基于铁死亡调节探讨秦皮素对动脉粥样硬化的作用及机制研究

目的:基于秦皮素对铁死亡的调节作用,进一步探讨秦皮素对动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法:通过高脂饮食构建Apo E敲除(Apo E^(-/-))小鼠动脉粥样硬化模型,随机分为正常饮食组(NC组)、高脂饮食组(HFD组)、铁死亡抑制剂组(Fer-1组)、秦皮素组(Fra组)和萝卜硫素组(Sul组);用过氧化氢(H_(2)O_(2))干预人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)构建体外AS模型,随机分为NC组、H_(2)O_(2)组、Fer-1组、Fra组和Sul组。油红O染色用于评估AS病变大小,血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和总胆固醇(TC)测定试剂盒用于评估脂质代谢。细胞计数实验(CCK-8)用于检测秦皮素毒性作用和细胞增殖能力,铁、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)试剂盒用于测定小鼠主动脉组织和HUVECs中铁死亡水平。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)和蛋白免疫印迹(western blotting)实验主要通过检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和血红素加氧酶1(HMOX1)表达水平以评估秦皮素的抗铁死亡作用。结果:秦皮素能够减轻AS小鼠血清脂质沉积和主动脉粥样硬化,并且保护HUVECs免受H_(2)O_(2)诱导的细胞死亡。与Fer-1组结果一致,秦皮素在体内和体外均能抑制促铁死亡生物标志物铁和MDA表达水平,上调抗铁死亡生物标志物GSH和GPX4表达水平。此外,秦皮素减轻了H_(2)O_(2)诱导的HUVECs发生铁死亡,而这种保护作用能被HMOX1特异性激活剂萝卜硫素所逆转。结论:秦皮素可能通过下调HMOX1抑制铁死亡,从而减轻AS。

转录组测序筛选大鼠滑膜炎差异表达基因及秦皮素治疗靶点的体外验证

目的基于转录组测序分析碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)诱导的膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)大鼠相比于正常组大鼠滑膜组织中的表达差异基因,并初步筛选出秦皮素(fraxetin)治疗滑膜炎的靶点。方法将SD大鼠分为KOA模型组和对照组,采用MIA膝关节注射法制备大鼠右膝KOA模型。造模4周后,取各组大鼠右膝滑膜组织进行转录组测序,获得了KOA模型组与对照组大鼠滑膜组织中mRNA差异表达情况,然后进行差异基因表达分析、GO富集分析、KEGG功能富集分析和PPI蛋白网络互作分析。同时将巨噬细胞Raw264.7分为对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预组和LPS+60μmol/L秦皮素联合干预组,并采用实时荧光定量PCR法对转录组测序后的差异基因分析结果进行验证。结果转录组测序后的差异基因表达分析显示,KOA模型组与对照组相比,共有1730个上调基因和1546个下调基因,其中显著上调的基因有mmp12、Acod1、Acan、Col2a1和Atp6v0d2等[|log2(FoldChange)|≥1,校正后P<0.01]。KEGG聚类分析和GO聚类分析显示,差异基因主要参与调节炎症及免疫代谢过程,例如三羧酸循环、线粒体功能。LPS干预后的Raw264.7细胞中Acod1与Atp6v0d2显著高表达(P<0.0001),而且相较于LPS干预组,LPS+秦皮素联合干预后的Raw264.7细胞中Atp6v0d2表达水平显著降低(P<0.001)。结论MIA诱导KOA建模后,大鼠膝关节滑膜组织中介导炎症及免疫代谢的巨噬细胞相关基因mmp12、Acod1和Atp6v0D2等高表达,提示KOA的发生、发展过程中可能存在着由滑膜巨噬细胞介导的免疫代谢改变。LPS干预后巨噬细胞Raw264.7中Acod1和Atp6v0d2表达增高可初步证实这一结果。其中Atp6v0D2可能是秦皮素治疗滑膜炎的一个潜在靶点,这为KOA治疗提供了新的思路。

