猪伪狂犬病病毒BJC变异株分离鉴定及gB和gE基因序列分析

为了确定伪狂犬病疑似发病猪场PRV变异株病原及其病毒分子特征,通过病理剖检、病毒分离鉴定与纯化、ST细胞TCID_(50)和小鼠LD_(50)测定,对分离鉴定的病毒gB、gE基因进行PCR扩增、回收、克隆和测序,用生物信息学分析软件Geneious Prime对gB、gE基因进行遗传进化和同源性分析。结果显示,该分离株为PRV强毒株。该病毒在ST细胞生长良好,纯化后的病毒经测定半数组织培养感染量为10^(8.5)TCID_(50)/mL,对6周龄昆明小鼠的LD_(50)为10^(5.8)TCID_(50)。测序结果与预期的PRV gB、gE基因片段相符。遗传进化分析可知与国内代表PRV变异毒株如JS2012、HN1201、ZJ01等处于同一分支,与欧美分离株如Bartha、Kaplan、Becker等亲缘关系较远,处于不同的大分支。氨基酸序列分析表明,BJC株与国外经典毒株和国内早期分离毒株存在多个特征性位点替换,符合国内流行变异毒株特征,BJC株为PRV变异毒株。

三种不同猪伪狂犬病gB抗体试剂盒检测对比分析

宁化县动物疫控中心为了在猪伪狂犬病监测及猪场疫病净化工作中选用合适的检测试剂盒,选取三种不同市场主流品牌猪伪狂犬病g B抗体ELISA检测试剂盒对宁化县13家生猪规模养殖场采集的血样进行抗体检测。对三种试剂盒检测猪伪狂犬病gB抗体阳性率、符合率及便捷性进行对比分析。结果显示:三个厂家试剂盒的猪伪狂犬病gB抗体总符合率分别为96.63%、98.50%、98.16%,Kappa值分别为0.917、0.932和0.928。结论:三种不同厂家猪伪狂犬病gB抗体ELISA检测试剂盒检测结果相互间的符合度极强,三种试剂盒均适用于猪伪狂犬病gB抗体的定性测定。

江西省猪伪狂犬病原流行病学调查及其gB、gE及TK基因遗传变异分析

为了解江西省猪伪狂犬病原流行情况及遗传变异情况,对2017—2018年收集的疑似伪狂犬样品,以1对针对猪伪狂犬病毒gE基因的检测引物进行病原检测,并随机挑选15株PRV阳性样品,对PRV病毒复制必需的糖蛋白gB基因和主要毒力基因gE与TK基因克隆测序及遗传进化分析,用以探究其遗传变异关系。临床结果显示:猪伪狂犬病毒检出率由2017年的4.76%PRV gB/gE/TK全基因序列遗传进化分析结果表明:调查的15株伪狂犬病毒毒株与中国株处于同一分支,与美国株Bartha差异较大。核苷酸同源性分析结果表明:15株PRV gB基因相互间同源性为98.9%～100%;与参考毒株的gB基因的同源性96.7%～100%;gE基因相互间同源性为99.1%～100%;与参考毒株的gE基因的同源性98.1%～100%;TK基因变异相对较小,相互间同源性为100%,与参考PRV毒株的gE基因的同源性99.1%～100%。研究结果表明,gB基因和gE基因存在较多的变异,可能是当前流行毒株抗原变异及毒力增强从而使现有疫苗免疫保护力不佳的主要原因。

某规模化猪场猪伪狂犬gE和gB抗体的检测与分析

[目的]了解龙岩市某规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和免疫抗体水平.[方法]采用ELISA法对2010～2013年该场采集的种猪和育肥猪群的血清样品共1 217份进行猪伪狂犬野毒（gE）抗体和免疫（gB）抗体检测.[结果]种猪与育肥猪猪伪狂犬野毒总样品阳性率分别为13.5％和28.4％,其中60～ 100日龄的育肥猪总样品阳性率为5.2％,100 ～210日龄的总样品阳性率为42.1％;种猪伪狂犬免疫抗体总样品阳性率分别为92.2％,60 ～160日龄的育肥猪猪伪狂犬免疫抗体阳性率呈波动变化,血清样品总阳性率为50％.[结论]该猪场育肥猪群野毒感染率较种猪群高,且100日龄以后的育肥猪群野毒感染率较高,种猪群的免疫抗体水平高于育肥猪群,80～130日龄育肥猪免疫抗体水平较低.

