WNT3A结合并稳定FZD2激活Wnt通路促进成骨细胞增殖和分化的分子机制研究

目的:探讨配体WNT3A通过稳定和激活FZD2(Frizzled2)增加成骨细胞骨形成的活性及其分子机制。方法:24只雌性6~8周龄C57BL/6J小鼠随机分为4组,对照(Control)组,假手术(Sham)组,双侧卵巢摘除术(ovariectomy,OVX)诱导骨质疏松症(Osteoporosis,OP)小鼠模型组(OVX组),OVX+雌二醇治疗组(OVX+E2 Treatment组),每组6只小鼠。建立OVX小鼠模型。Western blot法测定小鼠后肢胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2以及磷酸化(p-)STAT3、STAT3、p-JAK2和JAK2的表达水平。CCK-8测定小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的增殖能力。腺病毒-shRNA-FZD2介导敲低MC3T3-E1细胞中的FZD2。免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,co-IP)法测定WNT3A处理MC3T3-E1细胞前后FZD2与泛素(ubiquitin,Ub)的直接结合情况。结果:与OVX组相比,OVX+E2 Treatment组小鼠胫骨组织中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均被上调(P<0.05)。与Control组相比,WNT3A Treatment组MC3T3-E1细胞中FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均升高(P<0.05);细胞增殖能力增强(P<0.05)。与WNT3A Treatment组相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2组FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表达水平均降低(P<0.05);p-STAT3和p-JAK2的磷酸化水平均降低(P<0.05);增殖能力降低(P<0.05);而2组细胞中STAT3和JAK2的表达水平无统计学差异(P>0.05)。在IP:Ub组中,与WNT3A处理(-)的细胞相比,WNT3A处理(+)的细胞中FZD2的表达水平升高(P<0.05)。结论:WNT3A的促骨合成代谢活性是通过结合并稳定FZD2激活Wnt/β-Catenin信号通路实现的。

萸蓉壮骨膏调控EZH2/Wnt3a/β-catenin通路促进绝经后骨质疏松大鼠成骨分化

目的基于EZH2/Wnt3a/β-catenin通路调控成骨分化探讨萸蓉壮骨膏对绝经后骨质疏松大鼠的治疗作用及机制。方法取SD大鼠复制绝经后骨质疏松模型,模型构建成功后随机分为模型组、阿仑膦酸钠片组[6.3 mg/(kg·周)]及萸蓉壮骨膏高[10.8 g/(kg·d)]、中[5.4 g/(kg·d)]、低剂量[2.7 g/(kg·d)]组,另选同龄大鼠作为假手术组。Micro CT检测骨微结构,HE染色观察股骨组织病理形态;IF法检测大鼠股骨组织中成骨相关蛋白(Runx2、OSX、OPG)表达水平。RT-qPCR及Western blot法检测大鼠胫骨组织中EZH2、Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠骨微结构(BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp)显著破坏(P<0.05),骨小梁排列稀疏松散,结构出现不连续间断,脂滴累积较多,骨组织中成骨蛋白表达显著降低(P<0.05),EZH2 mRNA和蛋白表达水平显著升高,Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠骨微结构显著改善(P<0.05),各给药组不同程度改善模型大鼠骨组织病理结构,各给药组大鼠骨组织中成骨蛋白表达不同程度增加(P<0.05),各给药组大鼠骨组织中EZH2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。结论萸蓉壮骨膏能够显著改善绝经后骨质疏松大鼠骨流失,其作用机制与萸蓉壮骨膏调控EZH2/Wnt3a/β-catenin通路促进成骨分化有关。

