人类巨细胞病毒特异性CD8^+T细胞IFN-γ和穿孔素水平的检测

目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495503,NLV)特异性CD8+T细胞的功能特性。方法将HLAA2NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV抗原肽刺激6h后分析γ干扰素(IFNγ)的表达水平。结果NLV抗原肽能诱导hCMV特异性CD8+T细胞分泌IFNγ,不同供者特异性CD8+T细胞产生IFNγ的比率存在较大差异(55.69±17.64)%,当NLV抗原肽质量浓度为10μgmL时IFNγ阳性细胞百分率最高;未经刺激的特异性CD8+T细胞内表达较高水平的穿孔素(53.90±16.41)%。结论识别单一表位的hCMV特异性CD8+T细胞合成IFNγ和穿孔素的能力存在多样性。

HLA-A~*0201/WT1五聚体联合胞内IFNγ染色在检测白血病患者外周血WT1特异性T细胞中的应用

本研究探讨五聚体及胞内因子染色在定性定量检测抗原特异性T细胞中的应用价值。用RT-PCR方法检测受试者WT1表达水平;用HLA-A*0201/WT1五聚体及胞内IFNγ染色检测14例表达HLA-A*0201的白血病患者全相合移植前后及其供者外周血中的WT1特异性T细胞。结果表明:14例供者中2例有低水平WT1表达,白血病患者均有不同水平的WT1表达。14例供者均未检测到WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞;移植前14例患者中2例可检出WT1+CD8+CTL,3例检出WT1+IFNγ+细胞,二者间无明显差异(p=0.357),而移植后均可检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,明显高于移植前(p值均<0.01)。移植后大部分患者均在30天内检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,但后者检出率高于前者(p=0.014)。14例患者中WT1+CD8+CTL峰值中位数为0.18%,而WT1+IFNγ+细胞峰值中位数为0.83%,明显高于前者(p=0.005);WT1+CD8+CTL峰值中位时间为移植后75天,WT1+IFNγ+细胞峰值中位时间为移植后105天,但二者间无明显差异(p=0.455)。结论:五聚体及胞内IFNγ染色能有效检测白血病患者外周血中白血病抗原特异性T细胞;两种方法联合检测有助于抗原特异性T细胞的准确定性定量检测。

HIV/AIDS病人CD_4^+T淋巴细胞Th1型与Th2型变异分析

目的研究艾滋病(AIDS)病人、艾滋病病毒(HIV)感染者、健康人群的Th1/Th2淋巴细胞亚群平衡漂移。方法胞外CD分子染色和胞内细胞因子染色相结合,应用流式细胞术分析CD4+T淋巴细胞的Th1/Th2亚群百分比。结果3组人群在CD4+T淋巴细胞计数、Th1细胞百分比、Th2细胞百分比3个指标的分布上,均表现出显著性差异(P<0.001)。正常人群和HIV/AIDS病人在Th1和Th2细胞百分比分布上,均未表现出显著性差异(P=0.067,P=0.835)。艾滋病病人Th1型细胞百分比的均值在治疗过程中呈阶梯状上升趋势,其与治疗时间在68周内的回归系数为0.741,但无统计学意义(r=0.741,P=0.057);Th2细胞百分比的均值在治疗过程中呈明显的下降趋势,其与治疗时间在68周内的回归系数为0.847,有统计学意义(r=0.847,P=0.016)。结论监测CD4+T淋巴细胞Th1/Th2亚群漂移,对于了解艾滋病病人免疫功能变化,认识艾滋病发展规律有重要意义。

抗胞内菌感染免疫及其治疗

胞内菌感染因其胞内寄生的特点 ,而使得天然免疫、抗体免疫应答和体液抗菌物质等难以对其起作用 ,抗胞内菌感染以细胞免疫为主。CD4+ Th1细胞通过分泌IFN γ激活巨噬细胞 ,杀伤被吞噬的胞内菌 ,亦可通过Th1表达的CD40L与巨噬细胞表面CD40结合而激活巨噬细胞 ;Tc细胞主要经胞毒作用溶解感染的靶细胞 ,裂解所释出的病菌经抗体或补体调理后 ,由吞噬细胞清除。细胞毒T淋巴细胞 (CTL)通过分泌Th1细胞毒细胞因子 ,激活被感染的宿主细胞去杀伤病原体 ,或通过颗粒胞吐途径和Fas/FasL途径介导细胞毒性 ,直接溶解靶细胞和杀伤病原体 ,从而在宿主抗细胞内感染的免疫中充当重要角色。氟喹诺酮类药物因其在胞内的弥散和蓄积作用以及纳米粒药物因其对MPS的被动靶向性 ,成为目前抗胞内菌感染治疗的主要方式 ,而细胞疫苗的研制开发是抗胞内菌感染的最终手段。

