C群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗的制备及其在小鼠体内免疫原性的研究

将C群脑膜炎球菌荚膜多糖以ADH作为间隔剂与TT结合形成GCMP-TT结合疫苗,然后用此结合疫苗免疫NIH小鼠,结果显示使用GCMP免疫小鼠后仅能产生较低水平抗GCMP的IgG抗体,而用GCMP-TT免疫后小鼠血清中产生了较GCMP免疫显著增高抗GCMP的IgG抗体,并且GCMP-TT组第二次和第三次免疫后与初次免疫相比,IgG抗体水平均有显著升高(P<0.01),表明GCMP-TT结合疫苗具有免疫记忆和再次免疫加强应答效应。补体介导的血清抗体体外杀菌试验结果证明,GCMP-TT结合疫苗组免疫小鼠诱导的抗体IgG比GCMP组具有增强的体外杀菌活性。

破伤风毒素C片段(TTc)在大肠杆菌中的表达、优化与鉴定

HTSS以一株破伤风生产菌株基因组DNA为模板,通过上游引物中几个碱基的修改,PCR扩增出破伤风毒素C片段(TTc)基因,构建了原核表达质粒pET-42(b)/TTc,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。重组蛋白分子量约50kD,表达量为22%,超声波破碎显示为可溶性重组蛋白。通过对培养基、诱导时间、诱导温度的优化,重组蛋白的表达量和可溶性均有提高。Western blotting检测表达产物可与破伤风C片段单克隆抗体产生特异的免疫反应。该工作为亚单位疫苗或载体蛋白的开发奠定了基础。

DTaP-Hib联合疫苗中Hib-TT免疫原性研究

考查DTaP-Hib联合疫苗中Hib-TT的免疫原性，对其剂量、免疫持久性和抗原相容性进行分析。将不同剂量的Hib-TT、DTaP-Hib联合疫苗分别免疫小鼠，设单价的Hib-TT结合疫苗为对照，末次免疫后1、2、4、6、8、10w分别采集血清测定血清中Hib多糖抗体滴度。结果显示，不同剂量的Hib-TT和DTaP疫苗联合后均具有较好的免疫原性，血清中Hib多糖抗体阳转率达100％，并具有剂量效应和较好的免疫持久性。2．5μg剂量Hib-TT的DTaP—Hib联合疫苗免疫小鼠后1～2w诱导产生的Hib多糖抗体水平显著性地低于单价Hib-TT（P〈0．05），4～10w，二者的Hib多糖抗体水平无显著性差异（P〉0．05）。5μg剂量Hib-TT的DTaP-Hib联合疫苗在免疫小鼠后1w诱导产生的Hib多糖抗体水平与单价2．5μg剂量Hib-TT无显著性差异（P〉0．05），免后2—10w则显著性地高于单价2．5μg剂量Hib-TT（P〈0．001）。Hib-TT和DTaP疫苗联合后，仍然具有较好的免疫原性、剂量效应和免疫持久性；其抗原性干扰只是暂时的。

CT-1及TTC的GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的构建心肌营养素-1(CT-1)和破伤风外毒素C片段(TTC)重组融合蛋白表达质粒。方法利用PCR、TA克隆等技术将CT-1及TTC基因克隆并连接到pGEX-4T-3,再做酶切鉴定、序列测定。在不同温度不同时间,通过IPTG诱导pGEX-CT-1/TTC在DH5α大肠杆菌中表达,SDS-PAGE分析表达量和可溶性蛋白GST-CT-1/TTC比例。结果构建的pGEX-CT-1/TTC酶切结果可见606 bp1、356 bp大小的片段,与预期结果一致,测序结果表明序列正确。通过IPTG诱导,发现35℃诱导4 h,目的蛋白GST-CT-1/TTC表达量占全菌的1/5,可溶性蛋白与包涵体比为2/5。结论本实验成功构建了pGEX-CT-1/TTC重组融合质粒,为下一步将其用于脊髓损伤的治疗研究打下了基础。