胚胎期Wnt3a基因特异性敲降对小鼠大脑神经发生的影响

目的 研究胚胎期第13天(E13)特异性敲降Wnt3a基因对小鼠大脑神经发生的影响。方法 利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证Wnt3a在脑皮质神经干细胞中的敲降率。通过子宫内电穿孔实验在E13时将Wnt3a-shRNA质粒电转到胎鼠大脑皮质中,从而下调Wnt3a在脑皮质神经干细胞中的表达。在E16时收取小鼠脑组织,进行免疫荧光染色检测,观察下调Wnt3a后小鼠脑组织中神经元发育进程的改变。结果 RT-qPCR结果显示,神经干细胞中Wnt3a敲降后其mRNA表达水平降低54%,与对照组相比差异具有统计学意义(t=11.260,P<0.001)。免疫荧光染色结果显示,Wnt3a下调导致大脑皮质的皮质板(CP)中的绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞比例降低,大脑中间带(IZ)的GFP阳性细胞比例上升,差异均具有统计学意义(t=4.400、4.482,P<0.01)。结论 E13时特异性下调小鼠脑中Wnt3a基因导致GFP荧光分布异常,神经发生过程受到干扰。

Wnt3a在相关肿瘤中的作用

Wnt信号通路异常与肿瘤的发生、发展密切相关。Wnt3a是经典Wnt信号通路的代表性配体蛋白,在多种肿瘤细胞中异常高表达并发挥原癌基因作用。该文重点从Wnt3a在肝癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌中的表达水平,对肿瘤细胞周期调控,对肿瘤发生、发展过程中细胞增殖、分化和迁移的调控,对肿瘤血管生成和对抗肿瘤药物耐药的调控,以及与结合分子的相互作用进行综述。明确Wnt3a在肿瘤发生、发展过程中发挥的作用和方式,为探寻肿瘤发生、发展的分子机制奠定基础,特别是Wnt3a在肿瘤诊断和Wnt信号通路抑制剂在肿瘤治疗中表现出的潜在价值,可为寻找肿瘤早期诊断和精准治疗的分子靶点提供新的方向和思路。

低氧训练对营养肥胖型大鼠血清外泌体Wnt3a表达的影响

目前,肥胖已被公认为一种全球性流行病,研究发现,训练可通过Wnt/β-catenin信号通路降低肥胖大鼠体质量并改善其脂代谢,且Wnt3a在其中发挥着重要的作用,但影响脂肪组织中Wnt3a表达的机制尚不清楚,研究旨在探讨不同环境下训练后营养肥胖型大鼠血清外泌体Wnt3a的表达变化以完善训练影响脂代谢的理论体系。按照随机分配原则将40只肥胖大鼠分为4组,每组10只:常氧训练组(CE)、常氧安静组(C)、低氧训练组(HE)、低氧安静组(H),进行4周干预训练。测量各组大鼠的体质量、肾周脂肪的质量以及体长;通过血脂生化检测盒来检测大鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、胆固醇(total cholesterol,TC)以及甘油三酯(triglyceride,TG)的水平;分离血清外泌体并进行蛋白质组学分析。结果发现,低氧训练使肥胖大鼠体质量、脂体比、Lee′s指数、TC、TG和LDL-C降低(P<0.05),HDL-C升高(P<0.05);TEM电镜观察结果显示,C组、H组、CE组以及HE组均可以清晰地观察到外泌体胞外囊泡样结构,并在外泌体WB检测中均发现CD9、CD63和TSG101条带,WB检测结果发现,进行单纯低氧或单纯运动Wnt3a蛋白表达情况无显著性变化,低氧环境下Wnt3a蛋白表达水平显著提高。3种干预方式均可改善肥胖大鼠的血脂水平,低氧训练更为显著;低氧训练提升血清外泌体中Wnt3a含量。