电生理学特性得到确定的大鼠脊髓背根神经节细胞内谷氨酸和P物质的共存

在离体灌流带脊髓和坐骨神经的标本上，对脊髓背根神经节（DRG）细胞的电生理学特性、对P物质（SP）受体激动剂的反应及谷氨酸（Glu）／SP共存的特点进行了研究。（1）对135个细胞进行了细胞内记录，并依纤维传导速度将其分为Aα／β（＞12m／s）和C（＜1．3m／s）两大类；它们的动作电位的快速后超极化（fAHP）有明显区别，C类的fAHP幅度小、时程长，Aα／β类的fAHP幅度大、时程短；（2）SP受体激动剂Sar－SP（10－6mol／L）诱导42％（5／12）的Aα／β细胞和80％（8／10）的C细胞发生去极化反应；（3）最后向给予SP受体激动剂的22个细胞内电泳biocytin，固定、切片后进行磷酸激活的谷氨酰胺酶（PAG）和SP免疫荧光组织化学染色并同时显示biocytin，观察到biocytin标记并呈PAG样和SP样阳性的三标细胞在Aα／β类为25％（3／12），C类为80％（8／10），两者差异显著（P＜0.05）。结果提示DRG中Aα／β细胞与C细胞的化学解剖和电生理特性不同，SP可能通过作用于节细胞上的自身受体易化冲动的发放。

艾滋病猴特异性细胞免疫的胞内细胞因子检测方法优化与应用

目的为准确检测艾滋病猴模型特异性细胞免疫,优化、确定胞内细胞因子染色(ICS)影响因素和条件。方法使用三种多克隆激活剂分别刺激SIV感染猴外周血单个核细胞(PBMC),确定最佳阳性刺激物和刺激时间;然后使用五种浓度SIVmac239混合肽库分别刺激SIV感染猴PBMC,体外培养,不同时间点进行细胞染色和流式检测,确定肽库的最适刺激浓度和最佳刺激时间。最后,初步应用该方法检测SIV感染猴细胞免疫水平。结果 PMA+离子霉素组合可用作本实验的阳性刺激物;2μg/mL肽库,37℃5%CO2培养16 h,能更有效的刺激T细胞分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ。结论该方法的优化对艾滋病药物的临床前评价和疫苗研发等研究具有重要意义。

胞内细胞因子染色中固定和打孔方法的选择

本文采用流式细胞仪分析三种固定 /打孔液以及胞内FcR封闭对胞内细胞因子染色结果的影响。结果显示 ,商品化fix/ perm固定 /打孔液条件稳定 ,多聚甲醛固定 +0 .1%saponin(PBS)打孔液在一定程度上可替代fix/ perm固定 /打孔液 ,并且有必要将胞内FcR进行封闭。

氧化型高密度脂蛋白对细胞凋亡及细胞内钙离子浓度的影响

目的 通过研究氧化型高密度脂蛋白对培养的内皮细胞致凋亡以及细胞内钙离子浓度的影响,阐述其致动脉粥样硬化机理,并探讨其引起细胞损伤的机制。方法 用铜离子引发脂质过氧化过程,制备氧化型高密度脂蛋白,用MTT检测法检测细胞活性,PI染色法检测细胞凋亡。结果 氧化型高密度脂蛋白可诱导内皮细胞发生凋亡;细胞内钙离子浓度则随氧化型高密度脂蛋白浓度的升高呈现逐渐下降的趋势。结论 氧化型高密度脂蛋白引起细胞损伤的机制可能与钙离子浓度升高有关,体内氧化型高密度脂蛋白通过内皮细胞凋亡的途径损伤血管内皮,引发动脉粥样硬化。

