抗体偶联药物抗HER2单抗-MCC-DM1细胞毒活性检测方法的建立及其检测效果评价

目的:建立抗体偶联药物(antibody-drug-conjugate,ADC)抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)人源化单抗-MCC-DM1的细胞毒活性检测方法,并评价该药抗体偶联前后药物细胞毒活性的变化。方法:供试品为抗HER2-MCC-DM1原液及成品各3批,以抗HER2人源化单抗和抗HER2单抗-MCC-DM1标准品为参考品,利用CCK-8法、双荧光染色实验分别检测供试品和参考品对人乳腺癌BT-474细胞增殖的抑制作用,计算供试品相对百分效价,并比较抗体偶联前后该药细胞毒活性的改变;光学显微镜和荧光显微镜观察抗体偶联前后对BT-474细胞生存的影响。结果:抗HER2-MCC-DM1供试品及参考品在肿瘤细胞增殖抑制实验中均存在量效关系。3批原液和3批成品各经3次测定,对B7-474细胞增殖抑制活性的相对百分效价平均值在(92.50±8.80)%^(115.14±6.09)%,变异系数均小于15%。与抗HER2单抗原液相比,对应批次的抗HER2-MCC-DM1原液和成品各经3次测定,细胞增殖抑制活性平均值分别为偶联修饰前抗体活性的(326.72±21.58)%和(315.76±34.90)%。与偶联前抗体组相比,抗体偶联药物组细胞固缩和死亡明显增多。结论:所建立的体外细胞增殖抑制法可用于抗体偶联药物抗HER2-MCC-DM1的细胞毒活性检测,其重复性好、准确性高,可应用于ADC药物的质量控制及有效性评价。

抗体偶联药物抗HER2单抗-MCC-DM1质控方法的建立

目的:建立抗体偶联药物(ADC)抗人表皮生长因子受体-2(HER2)单抗-马来酰亚胺基-环己烷-1-羧化物(MCC)-美登素衍生物(DM1)(trastuzumab-DM1,T-DM1)的质控方法。方法:利用人乳腺癌BT-474细胞增殖抑制实验测定T-DM1的生物学活性;利用生物分子间相互作用分析核心技术(biomolecular interaction analysis core-technology,BIAcore)测定其结合常数(KD);利用HER2抗原和抗DM1抗体双夹心酶联免疫法(ELISA)对T-DM1进行鉴别;利用液质联用法和紫外分光光度法测定药物抗体偶联比(DAR);利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定游离药物DM1的含量;利用十二烷基磺酸钠-毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)和分子排阻色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;利用成像毛细管等点聚焦电泳(i CIEF)分析电荷异质性,其他各项指标均符合现行版中国药典的要求及其他相关要求。结果:T-DM1生物学活性相对效价为(94.04±2.60)%,KD为(1.03±0.02)E-9 mol·L-1,RSD均小于5%;ELISA鉴别为阳性;液质联用法和紫外分光光度法测得的DAR分别为3.21及3.25;RP-HPLC法测定游离药物DM1的含量为(0.822 2±0.050 5)%,RSD小于10%;非还原CE-SDS主峰面积为(96.63±0.07)%,RSD为0.07%;SE-HPLC主峰面积为(97.65±0.005 8)%,RSD为0.005 8%;i CIEF分析可以将每个偶联数的抗体药物分开,达到很好的鉴别。结论:建立ADC中T-DM1质控方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国ADC的质量检测提供了参考依据。