基于Wnt3a/β-catenin通路探究下调miR-16对类风湿性关节炎模型大鼠的干预效果

目的 :探究下调miR-16对类风湿性关节炎模型大鼠的干预效果及其作用机制。方法 :将SPF级SD大鼠随机分为对照组、模型组、阴性对照组(NC)和实验组。通过全弗氏佐剂(CFA)与Ⅱ型胶原乙酸溶液注射关节构建模型组、NC组与实验组建立大鼠类风湿关节炎模型,造模后NC组和实验组分别经尾静脉注射5 nmol/L NC-antagomiR和miR-16-antagomiR,对照组和模型组给予等量生理盐水,以足趾肿胀度为模型标准。qPCR检测各组大鼠滑膜组织miR-16表达水平,对大鼠膝关节进行H-E染色分析并进行病理评分,ELISA检测大鼠血清白介素1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素17(IL-17)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,免疫印迹检测大鼠滑膜组织Wnt家庭成员3a(Wnt3a)和β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达水平。结果 :qPCR结果显示,与对照组相比,模型组和NC组miR-16显著上调,实验组显著下调。与对照组相比,模型组、NC组、实验组大鼠足趾肿胀度及病理评分均显著升高;与模型组和NC组相比,实验组足趾肿胀度及病理评分显著降低。ELISA结果显示,与对照组相比,模型组、NC组、实验组血清IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α显著升高;与模型组和NC组相比,实验组显著降低,但仍高于对照组。免疫印迹结果显示,与对照组相比,模型组和NC组Wnt3a及β-catenin显著升高,而实验组显著降低。结论 :下调miR-16可抑制类风湿性关节炎模型大鼠炎症因子释放,降低组织炎性损伤,发挥骨保护作用,其机制可能与Wnt3a/β-catenin信号通路的调控相关。

左归丸通过FNDC5/Wnt3a/β-catenin通路治疗绝经后骨质疏松症的机制研究

目的对左归丸治疗绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的机制进行研究。方法通过体外实验制备左归丸低、中、高剂量对应的含药血清,对培养的MC3T3-E1进行药物干预,分为空白对照组、成骨诱导组(OGI组)、OGI+左归丸低、中、高浓度组;对培养的MC3T3-E1细胞进行FNDC5转染后成骨诱导,分为空白对照组、OGI+转染组、OGI+转染+左归丸低、中、高浓度组。对上述细胞培养液进行ALP活力检测及染色。在体内实验中将野生型小鼠随机分为野生型对照组、野生型卵巢切除(OVX)组、野生型治疗组,将FNDC5基因敲除(KO)小鼠随机分为KO对照组、KO-OVX组、KO治疗组,采用OVX方式造模,给予治疗组小鼠灌胃左归丸12周。12周灌胃结束后检测各组股骨骨密度(bone mineral density,BMD),HE染色股骨切片,ELISA检测血清E2、PINP、Irisin含量,实时荧光定量PCR检测FNDC5、Runx2、OPN、OCN、OSX mRNA表达,Western Blot检测FNDC5、Wnt3a、β-catenin蛋白表达。结果左归丸含药血清增加了MC3T3-E1的ALP表达,FNDC5转染后ALP表达下降;左归丸可以显著改善野生型小鼠OVX术后导致的BMD降低及股骨骨小梁损害,缓解E2、PINP、Irisin表达降低,而对于KO小鼠无显著差异;左归丸抑制了OPN的表达,提高了Runx2、OSX、OCN的mRNA表达。对比KO-OVX组,KO治疗组的OPN、Runx2、OSX、OCN等均没有明显差异。左归丸可以上调Wnt3a和β-catenin的表达,当FNDC5被敲除后这种上调效果被显著抑制。结论左归丸可能通过FNDC5/Wnt3a/β-catenin通路治疗PMOP。