秦皮素与人血清白蛋白相互作用研究

目的:采用荧光光谱法分析秦皮素与人血清白蛋白(HSA)的相互作用及分子结构特征。方法:应用荧光分光光度计,通过荧光淬灭分析、同步荧光分析、三维荧光分析、疏水探针分析,获得秦皮素与HSA相互作用的光谱学信息。结果:荧光淬灭分析结果显示,秦皮素通过结合HSA引起HSA荧光淬灭,荧光猝灭机制属于单一静态猝灭;计算得出的热力学参数熵变和焓变均为正值,表明疏水力是驱动秦皮素结合HSA的主要作用力。同步荧光分析表明,秦皮素对HSA分子中Trp残基微环境影响明显,可使其特征光谱峰发生蓝移,再次表明疏水力在秦皮素结合HSA中起到重要作用。三维荧光分析结果表明,秦皮素与HSA相互作用改变了HSA的空间结构、氨基酸残基的微环境以及荧光发射峰强度;疏水探针分析结果显示,疏水探针能够显著影响秦皮素与HSA的结合,进一步验证了疏水力是秦皮素结合HSA的主要作用力。结论:秦皮素能够与HSA相互作用结合,导致HSA分子结构及光谱特性发生改变。

秦皮的药理作用研究进展

秦皮(Cortex Fraxini)为常用中药,种类繁多,资源丰富,价格低廉,具有多种药理活性,且临床应用范围广,是极其重要并有很大开发利用价值的道地中药材。现代药理研究表明,秦皮具有抗病原微生物作用、抗炎镇痛作用、抗肿瘤作用、抗氧化作用以及神经保护和血管保护等作用。临床上秦皮主要用于治疗多种炎症、细菌性痢疾等疾病,并可用于清热解湿、止咳平喘。作者对秦皮的药理作用及其临床应用的国内外最新研究现状作一综述,为我国道地药材秦皮的新药开发研究提供参考。

HPLC法测定秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素的含量

采用高效液相色谱法测定中药秦皮中泰皮甲素、秦皮乙素的含量．固定相为十八烷基硅烷健合硅胶柱，流动相为甲醇—水（24：76），检测波长348nm．浓度在16μg／ml～176μg／ml范围内线性关系良好，相关系数分别为0．9995，0．9994，加样回收率秦皮甲素99．1±1．5％（n=5），秦皮乙素99．8±2．5％（n=5）。本方法日内精密度和日间精密度分别为0．8％和6．2％．该方法简便、快速、准确。

HPLC法测定秦皮4种有效成分的含量

目的采用高效液相色谱法建立秦皮药材中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的含量测定方法,为建立秦皮饮片质量评价体系提供含量测定方法学依据。方法制备秦皮供试品溶液,采用Inertsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以0.1%甲酸水为流动相A,甲醇为流动相B,进行梯度洗脱。检测波长:254 nm测定秦皮甲素、秦皮苷和秦皮乙素,340 nm测定秦皮素。进样量:10μL,柱温:30℃,流速:0.8 mL·min^-1,依次进样分析。结果秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素质量浓度分别在78.60~1572、23.90~487.0、6.900~138.5、1.240~24.80 mg·L^-1内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数分别为0.9996、0.9996、0.9995、0.9996;秦皮供试品中,四者的平均回收率分别为98.1%、98.9%、98.1%和98.5%;RSD分别为1.5%、1.6%、1.2%和0.90%(n=6)。结论建立的方法适用于研究秦皮药材中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素的含量测定。

秦皮素抑菌活性及其机制研究

目的以金黄色葡萄球菌为供试菌株来研究秦皮素对其的抑制活性及其机制。方法利用牛津杯法、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、生长曲线的测定、细胞膜渗透性测定、SDS-PAGE蛋白谱变化方法等对秦皮素的抑菌活性及其机制进行研究。结果秦皮素能够影响金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性,秦皮素作用20 h,菌体可溶性蛋白总量减少55.74%。结论秦皮素对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用,其抑菌机制可能是通过抑制蛋白质的合成来实现的。

白头翁汤中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素和秦皮苷同时检测高效液相色谱法的建立及各药味对其溶出的影响