破伤风毒素及其片段的免疫效果

本文首次报道了破伤风毒素及其片段和片段组合对小鼠的免疫效果。通过凝胶过滤和离子交换等方法提纯了破伤风毒素及其片段。各片段中残余素素的污染率为0～0.8%。将各片段给小鼠免疫均能诱导产生保护性抗体,用破伤风毒素攻击后能使部分小鼠免于死亡。当免疫小鼠的血清抗体滴度>1∶4(0.01HAU/ml)时,小鼠在毒素攻击后一般可免于死亡,当血清抗体滴度>1∶128(0.5HAU/ml)时,则小鼠经攻毒后一般不表现出任何中毒症状,当血清抗体滴度处于二者之间时,小鼠一般表现有破伤风中毒症状,但大部分可以存活。毒素的三个片段均能诱导产生保护性抗体,但存在着明显的差别。

破伤风梭菌毒素致小鼠肌肉痉挛虚拟仿真实验建设

针对病原生物学实验教学中存在的生物安全问题,将虚拟仿真技术应用于病原生物学实验教学,设计了破伤风梭菌毒素致小鼠肌肉痉挛虚拟仿真实验。通过该实验,学生可以有序地完成原来难以实现的病原生物学实验操作,循序渐进地掌握实验的全过程。借助于虚拟仿真实验教学平台,可解决病原生物学实验面临的实验室生物安全等问题,同时能有效激发学生的学习兴趣,提高学生实际操作能力。

应用ELISA与中和试验测破伤风抗毒素的比较

用ELISA间接法测得的TT，DT．DTP免疫豚鼠后的破伤风毒素水平，与用中和试验所得结果之间有很好的相关性。ELISA毒素结合抑制法测得的标抗、马抗TT血清、DTP免疫的豚鼠血清的抗毒素水平与中和毒素试验所得结果之间也有很好的相关性。ELISA方法简单、经济，结果可靠，适于检测破伤风抗毒素水平。

基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法

目的利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法。方法构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TLc)分别对目的蛋白进行酶切反应。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化。酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值。结果设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒。表达并纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白,命名为CYVAMP。利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2~32μmol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65~110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适。CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图最大时在1.5左右,最小在0.5左右。酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16±0.28)s-1。TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1。结论成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需。

中枢神经系统靶向性Mn-SOD的克隆和在大肠杆菌中的表达研究

靶向性超氧化物歧化酶 (SOD)是治疗氧自由基引起神经细胞损伤所致疾病等的有效途径 .将破伤风毒素C部分 (tetanustoxinfragmentC ,TTC)基因与编码Mn SOD的cDNA融合克隆进pET 2 2b(+)载体 ,1mmol/L异丙基 D 硫代半乳糖 (IPTG)诱导在大肠杆菌中表达 .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)图谱可见约 71ku有表达产物条带 ,与理论计算值相符 ;蛋白质印迹 (Westernblot)分析显示 ,表达产物与抗Mn SOD及破伤风毒素的多抗有免疫反应 ,而且表达产物用邻苯三酚自氧化法测定具有SOD活性 .融合蛋白可作为有效的试剂靶向性输送Mn SOD到神经元细胞 。

破伤风毒素全基因片段PCR扩增、克隆和序列分析

目的 对破伤风毒素全基因片段扩增、克隆和测序,以便有效利用。方法 根据A、B、C3个片段的基因序列,分别设计上游和下游引物,采用PCR扩增,并克隆3个片段,进行序列测定。结果 所克隆的基因（AF389424）与GenBank中的基因序列比较变异较小,C片段基因与国内克隆株AF154828相同。结论 为进一步研究、利用奠定基础。