大鼠海马CA3区神经元和星形胶质细胞三维结构重塑

目的观察大鼠海马CA3区神经元锥体细胞及其周围星形胶质细胞(AST)的分布,重塑两者之间的三维构象。方法采用脑片膜片钳全细胞记录、细胞内荧光黄(LY)染色、免疫荧光和激光共聚焦显微镜检查(LSCM)相结合的技术。结果根据放电形式的不同把海马锥体细胞分为位相型和非位相型放电神经元。LSCM下单层光学图像和三维立体重建显示许多AST紧密围绕在LY染色锥体细胞周围并形成紧密接触。2类神经元与AST形成接触的部位存在区别。非位相型放电神经元的树突和胞体周围都有许多AST形成接触的部位在,而位相型放电神经元则仅位于树突。结论不同特性海马神经元周围AST的空间分布可能存在差异。

诊断抗原的纯化在牛γ-干扰素ELISA法中的应用

比较皮内变态反应(TST)、抗酸染色、牛结核ELISA(PPD-ELISA)和γ-干扰素ELISA法(IFN-γ-ELISA)对牛结核的检测结果,并通过比较牛PPD、禽PPD、亲和层析牛PPD(牛PPD’)的IFN-γ-ELISA检测结果,探索诊断抗原的纯化在牛IFN-γ-ELISA法中的应用.结果表明,与抗酸染色相比,IFN-γ-ELISA的敏感性、特异性和符合率都比较高,分别为83.33%(5/6),98.14%(53/54),98.33%(58/60);牛PPD、禽PPD、牛PPD’3种特异性抗原刺激产生IFN-γ释放反应的结果表明,1例抗酸染色阳性的牛,未经亲和层析处理牛PPD的IFN-γ-ELISA检测OD值偏高,判为牛结核阳性,亲和层析纯化牛PPD的IFN-γ-ELISA检测OD值较低,判为牛结核阴性,表明亲和层析处理能排除环境分支杆菌对试验的干扰,IFN-γ-ELISA法有望替代TST法在中国推广使用。

用电子探针X射线显微分析法研究肾上腺素激发的心房特殊颗粒分泌(英文)

本文研究心房特殊颗粒 (ASG)中的钙释放是否能促进颗粒内容的分泌。冷冻超薄切片技术和磷钨酸—乙醇 (EPTA)特殊染色技术制备大鼠心房切片。X射线显微定量分析采用Hall连续谱法 ,用以测量在肾上腺素处理后 15、30、6 0和 12 0min时ASG中钙含量的变化。用形态计量法的数密度作为判断ASG分泌状态的指标。结果显示心房特殊颗粒在生理状态下钙浓度高达 80mmol 公斤·干重。在肾上腺素注射后ASG的数密度逐渐下降 ,并于注射后 6 0min时下降至最低 ;ASG中的钙含量亦逐渐减低 ,但于注射后 30min即达最低 ,由此可见ASG钙含量的下降出现早于颗粒数的下降。推想肾上腺素处理引起的钙释放可能成为一种信号 ,启动心房肽的分泌 ,因此ASG在心房心肌细胞中可能具有细胞内钙库机能。

结核多肽特异性细胞内因子多色流式分析

目的建立能同时检测CD3、CD4、CD8表型及胞内因子IFN-γ、IL-4、TNF-α的多色胞内细胞因子染色流式细胞术;评价六条结核特异性多肽的性能。方法将结核患者组及健康对照组的PBMC,用结核特异性多肽或PMA刺激培养后,通过胞内细胞因子流式检测术,收集荧光标记阳性的淋巴细胞等;从而确定各亚群IFN-γ、IL-4、TNF-α阳性细胞的数量及百分率,得出两组间及各多肽间的性能差异。结果 1.各多肽均能刺激活化结核患者PB-MC产生IFN-γ等细胞因子,但百分率较低;IFN-γ及IL-4多数小于1%,而TNF-α则在大约10%左右。与对照组比较,IFN-γ及TNF-α的均值分别高1-12倍或1-3倍,IL-4+/CD4+T淋巴细胞活化率的倍数较小,而IL-4+/CD8+的倍数则较大;2.不同多肽刺激产生细胞内因子的比较:除多肽H256与H210活性能刺激CD4+亚群分泌更多IFN-γ外,其余各多肽刺激产生因子的性能无统计学差异;3.对于IFN-γ及IL-4因子,各多肽均无CD4+或CD8+亚群差异,但各多肽均可刺激CD8+细胞亚群产生更多TNF-α;4.双阳性(IFN-γ及TNF-α阳性)多功能T细胞分析,经多克隆刺激剂(PMA)活化后,IFN-γ+/CD4+及IFN-γ+/CD8+T细胞分别有83.0%及79.9%(均值)为双阳性细胞,而经多肽刺激后则为68.1%及65.7%(均值)。结论多色流式胞内因子染色能很好地检测特异性多功能细胞;所用的6条多肽均能活化结核特异性淋巴细胞产生细胞因子,但细胞因子的活化率较低。