为了考察白头翁汤中其他药味对秦皮主要有效成分溶出的影响,试验采用高效液相色谱法（HPLC）[Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱,以乙腈（A溶液）-0.1%磷酸（含0.2%三乙胺,B溶液）为流动相进行梯度洗脱,0-23 min,流动相中A溶液含量由10%逐渐升为20%,流速0.8 mL/min,检测波长345 nm,柱温30℃,进样量10μL]检测白头翁汤及相关组方中的秦皮素、秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素。结果表明：秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素浓度分别在0.090-22.500,0.120-29.800,0.110-27.100,0.076-19.000μg/mL内,线性关系良好;仪器精密度、方法的重复性、稳定性、加样回收试验的相对标准偏差（RSD）均在2.0%以内;秦皮素溶出率受其他物质影响不大;黄柏和白头翁汤醇提液能明显增大秦皮乙素的溶出;白头翁汤中秦皮苷溶出率都低于秦皮药材;秦皮甲素的溶出规律与秦皮苷非常相似。说明该方法准确灵敏,可用于白头翁汤等相关中药组方中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素的含量测定;白头翁汤中的黄连、黄柏、白头翁对秦皮中秦皮素、秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素的溶出都有影响。

RP-HPLC法测定细叶杜香叶中4种活性成分的质量分数

为了建立测定细叶杜香叶中秦皮乙素、秦皮素、金丝桃苷和槲皮素质量分数的方法,采用反相高效液相色谱法(色谱条件:色谱柱为Inertsil ODS-SP(5μm4,.6mm×250mm,柱号:9KI92609)、流动相为V(甲醇)∶V(0.2%醋酸)=43∶57、流速1.0 mL.min-1、检测波长350 nm),测得秦皮乙素、秦皮素、金丝桃苷和槲皮素4种成分的平均加样回收率分别为99.71%9、8.62%1、00.13%9、8.33%,其相对标准偏差RSD分别为1.45%1、.53%、1.04%1、.69%。结果表明:反相高效液相色谱法操作简便、准确,具有良好的重复性,可用于细叶杜香中此4种成分的质量分数的测定。

秦皮素抑制NF-κB/COX-2信号通路改善PC12细胞损伤

目的研究秦皮素(fraxetin)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12细胞)损伤的作用并考察炎症反应中相关蛋白的变化。方法采用MTT法研究秦皮素对PC12细胞活力的作用,筛选合适给药浓度。试验共分为3组即对照组(Control组)、LPS模型组和秦皮素保护组(fraxetin+LPS组)。采用四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞活性变化;采用倒置显微镜和4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI)荧光核染色法观察细胞形态学变化;采用real-time PCR法检测细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA水平;采用western blot法检测COX-2和NF-κB-p65蛋白表达水平。结果与模型组比较秦皮素保护组细胞存活率显著升高(P<0.01)。LPS模型组炎症因子IL-1、IL-6和TNF-αmRNA水平,NF-κB-p65和COX-2蛋白表达水平相对于对照组均明显升高(P<0.01)。与此同时秦皮素治疗组其炎症细胞因子mRNA水平,NF-κB和COX-2蛋白的表达水平均显著下调。结论秦皮素对LPS所致PC12细胞损伤有保护作用,其效应可能与抑制NF-κB/COX-2信号通路,降低炎症反应有关。

树龄对秦岭白蜡树树皮中秦皮甲素、秦皮乙素与秦皮素含量的影响

目的考察树龄对秦岭白蜡树树皮中秦皮甲素、秦皮乙素与秦皮素含量的影响。方法采用HPLC法,以Hypersil GOLD C_(18)柱为固定相,甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长340 nm,流速1 m L·min^(-1)。结果 6年生的秦岭白蜡树树皮中秦皮甲素、秦皮乙素的含量最高,其次是5年和4年生的秦岭白蜡树树皮,3年生秦岭白蜡树树皮中上述2种成分的含量最低;而秦皮素含量则相反,最高的是3年生秦岭白蜡树,5年生和6年生的秦岭白蜡树树皮中的含量则较低。结论秦岭白蜡树树皮中秦皮甲素、秦皮乙素含量随着树龄增加呈升高趋势,而秦皮素含量则相反,随着树龄增加呈降低趋势。