Wnt3a基因多态性与崇仁麻鸡皮肤毛囊性状相关性研究

旨在基于基因多态性分析Wnt家族成员3a(wnt family member 3a,Wnt3a)基因遗传变异位点与崇仁麻鸡皮肤毛囊密度的相关性。本研究随机选取600只在相同环境和相同管理水平下饲养至上市日龄(120 d),健康且状况良好的崇仁麻鸡,其中原种母鸡200只,公鸡100只和B系母鸡200只,公鸡100只。屠宰后选取背部、胸部和大腿部皮肤相同的位置测量毛囊密度,通过皮肤组织切片HE染色的方法观察毛囊的形态结构并测量毛囊直径和皮肤厚度。采血提DNA用PCR扩增后直接测序的方法筛选Wnt3a基因遗传变异位点,并与鸡皮肤毛囊密度进行相关性分析。通过实时荧光定量PCR技术检测Wnt3a基因在不同皮肤部位的表达量。结果表明:1)原种和B系同性别同皮肤部位相比较,原种母鸡背部毛囊密度极显著高于B系(P<0.01),大腿部毛囊密度显著高于B系(P<0.05),背部和大腿部毛囊直径显著低于B系(P<0.05)。原种公鸡背部皮肤毛囊密度极显著高于B系(P<0.01),胸部毛囊密度极显著低于B系(P<0.01),背部和大腿部毛囊直径显著低于B系(P<0.05)。B系公鸡胸部皮肤厚度显著高于原种(P<0.05),B系公、母鸡大腿皮肤厚度均显著高于原种(P<0.05)。2)Wnt3a基因筛选出的3个SNPs位点与各部位皮肤毛囊密度进行相关性分析后发现,g.2555812 T>C和g.2555377 T>C位点的CC基因型个体背部皮肤毛囊密度显著高于其他基因型个体背部(P<0.05)。3)实时荧光定量PCR结果显示,Wnt3a基因在原种和B系鸡的3个皮肤部位的毛囊组织上都有比较高的表达量,且在原种背部的表达量显著高于在B系背部的表达量(P<0.05)。综上所述,崇仁麻鸡原种皮肤毛孔相较于B系更加细密,Wnt3a基因g.2555812 T>C位点的CC基因型和g.2555377 T>C位点的CC基因型是崇仁麻鸡皮肤毛囊的有利基因型,可选作鸡皮肤毛囊密度性状的分子标记。本研究探讨了作为毛囊生长发育的候选基因Wnt3a的遗传效应及SNPs与皮肤毛囊性状的相关性,以期为优质鸡胴体包装性状的分子标记筛选与标记辅助选择提供参考依据。

hUC-MSCs来源外泌体联合肾脑复元汤激活Wnt3a/β-catenin通路减轻NSCs损伤的研究

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)来源的外泌体联合肾脑复元汤减轻氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经干细胞(NSCs)损伤的作用机制。方法:组织块法分离培养SD乳鼠的NSCs;免疫荧光鉴定NSCs标记物Nestin的表达;流式细胞术鉴定hUC-MSCs,分离外泌体,透射电镜观察;采用OGD/R构建NSCs损伤模型;CCK8法、EdU法和流式细胞术用于评估NSCs的增殖和凋亡;qRT-PCR、蛋白质印迹法和免疫细胞化学法分析Wnt3a/β-catenin通路相关基因的表达。结果:本研究成功分离得到并鉴定了NSCs和hUC-MSCs,以及hUC-MSCs来源的外泌体。OGD/R诱导NSCs细胞活力和增殖率下降,促进细胞凋亡,抑制Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1和TCF4基因和蛋白表达。与OGD/R模型组比较,肾脑复元汤、外泌体,以及二者联用显著增加NSCs的细胞活力和增殖率,抑制凋亡,促进Cyclin D1、β-catenin、Wnt3a和TCF4基因和蛋白的表达。结论:hUC-MSCs来源外泌体联合肾脑复元汤通过促进NSCs细胞增殖减轻OGD/R诱导的NSCs细胞损伤,可能与Wnt3a/β-catenin通路活化有关。

