3)在子宫内膜癌组织中,宫颈受累者TRPV6阳性率显著高于宫颈未受累者(89.3%vs 67.7%,P=0.039)。结论:TRPV6在子宫内膜癌组织的表达低于正常子宫内膜组织,TRPV6阳性表达者较多发生子宫内膜癌宫颈受侵,表明钙通道蛋白TRPV6与子宫内膜癌有一定的关系,为探讨子宫内膜癌发病分子机制提供了研究资料。

TRPV6对结肠癌SW480细胞生物学行为及小鼠模型中结肠肿瘤发生的影响

目的:通过观察沉默瞬时受体阳离子通道亚家族V成员6(transient receptor potential cation channel,subfamily V member 6,TRPV6)对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响和细胞内钙的浓度变化,以及1,25(OH)_2D_3、CaCl_2及CuCl_2在SD大鼠结肠肿瘤模型建立中的影响,探索TRPV6在结肠癌发生过程中的相关作用,为结肠癌的防治寻找新的靶点。方法:通过构建慢病毒颗粒感染结肠癌SW480细胞,采用免疫组织化学法、Western bolt、PCR技术检测TRPV6蛋白及m RNA的表达,MTT法、迁移及凋亡实验观察结肠癌SW480细胞增殖、迁移及凋亡变化,高速离子成像系统测定结肠癌SW480细胞内的Ca^(2+)浓度变化。以二甲基肼(dimethyl hydrazine,DMH)建立SD大鼠结肠肿瘤模型,分为实验组(DMH组)和干预组[(DMH+1,25(OH)_2D_3组、DMH+CuCl_2组)]、对照组,干预组分别予1,25(OH)_2D_3(37.5 nmol/kg)、CuCl2(375μmol/kg)对模型进行干预。观察各组大鼠结肠腺瘤及腺癌的发生情况,Western blot检测各组结肠组织中TRPV6蛋白的表达情况。结果:TRPV6-RNAi转染结肠癌SW480细胞后,TRPV6 m RNA及蛋白表达减少,细胞Ca^(2+)浓度水平降低,结肠癌SW480细胞的增殖率、迁移能力下降,细胞凋亡率增加,与空白对照组及阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。对照组大鼠成瘤率为0,DMH+1,25(OH)_2D_3组为100%,DMH组为84.62%,DMH+CuCl_2组为33.33%。各组大鼠大肠中均有TRPV6蛋白的表达,表达情况为DMH+1,25(OH)_2D_3组>DMH组>DMH+CuCl_2组>对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:降低结肠癌SW480细胞Ca^(2+)浓度水平可抑制结肠癌SW480细胞的增殖、迁移能力,诱导细胞凋亡。1,25(OH)_2D_3可以增加实验鼠结肠组织TRPV6蛋白表达,促进结肠肿瘤的形成。CuCl_2可以使实验鼠结肠组织中的TRPV6蛋白表达降低,并抑制结肠肿瘤的形成。

上皮钙通道基因在维生素D受体和Calbindin-D28k双基因敲除鼠中的变化

目的研究上皮钙通道TRPV5和TRPV6基因与维生素D受体(VDR)和钙结合基因Calbindin-D28k的关系,以及肾钙的重吸收减少是否与TRPV5和TRPV6基因表达减少有关。方法制备VDR和CaBP-D28k双基因敲除小鼠,普通和高钙食物喂养下,检测野生型鼠(WT),CaBP-D28(-/-),VDR(-/-),和VDR(-/-)/CaBP-D28k(-/-)鼠的体重、摄食量及血尿参数值,用实时RT-PCR的方法检测各种鼠肾脏TRPV5和TRPV6的mRNA水平。结果普通饮食下,双基因敲除小鼠尿钙的分泌和血清甲状旁腺激素水平更高。TRPV5和TRPV6两者的表达在CaBP-D28k敲除鼠中均无变化,而在VDR敲除鼠和双基因敲除鼠中下调的幅度相当。高钙饮食下,VDR及双基因敲除小鼠的血离子钙水平正常。所有小鼠这两个基因的表达普遍降低,而在VDR和双基因敲除鼠中的表达更低。结论这些结果证实了上皮钙通道基因受钙和维生素D的调节,CaBP-D28k的缺失对两者无影响。肾钙的重吸收减少与TRPV5和TRPV6基因表达无明显关系。

瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6基因敲除小鼠模型的建立

目的建立瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6(Trpv6)基因敲除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系奠定基础。方法从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因敲除策略,构建基因敲除载体pBR322-MK-Trpv6。以电穿孔方法将基因敲除载体导入胚胎多能干细胞(ES细胞),用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆。PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆。将正确同源重组的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合体小鼠。挑选嵌合率在50%的雄鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得的灰鼠经PCR鉴定为杂合子小鼠。杂合子小鼠交配后获得纯合子小鼠。结果成功构建了打靶载体pBR322-MK-Trpv6。电穿孔后,共获得24个正确同源重组的克隆,同源重组效率为25%。同源重组的克隆经显微注射后,共获得4只嵌合率大于50%的雄鼠。嵌合鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得57只来源于ES细胞的灰鼠,PCR鉴定证实其中17只为杂合子小鼠,阳性率为29.8%。杂合子小鼠交配获得纯合子小鼠。经蛋白质印迹分析证实纯合子小鼠无Trpv6蛋白的表达。结论成功建立了Trpv6基因敲除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象。