高效液相色谱法测定秦皮滴眼液中秦皮甲素的含量

运用反相ＨＰＬＣ法测定秦皮滴眼液中有效成分秦皮甲素的含量，方法的相关系数ｒ＝０．９９９６，回收率为９９．４１％，精密度ＲＳＤ＝１．５４％。色谱柱为进口ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋＲＰＰ１００，２５０×４．６ｍｍ，ＩＤ５μ；Ｃ１８，流动相为甲醇１％乙酸水溶液（２５∶７５）；流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长３４８ｎｍ，外标峰面积法测定。本法具有简便、快速、准确等特点，适用于医院常规分析。

秦皮素对苯肾上腺素诱导的大鼠心肌细胞肥大的影响

目的观察秦皮素对苯肾上腺素诱导的原代SD乳鼠心肌细胞肥大的影响。方法建立苯肾上腺素诱导的SD乳鼠原代心肌细胞肥大模型,观察秦皮素对心肌细胞肥大的影响;图像分析法计算心肌细胞面积;[3 H]-亮氨酸掺入法测试心肌细胞蛋白质合成速率;实时定量荧光PCR法检测心肌细胞Nrf2和肥大分子标志物心房钠尿肽、心房利尿肽的mRNA表达水平。结果(1)80μmol/L苯肾上腺素刺激心肌细胞48h能成功复制SD乳鼠心肌细胞肥大模型并伴随Nrf2表达量的增加;(2)秦皮素呈剂量依赖性地抑制苯肾上腺素刺激的SD乳鼠心肌细胞面积的增大、蛋白质合成速率的增加和肥大分子标志物的上调。结论秦皮素能显著抑制PE诱导的原代大鼠心肌细胞肥大。

秦皮素与芦丁紫外吸收特性比较分析

从中药槐米及秦皮中分别提取、分离和制备芦丁及秦皮素，并进行紫外吸收特性测定和比较分析。

秦皮素的抑菌作用及其对嗜水气单胞菌毒力的影响

为探讨中草药单体秦皮素对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生长和毒力的影响,实验测定了秦皮素对嗜水气单胞菌最低抑菌浓度(MIC)、生长曲线、生物膜以及脂肪酶活性、运动性、蛋白酶活性和溶血性等毒力相关因子的影响。结果表明,秦皮素对嗜水气单胞菌具有明显的抑制效果,MIC为128μg/mL;秦皮素浓度大于16μg/mL时,对嗜水气单胞菌的生物膜形成有显著促进作用(P<0.05);秦皮素浓度大于8μg/mL时,对嗜水气单胞菌的脂肪酶活性有显著降低作用(P<0.05);秦皮素浓度为2~8μg/mL时,对嗜水气单胞菌的运动性和溶血性无显著影响(P>0.05),但能降低嗜水气单胞菌蛋白酶活性(P<0.05)。秦皮素对嗜水气单胞菌有一定的抑菌作用,但期望通过低浓度秦皮素实现对嗜水气单胞菌的防治仍有待进一步研究。

秦皮素通过调节JAK1/STAT3信号通路抑制肝纤维化

目的探讨秦皮素对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的防治作用及其机制。方法将48只成年雄性SD大鼠随机均分为4组,即正常对照组、模型组、秦皮素低剂量组和秦皮素高剂量组。除正常对照组外,其余3组大鼠给予50%CCl4花生油混合液(2 mL·kg-1)灌胃,每周2次,建立肝纤维化模型,持续8周。给药组造模的同时每日给予秦皮素干预,剂量分别为25 mg·kg-1和50 mg·kg-1。正常对照组给予等量的生理盐水。8周后处死各组大鼠,称量体重和肝重;全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL);放射性免疫法测定血清透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)和Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)。HE和Masson染色考察肝组织病理学改变,免疫组织化学染色检测肝组织α-SMA的表达;Western blot检测肝脏组织中α-SMA和JAK1/STAT3信号通路关键蛋白的表达水平;Q-PCR检测肝窦毛细血管化调控因子(VEGF、β-FGF和PD-ECGF)基因的表达水平。结果与模型组相比,秦皮素给药组中肝纤维化大鼠肝功能指标(ALT、AST、TBIL)和纤维化指标(HA、LN、CⅣ、PⅢNP)血清水平明显减低。HE和Masson染色结果显示秦皮素能显著改善肝纤维化大鼠肝脏组织病理学结构和胶原沉积程度。与此同时,秦皮素能够抑制肝星状细胞激活标志物(α-SMA)以及肝窦毛细血管化调控因子(VEGF、β-FGF、PD-ECGF)的表达。与模型组相比,秦皮素给药组大鼠肝脏中p-JAk1和p-STAT3蛋白的表达水平显著降低。结论秦皮素可改善大鼠肝纤维化,其机制可能与抑制JAK1/STAT3信号通路有关。