miR-497对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的抑制作用及其靶向wnt3a调控机制

目的探讨miR-497对糖尿病小鼠角膜上皮愈合的抑制作用及其可能机制。方法取40只健康清洁级野生型C57BL/J6小鼠, 采用随机数字表法平均分为空白对照组和模型对照组, 另取CRISPR/Cas9介导的miR-497敲除小鼠和miR-497过表达小鼠各20只, 分别作为miR-497敲除组和miR-497过表达组。对模型对照组、miR-497敲除组、miR-497过表达组小鼠连续腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病模型, 空白对照组小鼠注射等量枸橼酸钠缓冲液, 正常饲养8周。糖尿病模型建立成功后通过刮除角膜中央直径2 mm上皮, 进一步构建角膜上皮损伤模型。采用角膜荧光素钠染色观察角膜上皮损伤后0、12、24和36 h各组小鼠角膜上皮缺损面积。采用Western blot法检测各组小鼠角膜组织中wnt3a、β-catenin蛋白表达;采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠角膜组织miR-497以及细胞增生相关基因CyclinD1、c-Myc、Ki-67 mRNA水平表达。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-497与wnt3a的靶向性关系。体外培养人角膜上皮细胞(HCEC), 通过Lipo8000分别转染miR-497 mimics、miR-497 mimics阴性对照、miR-497 inhibitor、miR-497 inhibitor阴性对照, 作为miR-497 mimics组、mimics阴性对照组、miR-497 inhibitor组、inhibitor阴性对照组, 并在含25%葡萄糖的高糖培养基中培养;另取2个组HCEC分别置于含5%及25%葡萄糖的培养基进行培养, 作为正常对照组及高糖组。采用CCK8检测各组细胞增生活力。结果注射STZ后8周, 各糖尿病模型组小鼠血糖浓度明显高于空白对照组, 体质量明显低于空白对照组, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型对照组损伤角膜上皮后12、24和36 h角膜上皮缺损面积百分比明显高于相应时间点空白对照组和miR-497敲除组, 低于miR-497过表达组, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型对照组角膜组织中wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量明显低于空白对照组和miR-497敲除组, 高于miR-497过表达组, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型对照组CyclinD1、c-Myc和Ki-67 mRNA相对表达量均低于miR-497敲除组, 高于miR-497过表达组, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型对照组、miR-497敲除组和miR-497过表达组miR-497相对表达量分别为1.00±0.02、0.63±0.06和1.48±0.03, 总体比较差异均有统计学意义(F=19.62, P<0.01)。野生型Wnt3a转染细胞中miR-497-5p mimics组荧光素酶活性低于miR-497-5p阴性对照组和空载体组, 差异均有统计学意义(均P<0.05);突变型wnt3a转染细胞中, 各组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(F=0.73, P=0.59)。高糖组细胞增生A值为0.59±0.03, 明显低于正常对照组的0.59±0.03和miR-497 inhibitor组的0.88±0.08, 明显高于miR-497 mimics组的0.48±0.11, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论沉默miR-497表达可能通过靶向激活wnt/β-catenin通路促进糖尿病小鼠角膜上皮缺损修复。

蛇床子素对髓核致神经根炎性痛大鼠脊髓背角Wnt3a/β-catenin信号通路的影响

【目的】探讨蛇床子素对髓核致神经根炎性痛大鼠的治疗作用及机制。【方法】将54只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和治疗组,每组18只。模型组和治疗组大鼠构建神经根炎性痛模型,假手术组进行假手术处理。术后2 d,治疗组大鼠经硬膜外注射50μL蛇床子素20 g·L-1,假手术组和模型组大鼠经硬膜外注射相同体积二甲基亚砜(DMSO)。术前3、1 d及术后1、3、7、10、14 d测量大鼠50%机械性撤足阈值(MWT)及热伤害性撤足潜伏期(TWL)。于术后7 d,采用定量聚合酶链反应(Q-PCR)检测术侧脊髓背角Wnt3a、β-catenin mRNA表达水平,采用Western Blot法和免疫荧光染色法分别检测术侧脊髓背角Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测术侧脊髓背角白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。【结果】模型组术后各时间点50%MWT及TWL较假手术组降低(P<0.05或P<0.01),术后7 d术侧脊髓背角Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平及IL-18、TNF-α水平均较假手术组升高(均P<0.01);与模型组比较,治疗组术后3 d出现50%MWT及TWL明显升高(P<0.05或P<0.01),术后7 d术侧脊髓背角Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达水平及IL-18、TNF-α水平均降低(P<0.05)。【结论】蛇床子素可有效减轻髓核致炎大鼠神经根痛,其抗炎镇痛机制可能与抑制脊髓背角Wnt3a/β-catenin信号通路,下调IL-18和TNF-α的表达有关。