Biocytin在在体脊髓细胞内标记中的应用

细胞内记录脊髓背角神经元之后，将玻璃微电极中的ｂｉｏｃｙｔｉｎ用去极化方波电流导入。切片经ＡＢＣ法孵育，ＤＡＢ呈色。标记细胞呈Ｇｏｌｇｉ样，胞体直径从数μｍ到数＋μｍ不等，形态各异；树突树完整，光滑或有棘；轴空有时可以显示，如出现串珠样轴突终末及侧枝则提示细胞标记完整。上述结果表明，在在体细胞内记录与细胞内标记相结合中，ｂｉｏｃｙｔｉｎ能够完整地显示所记录细胞的形态。特别是在用于标记中、小细胞有其独到之处。

荧光逆行追踪结合离体固定脑片细胞内Lucifer Yellow染色和荧光免疫组化──共聚焦激光扫描显微镜观察

本文介绍一种由多种方法组合的技术，包括荧光素（FastBlae）逆行追踪．离体固定脑片细胞内LuciferYellow染色、荧光免疫组织化学染色和共聚焦激光扫描显微镜观察。通过这项组合技术．可以在1μm厚度的光学切片和连续光学切片三维重构图象中同时显示传出神经元的结构和免疫阳性传入纤维及其终未．进而可判断两种成分之间的联系。在单细胞水平的突触学研究中．此项技术提供了一个简单、有效的定性和初步定量相结合的实验方法．

大鼠脊孤束-背索突触后神经元的微细结构

首次将HRP细胞内注射技术应用于大鼠脊髓背角。从而提供了大鼠脊孤束-背索突触后(SST-DCPS)神经元的微细结构。在大鼠腰髓背角深层获得3例经细胞内染色显示出较完整结构的SST-DCPS神经元,其中2例位于第Ⅳ板层,胞体略呈梭形和三角形,参考Bennett对猫背索突触后(DCPS)神经元树突分布的分型,应为D型;另1例位于V层内侧,胞体呈椭圆形,树突分型为B型神经元。

一步法胞内染色在临床检测Th1和Th2细胞中的应用

【目的】探讨一步法破膜剂(Per Fix-nc)进行胞内染色在流式细胞术临床检测Th1和Th2细胞中的应用。【方法】取10例健康儿童(HV)外周全血刺激培养,分别采用Per Fix-nc与两步法破膜剂固定破膜染色,用流式细胞术检测CD3+CD8-细胞中的Th1%和Th2%,比较两种破膜剂检测Th1和Th2细胞有无差异,并进行方法一致性检验。并随机选取一例HV样本进行重复性试验。用10例儿童再生障碍性贫血(AA)患者的Th1%和Th2%对实验条件进行验证。【结果】Per Fixnc和两步法破膜剂相比,HV中检测出的Th1细胞百分比分别为20.10(15.59-24.78)%和19.57(16.73-25.26)%(P>0.05),其相关系数r=0.777(P<0.01);Th2细胞百分比分别为1.83(1.52-2.38)%和1.87(1.43-2.42)%(P>0.05),其相关系数r=0.875(P<0.01)。重复性试验中,样本的Th1和Th2细胞百分比均值分别为(17.88±1.75)%、(1.47±0.13)%,CV分别为9.8%、8.8%。儿童AA患者的Th1和Th2细胞分别为(32.3±6.06)%、(1.55±0.34)%,Th1和Th2细胞较儿童HV组有非常显著性差异(P<0.01)。【结论】一步法(Per Fix-nc)与两步法破膜剂之间有较好的相关性,在简化破膜操作流程的同时,能达到较两步法更好的细胞分群,为临床上Th1和Th2细胞的日常检测和进一步研究提供了较好的实验条件。