人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

目的构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并进行原核表达和生物学特性鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,获得二硫键稳定的抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)单链抗体基因(27G-scdsFv)。连接pET22b(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot法鉴定表达产物。ELISA检测27G-scdsFv体外抗原特异结合活性和抗体相对稳定性;非竞争酶免法检测抗体亲和力。采用免疫荧光法检测27G-scdsFv体外中和活性。结果测序结果显示获得正确的27G-scdsFv基因。原核表达scdsFv以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的50%。复性后的27G-scdsFv保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,亲和力较其scFv形式略有提升,KD=0.93×10-7mol/L,1 L培养物可获得5 mg scdsFv蛋白。27G-scdsFv的稳定性较scFv形式明显增强。27G-scdsFv在体外可以明显抑制TeNT-Hc与神经元细胞的结合。结论成功构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并获得有活性的目的蛋白,为27G-scdsFv的进一步生物学功能研究奠定基础。

破伤风毒素C基因的克隆及重组C蛋白的表达和免疫原性研究

对破伤风毒素C基因(TTC)进行了克隆,在大肠杆菌中构建了C基因-硫氧还蛋白融合表达系统并对其进行了重组表达,对表达后蛋白进行了纯化和rTTC的免疫原性初步研究。结果表明,该系统可高水平表达可溶性rTTC,rTTC表达量占可溶性蛋白的28.19%,纯化后纯度为96.92%;所获得的rTTC具有良好的免疫原性,可为开发新一代破伤风亚单位疫苗奠定基础。

破伤风毒素C片段基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

本研究对破伤风毒素C片段进行了基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出大小为1356 bp的破伤风毒素C片段(TetC)基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登录的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆至大肠杆菌融合表达载体pGEX-6P-1,构建成重组表达质粒pGEX-6P-1-TetC,并在大肠杆菌BL21中表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的21%。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为76 Ku左右的重组蛋白,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。

大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段的免疫原性分析

目的 分析大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段 (简称TTC)的免疫原性。方法 利用分子生物学技术在大肠杆菌中表达破伤风毒素C片段 ,用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化。参照2 0 0 0年版《中国生物制品规程》的方法检测表达产物的效价。用间接血凝实验检测免疫动物血清中的破伤风抗体单位。结果 重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的 15 %。纯化后蛋白纯度达到 96 5 %。免疫效价为 18 70 6IU mg ,ED50 为 2 0 μg。 1μgTTC经 4次免疫能诱导机体产生足够的抗体 ,保护动物免受破伤风毒素的攻击。 结论 重组蛋白具有良好的免疫原性 。

福氏2a痢疾杆菌O-特异性多糖与破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫学特性

通过己二酸二肼 (ADH)将福氏 2a痢疾杆菌脂多糖 (LPS)经酸水解脱毒纯化后得到的O SP和破伤风类毒素 (TT)蛋白共价结合 ,制备了福氏 2a痢疾杆菌结合物。以 2 5 μg多糖或含 2 5 μg多糖的结合物经皮下注射免疫NIH品系雌性小鼠 ,同时以 2 5 μg多糖或含 2 5 μg多糖的结合物经耳缘静脉注射家兔。用ELISA方法分别检测小鼠和家兔血清中抗脂多糖抗体水平及抗TT水平 ,并用豚鼠血清补体介导进行了体外杀菌实验。结果显示 :用本实验方法提取的多糖 ,合成的多糖衍生物 ,多糖 蛋白结合物都具有福氏 2a痢疾杆菌O 抗原特异性 ,其化学组成及结构特异性和国外文献报道基本一致。单独用多糖免疫小鼠和家兔未能诱导LPS抗体 ,而结合物免疫小鼠和家兔的血清诱导出了较高的抗LPSIgG抗体及抗TT抗体 ,并有较强的体外杀菌活性。产生的抗体存在着免疫记忆性 。

破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达

目的构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以SalⅠ、HindⅢ切下,分别定向连接到以XhoⅠ、HindⅢ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western blot检测蛋白定位表达情况。结果构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8 kD,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kD的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%、膜蛋白的17.9%;Western blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论成功构建了TETC乳链菌表达载体并在乳链菌内表达TETC,初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定基础。