miR-27b-3p通过靶向Wnt3a调控Wnt/β-Catenin信号通路抑制肝星状细胞活化

目的探讨miR-27b-3p对肝星状细胞(HSC)活化的影响及其作用机制。方法取生长良好的LX-2细胞,利用10 ng/ml TGF-β1处理24 h以诱导其活化,并命名为LX-2-A细胞,免疫荧光法观察细胞中α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达,qRT-聚合酶链反应(PCR)检测细胞中miR-27b-3p表达;利用LipofectamineTM2000转染试剂盒对LX-2-A细胞进行转染,并分为7组:空白组(正常培养的LX-2-A细胞)、mimics NC组(转染mimics NC)、miR-27b-3p mimics组(转染miR-27b-3p mim-ics)、si-NC组(转染si-NC)、si-Wnt3a组(si-Wnt3a)、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1组(共转染miR-27b-3p mimics和pcDNA3.1)、miR-27b-3p mimics+Wnt3a组(共转染miR-27b-3p mimics和pcDNA3.1-Wnt3a),qRT-PCR检测细胞中miR-27b-3p表达;细胞对数试剂盒(CCK)-8法检测各组细胞增殖;免疫荧光染色法观察各组细胞中α-SMA表达;Western印迹检测各组细胞中Wnt3a、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅲ、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1及Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-连环蛋白(catenin)、c-myc、细胞周期素(Cyclin)D1表达;荧光素酶报告基因实验检测miR-27b-3p与Wnt3a靶向关系。结果与LX-2细胞比较,LX-2-A细胞绿色荧光强度显著升高,表示α-SMA蛋白表达水平升高,提示TGF-β1诱导LX-2细胞活化成功;与LX-2细胞比较,LX-2-A细胞中miR-27b-3p表达水平显著降低(P<0.05);与空白组、mimics NC组比较,miR-27b-3p mimics组LX-2-A细胞中miR-27b-3p表达水平显著升高,吸光度OD值(24、48 h)、绿色荧光强度、Wnt3a、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1、β-catenin、c-myc、CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与空白组、si-NC组比较,si-Wnt3a组LX-2-A细胞中miR-27b-3p表达水平无显著变化(P>0.05),OD值(24、48 h)、绿色荧光强度、Wnt3a、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1、β-catenin、c-myc、CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与miR-27b-3p mimics组、miR-27b-3p mimics+pcDNA3.1组比较,miR-27b-3p mimics+Wnt3a组LX-2-A细胞中miR-27b-3p表达水平无显著变化(P>0.05),OD值(24、48 h)、绿色荧光强度、Wnt3a、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1、β-catenin、c-myc、CyclinD1蛋白表达水平显著升高(P<0.05);miR-27b-3p靶向调控Wnt3a的表达。结论过表达miR-27b-3p通过靶向下调Wnt3a表达,抑制Wnt/β-catenin通路激活,进而抑制LX-2-A细胞活化。

Effects of Wumen Gumi Bao Decoction on Ameliorating Bone Loss in Experimentally Induced Osteoporosis in Rats by Regulating Wnt3a/β-Catenin Pathway

[Objectives]To investigate the preventive effects of Wumen Gumi Bao Decoction(WMGBD)on estrogen deficiency-induced bone loss.[Methods]Three-month-old Sprague-Dawley rats were ovariectomized(OVX)and then treated with WMGBD,and their admixtures for six weeks.The bone trabecular microstructure,bone histopathological examination were determined in the rat femur tissue,and serum biomarkers of bone formation and resorption were analyzed by ELISA,and the protein expressions of Wnt3a,β-catenin,and phosphorylatedβ-catenin(p-β-catenin)were analyzed by Western blot.Statistical analysis was conducted by using one-way analysis of variance(ANOVA)followed by LSD post hoc analysis or independent samples t test using the scientific statistic software SPSS version 20.0.[Results]WMGBD could promote osteosis and ameliorate bone loss to improve the repair of cracked bone trabeculae of OVX rats.Furthermore,WMGBD also could prevent OVX-induced decrease in collagen fibers in the femoral tissue of ovariectomized rats and promote the regeneration of new bone or cartilage tissue,while WMGBD could activate the Wnt3a/β-catenin pathway.[Conclusions]WMGBD could ameliorate estrogen deficiency-induced bone loss via the regulation of Wnt3a/β-catenin pathway.