牛传染性鼻气管炎病毒gB和gE基因双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的IBRV g E和g B基因序列,设计2对特异性引物及Taq Man探针。结果显示,以含有gB、gE基因的重组质粒为模板绘制标准曲线,其相关系数(R^2)均为0.999,有良好的线性关系。该方法仅对IBRV检测为阳性,而对牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛、羊布鲁氏菌检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的敏感度约为2拷贝/μL,重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于2%。根据被OIE采纳的作为国际贸易规定的检测该病毒的荧光定量PCR方法与本实验建立的方法分别对30份牛肺样品进行检测,符合率可达81.8%。研究表明所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于IBRV的检测。

猪伪狂犬病阳性场gE与gB抗体监测及风险评估

采集衡阳某猪场119份血清样品进行伪狂犬病gE-ELISA（酶联免疫吸附试验）与gBELISA抗体检测。gE抗体检测结果表明,该猪场所检测猪群除公猪外都有伪狂犬病野毒阳性,是伪狂犬病阳性场,总阳性率为47%。公猪伪狂犬病野毒抗体阳性率为0,说明公猪暂时还没有感染伪狂犬病野毒,属于阴性猪;母猪群伪狂犬病野毒（gE）阳性率达50%~60%;30~40日龄及60日龄阶段猪群gE抗体阳性率分别为30%和55%,加上可疑的数量达到40%~65%,这阶段野毒抗体阳性估计主要受母源gE抗体的影响,且与母猪阳性背景基本一致,但也不能排除个别仔猪阳性抗体来自病毒感染;90~120日龄阶段gE阳性率不降反升,达到100%,说明90~120日龄阶段猪群是在保育转至肥育舍后被伪狂犬病野毒再次感染,gE抗体S/N值显著下降,抗体水平较高。gB抗体结果表明,该猪场伪狂犬病gB抗体阳性率为98%,公猪伪狂犬病gB抗体阳性率为100%,且公猪的gE抗体阴性,说明公猪gB抗体来源于疫苗免疫;母猪群伪狂犬病gB抗体水平高且整齐,可能是野毒感染和疫苗免疫综合作用的结果;30~40日龄阶段gB抗体水平整齐,这是由于母猪群gB抗体水平高且均匀整齐,其仔猪母源抗体相应较好;60日龄阶段gB抗体水平不整齐,这与母源抗体消退有关;90~120日龄阶段gB抗体水平显著提升,这可能是后期野毒感染所致,因为其gE抗体不降反升。综合该猪场gE和gB抗体检测结果分析表明,该猪场伪狂犬病在种猪群得到了有效控制,生产比较稳定,但种猪带毒且散毒,肥育猪的感染压力加大,造成病毒不断循环,肥育猪伪狂犬病野毒感染的控制成了稳定伪狂犬病阳性场的关键。目前,猪伪狂犬病阳性场应定时监测gE和gB抗体,根据猪场血清学检测结果,结合临床实际情况实时调整免疫程序,以便稳定生产和预防伪狂犬病的暴发。

2019年新疆部分地区猪伪狂犬病毒gB、gE蛋白抗体ELISA检测及分析

为调查2019年新疆部分地区猪群伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)免疫抗体水平和野毒感染情况,试验应用猪伪狂犬病毒gB、gE抗体检测试剂盒对采集的8个规模化猪场441份血清样品进行PRV-gB和PRV-gE两种蛋白的抗体检测。结果显示:8个规模化猪场PRV-gB平均抗体阳性检出率为90.93%,其中B、C、F场平均抗体阳性检出率均为100.00%,A场平均抗体阳性检出率最低,为16.00%。8个规模化猪场PRV-gE平均抗体阳性检出率为44.67%,其中B场平均阳性检出率最高,为92.47%。A场和D场平均阳性检出率最低,为0。对不同生长阶段的猪群分析,PRV-gB抗体阳性检出率最高为种公猪95.95%,最低为保育猪75.00%;PRV-gE抗体阳性检出率最高为后备母猪78.95%,最低为育肥猪11.43%。试验表明,新疆部分地区猪群存在野毒感染,各养猪场之间、不同生长阶段感染情况不一。该试验可以为新疆部分地区猪场PR防控与净化提供参考。

牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。

2015-2020年天津地区猪伪狂犬病病毒gB、gC、gE基因遗传变异分析

为掌握天津地区猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的流行及遗传变异情况,本研究对2015-2020年天津地区分离的20个分离株的gB、gC和gE基因进行扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。相似性分析结果显示,分离株与2012年后中国变异株相比,3种基因核苷酸及编码氨基酸序列相似性分别为:gB基因均为99.9%~100%;gC基因为99.7%~100%和99.4%~100%;gE基因为99.7%~100%和99.6%~100%。遗传进化和序列比对分析结果显示,依据gB、gC、gE基因绘制遗传进化树均可将PRV毒株分为GⅠ型和GⅡ型,天津分离株属于GⅡ型;其中19个分离株与PRV变异株遗传关系较近,属于同一亚分支,并存在相同的氨基酸变异位点;另外1个分离株(TJBD6株)gB和gE基因与PRV变异株遗传关系较近,氨基酸变异位置与PRV变异株一致,但其gC基因与经典株Ea株遗传关系较近,且核苷酸和氨基酸序列相似性为100%。上述结果表明,2015年以来天津地区流行的PRV毒株存在经典株和变异株2种类型,其中变异株为主要流行株。本次研究初步调查了天津地区PRV分子流行特征,可为猪伪狂犬病防控提供依据。