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白。方法以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a(+)并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达。用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2+-NTA琼脂糖柱分离目的蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性。结果获得1373bp的TTC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a(+)-TTC并在大肠杆菌中表达。TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22%,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5%的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1∶25600。结论所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原。

破伤风毒素及其片段的纯化

本文报道了破伤风毒素及其片段AB、BC、A和C的纯化方法。应用硫酸铵沉淀和Ultrogel AcA_(34)凝胶过滤制备的纯化毒素,于SDS-PAGE和PAGE中均形成单一的蛋白带,分子量为15万,pI为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg。毒素经DTT还原、尿素处理、再用Ultrogel AcA_(44)凝胶过滤制备A和BC片段。A片段的分子量为54000,pI为4.8。BC片段的分子量为98 000,pI为7.2。木瓜酶处理毒素后用高压液相层析制备AB和C片段。纯化的AB片段分子量为98 000,于等电聚焦中为2条主要区带,pI为5.3和5.5,另有数条小区带;纯化的C片段分子量为51000,于PAGE中形成5条蛋白带,于等电聚焦中主要区带的等电点为7.3,另有几条小区带。

体外拼接破伤风毒素C片段基因

目的以破伤风毒素C片段(TETC)基因为例,探讨区段基因拼接方法。方法根据已知的TETC基因序列(GenBank登记号M12739,367-1719),结合乳链菌氨基酸密码子的基因编码情况,设计适于在乳链菌内表达的TETC基因序列,为进一步克隆,根据同义突变的原理消除序列中的EcoRI和KpnI的酶切位点,在TETC基因的5′端加上SalI酶切位点,3′端加上XhoI和HindⅢ酶切位点,序列全长1383bp。将其中1380bp的片段使用DNAstar6.0设计为68条长40bp的寡核苷酸TETC_1-TETC_68,设计TETC_69作为下游引物。分3个区段分别拼接TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,随后分别以TETC_1、TETC_69为上下游引物,进行TETC全长基因的拼接,将获得的TETC基因经SalI和HindⅢ双酶切后连接到经相同双酶切的p BluescriptⅡSK(+),得到的阳性克隆经测序鉴定。结果分别拼接出大小约500bp的TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,等浓度的3个区段混合后,拼接出了全长为1383bpTETC基因,目的基因连接到载体后测序与设计的TETC基因完全一致。结论区段基因拼接法采用分段拼接的方法先拼接出全长基因的组成部分,随后进行全长基因拼接,更适合长基因片段的体外拼接。

SEA为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物初步免疫效果评价

目的对以金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫效果进行初步评价。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-砒啶四氟硼酸(1-cyano-dimethylamino pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)活化法,将SEA、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group A N.meningitidis capsular polysaccharide,GAMP)、C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group C N.meningitidis cap-sular polysaccharide,GCMP)结合制备结合物;将结合物分别免疫BALB/c小鼠,腹部皮下免疫3次,于第1针免后第9天、第19天、第27天眼眶采血,分离血清备用;检测体液免疫及细胞免疫反应水平。结果 SEA与GAMP结合后能增强抗-GAMP Ig G抗体水平,第3次免后GAMP-SEA组多糖抗体水平达到1∶12 800,高于GAMP组1∶400,但GCMP-SEA组结果不理想。SEA与GAMP结合后均能激发细胞免疫反应,IFN-γ和IL-4的SFC与GAMP组比较均升高,且IFN-γ高于IL-4。SEA与GAMP、GCMP结合后Th1/Th2细胞亚群比值分别达到23.48和22.19,高于GAMP组(14.09)和GCMP组(16.73),差异有统计学意义(P<0.05),提示SEA与GAMP、GCMP结合后可激发细胞免疫。结论 SEA与GAMP、GCMP结合后既能增强GAMP、GCMP的免疫原性,提高体液免疫反应,又能激发细胞免疫反应,提示SEA具备作为A/C群脑膜炎奈瑟菌结合疫苗载体蛋白的可行性。