Wnt3a在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位

本研究旨在探索Wnt3a在羊驼皮肤中的表达与定位。以不同毛色的成年羊驼为研究对象,应用荧光定量PCR技术分析不同毛色羊驼皮肤Wnt3a基因的相对表达量,并运用Western blotting及免疫组织化学法对Wnt3a蛋白在不同毛色羊驼皮肤中进行表达和定位研究。结果:荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中Wnt3amRNA相对表达量是白色羊驼的2.970 2倍;Western blotting结果表明,羊驼皮肤组织组蛋白提取物中存在相对分子质量约39ku的产物,棕色羊驼皮肤平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示Wnt3a在羊驼皮肤毛囊的根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出Wnt3a在棕色和白色羊驼毛囊中的表达差异显著(P<0.05)。通过以上研究显示Wnt3a可能与羊驼毛色形成具有相关性。

小鼠缺血再灌注损伤后海马齿状回Wnt1、Wnt3a的表达变化

目的探讨Wnt/β-catenin相关因子在缺血再灌注小鼠海马中的表达变化。方法将80只1月龄健康雄性昆明小鼠随机分为正常组、假手术组、缺血再灌注1、3、7、14、21、28 d组,通过夹闭小鼠双侧颈总动脉0.5 h再通的方法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型,采用腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核甘(BrdU)检测海马齿状回区神经干细胞(NSCs)增殖规律及通过原位杂交法和免疫组织化学染色方法检测Wnt/β-catenin信号通路重要信号分子Wnt1、Wnt3a的表达变化。结果 BrdU检测显示正常组和假手术组小鼠海马齿状回区可见少量BrdU阳性细胞,缺血再灌注后3 d BrdU阳性细胞开始增高(P<0.01),缺血再灌注后7 d达高峰(P<0.01),随着灌注时间的延长呈下降趋势,缺血再灌注后28 d,BrdU阳性细胞数降至正常水平(P>0.05)。原位杂交法结果显示正常组、假手术组海马齿状回颗粒细胞下层均无明显Wnt1、Wnt3a阳性表达。缺血再灌注各组均可见Wnt1、Wnt3a阳性细胞,再灌注后1 d表达开始增加,14 d达高峰,28 d减少至正常水平。与正常组和假手术组比较,缺血再灌注各组Wnt1、Wnt3a阳性细胞数明显增多(P<0.05)。结论小鼠脑缺血再灌注损伤可激发内源性NSCs的增殖。当Wnt/β-catenin途径被激活时,Wnt1、Wnt3a在海马齿状回颗粒细胞下层的表达,为进一步研究Wnt信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制奠定了基础。

胃炎I号对胃癌前病变大鼠Wnt信号通路Wnt1,Wnt3a,CyclinD1表达的影响

目的探讨健脾化瘀解毒复方胃炎I号对胃癌前病变(GPL)的疗效及其分子学机制。方法将SD大鼠随机分为空白对照组,模型组,维酶素组(0.2 g·kg-1),胃炎I号组(7.5 g·kg-1)。采用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)水溶液自由饮用、饥饱失常、耗气泻下法复制GPL大鼠模型。观察胃炎I号连续治疗10周后对GPL大鼠Wnt信号通路Wnt1、Wnt3a、细胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)表达的影响。结果模型组大鼠胃黏膜上皮的Wnt1、Wnt3a、Cyclin D1表达评分均较空白对照组显著增加(P<0.05,P<0.01);胃炎I号能显著拮抗模型组出现的上述变化(P<0.01)。结论胃炎I号能下调Wnt信号通路Wnt1,Wnt3a,Cyclin D1的表达,抑制Wnt/茁-catenin信号通路的异常激活,能在一定程度上阻断和逆转胃黏膜恶性转变。