2013-2018年广西地区猪伪狂犬病病毒gB、gE与TK基因遗传变异分析

为了解广西近年猪伪狂犬病(PR)流行情况及猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株gB、gE、TK基因的遗传变异特点,于2013-2018年采集广西各地区疑似PR发病猪靶组织714份,进行PRV的PCR检测及病毒分离鉴定,并运用DNAStar、MEGA 6.0等生物学软件对分离毒株gB、gE、TK基因进行遗传变异分析。结果显示:样品检测阳性率为24.5%(175/714),共分离获得PRV流行株38株。受检猪群普遍存在PRV感染,经典毒株及变异毒株并存,而且以变异毒株为主。广西流行株不同亚群PRV在gB、gE、TK基因上均存在相同的氨基酸变异特点,与国内变异株亲缘关系较近。推测广西流行株存在两种不同重组变异形式产生的PRV重组毒株,分别为疫苗株gB基因和变异株gE基因重组产生的重组毒株,以及经典株的TK基因被疫苗株(HB98)的TK基因替换而产生的重组毒株。近年广西受检猪场较普遍存在PRV感染,而且PRV流行株以变异毒株为主,可能存在两种不同重组变异形式产生的重组毒株,猪场需重视及实施针对性PR免疫防控计划。

2021年新疆部分地区猪伪狂犬病病毒gB、gE蛋白抗体检测及分析

为了解2021年新疆部分地区猪群中伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染情况和免疫抗体水平,试验应用PRV-gE和PRV-gB蛋白抗体检测试剂盒对新疆5个地区9个规模化养猪场的580份血清样品分别进行了PRV-gE和PRV-gB两种蛋白的抗体检测。结果发现,2021年新疆部分地区猪群PRV-gE抗体平均阳性率为28.28%(164/580),不同地区之间、不同猪场之间的PRV-gE抗体平均阳性率差异较大;PRV平均免疫抗体阳性率为61.9%(359/580),低于国家规定标准(70%),仅有22.22%(2/9)猪场的免疫抗体阳性率达到了国家规定标准,不同地区之间、不同猪场之间的PRV免疫抗体阳性率差异较大。结果表明,2021年新疆部分地区猪群PRV野毒感染率仍处于较高水平,免疫合格率相对较低,需要重视该病的防控工作。

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子量约为44 kDa,pET32a-gE蛋白分子量约为41 kDa。分别以gB和gE重组蛋白作为包被抗原,建立了PRV抗体间接ELISA检测方法。该方法中重组蛋白仅与PRV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可用于PRV抗体的监测,鉴别疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪伪狂犬病净化工作。

2013～2018年江西省猪伪狂犬病病毒流行株gE和gB基因遗传变异分析

为掌握江西省猪伪狂犬病病毒(PRV)的分子流行病学及遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2018年采集自江西南昌、宜春、赣州、吉安、九江、上饶、抚州、新余8个地区的PRV阳性猪病料进行gE和gB基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,共获得64株PRV的gE基因序列和12株PRV的gB基因序列;gE基因遗传进化树表明,64株PRV同属一个大分支,与亚洲毒株及近年来国内分离株亲缘关系较近,全部为GⅠ型,而与GⅡ型的欧美经典毒株亲缘关系较远;江西毒株gE基因与19株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%~100%和94.6%~100%;gB基因与11株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.2%~100%和96.5%~100%;相较于Bartha-K61疫苗株,江西流行毒株的gB基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了江西省PRV的流行与变异情况,为江西省科学防控PRV提供理论依据。

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%～100.0%和97.5%～99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%～100.0%和95.3%～99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。

牛传染性鼻气管炎病毒gB、gE蛋白的研究概述

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovine rhinotracheitis virus,IBRV)又名牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus1,BHV-1)。BHV-1基因能编码11种糖蛋白,其中gB蛋白和gE蛋白在病毒致病过程和刺激机体产生抗体的过程中都起到较大的作用。笔者就关于gB、gE这2种糖蛋白的研究做一概述。