秦皮素通过抑制EGFR及其下游AKT信号通路抑制MCF-7细胞增殖及迁移

表皮生长因子受体(EGFR)是细胞内多种信号调节通路的交汇点,其介导的信号通路与乳腺癌的发生、发展、转移和侵袭等密切相关,已成为乳腺癌治疗的新靶点之一。但目前关于秦皮素的抗乳腺癌作用与EGFR通路的关系,国内外尚未见相关报道。本研究结果表明,秦皮素能够通过抑制EGFR及其下游的AKT信号通路来发挥其抗乳腺癌作用。秦皮素在体外可促进T、B淋巴细胞增殖及巨噬细胞吞噬能力,提示秦皮素可能促进小鼠免疫功能。Western印迹结果表明,秦皮素能显著抑制EGFR蛋白及其下游的AKT蛋白磷酸化水平。划痕实验结果表明,秦皮素能抑制MCF-7细胞的迁移。此外,秦皮素还能促进小鼠巨噬细胞的吞噬能力和代谢活力,促进T、B淋巴细胞的增殖,提高NK细胞的杀伤活力。本研究结果提示,秦皮素的抗乳腺癌作用是通过抑制EGFR信号通路,抑制MCF-7细胞迁移和促进小鼠的免疫功能等多种途径来实现的。

秦皮薄层鉴别方法的改进

目的:对秦皮薄层鉴别的展开系统进行改进。方法:改进了原标准的展开系统,采用硅胶G板,以二氯甲烷-甲醇-甲酸(7∶0.5∶0.5)为展开剂,置紫外光灯(365 nm)下检视秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素。结果:在供试品色谱中,秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素斑点清晰,分离度好,重现性好。结论:该方法的展开系统减少了对环境的污染和对人体的伤害,可替代原标准用于秦皮的鉴别。

HPLC测定秦皮胶囊的主要成分

目的建立同时测定秦皮胶囊中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮亭含量的方法.方法采用HPLC法,样品经甲醇溶解,超声处理后,采用Shimpack CLC-ODS(6.0 mm ×150 mm,5 μm )色谱柱,溶剂A [甲醇-乙腈 (2∶1)]-溶剂B [0.1%三乙胺溶液(磷酸调pH 3.0)](23∶77)为流动相,流速1.0 ml·min-1,检测波长348 nm,柱温30℃.结果秦皮甲素在0.145～0.726 μg、秦皮苷在0.112 ～ 0.560 μg、秦皮乙素在0.082 ～ 0.412 μg、秦皮亭在0.110 ～0. 552 μg范围内均呈良好的线性关系,秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮亭的加样回收率分为99.77%(RSD=0.48%)、99.67%(RSD=0.75%)、98.80 %(RSD=1.02%)、98.83 %(RSD=1.10%),n＝9.结论所用方法操作简便、重复性好,结果准确可靠,可满足其质量控制要求.

秦皮药材的质量评价

目的 评价秦皮药材的质量 ,为药典标准修订及新药研究提供依据。方法 采用紫外分光度法定量分析秦皮有效部位的总香豆素 ;高效液相色谱法定量分析香豆素中的主要成份秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷及秦皮亭。结果 秦皮中的总香豆素及其主要成份在枝皮中远较干皮高 ,并以枝条越细含量越高 ,干皮中含量较低 ,远不能达药典限度要求 ;秦皮饮片炮制过程中 ,“洗净 ,润透”过程对香豆素类成分影响较大。结论 建议药典将秦皮干皮与枝皮的含量限度分列 ,或者考虑干皮不作为其入药部位 ;炮制时不再洗与浸 ,直接干切。