Wnt3a/β-catenin信号通路诱导人关节软骨间充质祖细胞增殖能力和向软骨分化的能力

目的研究Wnt3a/β-catenin信号通路对人关节软骨间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells,MPCs)老化的影响。方法 RT-PCR和Western blot检测正常人(对照组)和原发性骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者(OA组)MPCs中Wnt3a/β-catenin的表达。Western blot检测β-catenin在Wnt3a/β-catenin信号激活与阻断后细胞中的积累,MTT检测细胞的增殖情况,RT-PCR检测细胞向软骨细胞诱导后的分化情况。结果 OA组MPCs中Wnt3a和β-catenin蛋白表达明显高于对照组;在Wnt3a/β-catenin信号通路激活的对照组MPCs中β-catenin积累增加,阻断后β-catenin积累降低;Wnt3a/β-catenin信号通路激活的对照组MPCs增殖能力降低,阻断后增殖能力提高;Wnt3a/β-catenin信号通路激活的对照组MPCs向软骨细胞诱导分化后较对照组MPCs中Ⅱ型胶原、aggrecan、SOX9表达降低(P<0.01);Wnt3a/β-catenin信号通路激活的同时加入阻断剂,Ⅱ型胶原、aggrecan、SOX9表达有明显恢复(P<0.05);Wnt3a/β-catenin信号通路阻断组细胞与对照组MPCs组相比没有差异。结论 Wnt3a/β-catenin信号通路激活促进了MPCs老化,Wnt3a/β-catenin信号通路阻断能够抑制MPCs老化,Wnt3a/β-catenin在OA中可能发挥了重要作用。

EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移

EBP50通过抑制LIMK/cofilin信号通路和PI3K/Akt/m TOR/MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。然而,EBP50是否可以通过其他机制抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移尚未可知。本研究发现,EBP50能通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响乳腺癌细胞的侵袭和转移。Western印迹结果显示,EBP50在低转移细胞株MCF-7和正常乳腺细胞株MCF-10A中高表达,而在高转移细胞株MDA-MB-231低表达。采用RNAi技术将小RNA质粒瞬时转染乳腺癌细胞株MCF-7,同时将质粒pc DNA3.1-EBP50转入乳腺癌细胞株MDA-MB-231。Western印迹结果显示,Si EBP50/MCF-7细胞组的EBP50表达水平明显下调,MDA231/EBP50细胞组的EBP50表达水平明显上调。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示,用Wnt3a刺激后,Si EBP50/MCF-7细胞组体外迁移和侵袭能力明显增强,MDA231/EBP50细胞组体外迁移和侵袭能力明显减弱。Western印迹结果显示,与未用Wnt3a或同时用Wnt3a和抑制剂Dkk1刺激的相比,Si EBP50/MCF-7细胞组上皮-钙粘蛋白(Ecadherin)下调,波形蛋白(vimentin)上调,细胞核中β-联蛋白(β-catenin)的表达水平升高,而MDA231/EBP50细胞组上皮-钙粘蛋白上调,波形蛋白下调,细胞核中β-联蛋白表达下降。上述结果表明,EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响β-联蛋白的转核,抑制EMT的发生,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化:Wnt3a信号分子的诱导作用

背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控。目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道。目的:寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞。采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案,通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用,以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照。结果与结论:间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,形态均一,呈长梭形,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性,胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好;Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达,神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显;胶质纤维酸性蛋白在诱导10d后有比较弱的扩增条带出现。结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。

Wnt3a转基因基质细胞的建立及其对脐血CD34^+造血干/祖细胞扩增作用的研究

Wnt信号通路在造血干/祖细胞自我更新的过程中发挥至关重要的作用.纯化的Wnt3a蛋白可以实现造血干/祖细胞的扩增.通过病毒转染原代小鼠骨髓基质细胞,建立转基因滋养层细胞.通过共培养对转基因滋养层细胞扩增CD34+造血干/祖细胞的作用进行了研究.实验结果显示,与普通滋养层加细胞因子组相比,经转基因滋养层加细胞因子组培养的CD34+造血干/祖细胞集落形成能力(CFC)是其(1.55±0.06)倍;混合集落形成能力是其(1.95±0.26)倍;高增殖潜能集落形成能力(HPP-CFC)是其(1.45±0.40)倍;LTC-IC活性是其(3.83±0.86)倍.结果表明,转基因滋养层细胞通过分泌具有天然活性的Wnt3a蛋白能在体外有效地扩增造血干/祖细胞的数量.