猪伪狂犬病排毒情况与gE、gB抗体之间的关系研究

采集猪伪狂犬病野毒阳性场和阴险场各阶段猪群的血清、乳汁、唾液等样品,用ELISA检测血清gE和gB抗体水平,结果显示,阳性场gE总阳性率为56.7%,其中只有哺乳母猪和1周龄仔猪群的gE呈阴性,6~24周龄猪群gE阳性率从52.9%上升至100%,经产和后备母猪群阳性率高达90%~100%;gB总体阳性率为88.8%,母猪群和公猪阳性率达100%,从1周龄仔猪阳性率100%逐渐降至10周龄育肥猪的40%,之后又快速升高到100%。阴性场gE阴性,gB总体阳性率为38.9%,2~12周龄猪群的gB逐渐转阴,14~20周龄猪群阳性率在20%~75%之间,母猪和公猪群gB阳性率达100%。用RT-PCR检测样品中的核酸,阳性场中脐带血的阳性率最高、达到80%,之后是初乳、为33.3%,其他拭子样品带毒率较低、0.55%~6.21%不等,阴性场样品均未扩增出gE基因片段。研究结果说明,阳性场与阴性场相比,PRV带毒、排毒途径多样,以母猪垂直传播为主,PRV排毒不仅与gE抗体存在相关性,还对母源抗体和免疫抗体产生干扰,表现在母源抗体和免疫消退期gE和gB抗体异常升高。

牛传染性鼻气管炎病毒gB ELISA抗体与中和抗体相关性分析

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)是牛传染性鼻气管炎(IBR)的病原体,常引起流产和呼吸道感染等综合征,给养牛业造成了巨大经济损失。gB作为IBRV中最保守的抗原蛋白,是IBRV诊断的重要靶蛋白。为探究牛gB–ELISA抗体水平与VNT效价的相关性,本研究采用阻断ELISA和VNT两种不同的方法对某一牛场50份血清进行IBRV gB ELISA抗体检测和中和抗体测定。gB ELISA结果显示,阳性血清19份,阴性血清31份;中和抗体结果阳性17份,阴性33份。通过统计学相关系数分析,gB抗体阻断率和中和抗体效价值的相关系数为1.0,从而说明IBRV gB ELISA抗体和中和抗体呈较强的正相关。本研究为使用IBRV gB ELISA抗体水平评估牛群中IBRV抗体保护效果提供理论依据。

黑龙江省某规模化猪场伪狂犬病病毒gE和gB抗体的检测与分析

为调查黑龙江省某规模化猪场猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫情况,运用酶联免疫吸附试验(ELISA)对今年4月份和7月份随机采集于该场的395份血清样本进行猪伪狂犬病病毒gE和gB抗体检测。结果表明:该规模化猪场两次猪伪狂犬病病毒gE抗体检测阳性率均为0,说明猪场现阶段不存在猪伪狂犬病野毒感染;两次检测基础猪群伪狂犬病病毒gB抗体阳性率均较为理想;3周龄仔猪gB抗体阳性率均为100%,说明此阶段猪只母源抗体水平较高,猪只保护效果较好;4月份检测中8周龄保育猪只猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性率仅为25%,此时猪只几乎无保护;同时两次检测中不同阶段育肥猪gB抗体阳性率逐渐升高,在4月份检测20周龄育肥猪时为90%,7月份检测22周龄育肥猪时为93%,说明经过两次疫苗免疫后抗体水平逐渐上升,并对机体提供保护。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白原核表达及野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立一种简单、快速的猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒抗体检测方法,试验采用原核表达技术对PRV流行毒株的gE蛋白进行了原核表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA检测方法。结果表明:获得了以包涵体形式表达的重组gE蛋白,经Western blot鉴定表明重组gE蛋白具有良好的免疫学活性,以该蛋白作为包被抗原建立的检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法检测PRV疫苗免疫血清、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV、FMDV阳性血清均为阴性,检测PRV野毒阳性血清的最低检出效价为1∶10240,批内和批间重复性试验的变异系数分别为2.19%~3.33%和3.01%~4.40%,与国外商品化gE-ELISA试剂盒的符合率达98.72%,应用该ELISA检测河南省部分地区采集的1128份猪血清样品,PRV野毒抗体阳性率为8.07%。说明建立的PRV野毒抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,为PRV野毒抗体的流行病学监测和净化提供了技术支持。

2019-2020年柳州市猪伪狂犬病gB与gE抗体监测分析

2019-2020年,采集广西柳州市6个县(区)31个养殖场,共780份血清样品,采用ELISA方法进行PRVgE抗体和gB抗体的检测,以期了解柳州市养殖场猪伪狂犬病病毒(PRV)的免疫抗体保护水平及野毒感染情况,并为制定伪狂犬病净化方案提供更多合理、有效的科学依据。试验结果表明,PRVgB抗体的阳性率为82.36%,PRVgE抗体的阳性率为13.06%。说明柳州地区的猪伪狂犬病整体免疫水平较高,但仍存在野毒感染的风险。6个县(区)的gB、gE抗体阳性率也有较大差别,这可能与当地养殖场的管理模式、免疫方法等有关。秋季气候多变时会导致疫苗效果下降,猪群的野毒感染率上升。