大鼠扣带皮质V层锥体细胞的电生理学和形态学特征的研究

本文用细胞内记录、Ｂｉｏｃｙｔｉｎ注入和细胞内染色相结合的方法，在大鼠离体脑片上，对扣带皮质Ｖ层锥体细胞的基本电生理学特性和形态学特征进行了研究．注入Ｂｉｏｃｒｔｉｎ的锥体细胞位于扣带皮质１区（Ｃｓｌ区）和２区（Ｃｇ２区），Ｃｇ１区和Ｃｇ２区性体细胞的电生理学特性不同，特别是后电位有差异。Ｃｇ１区锥体细胞的锋电位出现后有显著的快速后超极化跟随；Ｃｇ２区神经元的快速后超极化较小，但出现中等范围后超极化和会极化后电位。两区锥体细胞在形态学特征上也存在差异，Ｃｇ１区锥体细胞的顶树突比Ｃｇ２区者长，且在皮质浅层内分支较少；而Ｃｇ２区锥体细胞的顶树突则有较多分支。Ｃｇ２区锥体细胞的基树突比Ｃｇ１区神经元者延伸范围广且密集。所有的锥体细胞都有一条伸入皮质下白质的主轴突，Ｃｇ１区神经元的轴突侧支主要沿顶树突在垂直方向上分布，而Ｃｇ２区神经元的轴突侧支则延伸至较广泛的区域．

胞内细胞因子最佳染色抗体浓度的选择

探讨胞内细胞因子最佳染色浓度的选择方法。以人外周血单个核细胞为研究对象 ,应用胞内免疫荧光染色和流式细胞仪检测分析 ,比较不同浓度商品化IFNγ -FITC单抗和IL4 -FITC单抗与实验室制备的IFNγ -FITC单抗和IL4 -FITC单抗的荧光染色效果。结果表明 ,应用不同浓度商品化抗体得到的染色率不同。选择与用商品化抗体最佳染色浓度得到的染色率相同的实验室制备荧光抗体的染色浓度作为实验室制备荧光抗体的最佳染色浓度。

Biocytin,一种新型细胞内示踪剂

Biocytin是生物素与赖氨酸的复合物,分子量为373,大约是辣根过氧化物酶的百分之一。分子量小和含生物素使得此化合物容易通过高阻抗玻璃微电极注入所记录的神经元内,并用常规的ABC方法显示。本实验在大鼠离体脑片上进行。将Biocytin泳入完成电生理观察的不同海马神经元内,ABC孵育,DAB呈色。结果看到,锥体细胞和颗粒细胞,被Biocytin显示呈Golgi样标记,中间神经元被Biocytin标记的轴突终末广泛而密集,其效果明显优于当前广泛用于细胞内标记的辣根过氧化物酶和Lucifer yellow。

选择性IgA缺乏症患者细胞免疫活性分析

目的 探讨选择性IgA缺乏症 (SelectiveIgADeficiency ,SIgAD)患者的细胞免疫功能 ,指导临床诊断与治疗。 方法 以激光比浊法测定患者血清IgG、IgA、IgM水平 ,以银染法检测外周血T淋巴细胞增殖活性 ,以单抗花环法检测T淋巴细胞亚群水平 ,以ELISA法检测血清中干扰素 -γ(IFN -γ)、白细胞介素 - 4 (IL - 4 )水平来评价辅助性T细胞亚群活性。结果 ① 2 2例IgA水平低于 0 .1 g/L而IgG、IgM基本正常的患者 ,CD3、CD4、CD8计数与正常对照组之间差异无统计学意义 (P >0 .0 5) ,CD4/CD8比值显著低于正常对照组 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5) ;②T淋巴细胞增殖活性 (I .S % )为 (4.75± 1 .1 7) % ,与对照组比较明显降低 ,差异有统计学意义 (P<0 .0 1 ) ;③SIgAD患者血清IL - 4水平与正常对照组比较显著降低 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5) ,IFN -γ分泌无明显变化。 结论 ①选择性IgA缺乏症患者细胞免疫活性低于正常水平 ;②IL - 4分泌水平降低 ,提示Th2类活性降低 ,在选择性IgA缺乏相关疾病中存在Th1 /Th2的不平衡。