Mage-D1对敲除小鼠骨髓间充质干细胞的矿化调控作用

目的探讨黑色素瘤相关抗原D1(melanoma associated antigen D1,Mage-D1)对小鼠股骨骨量和对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stromal cells,BMSCs)矿化能力的影响及潜在分子机制。方法以雌性Mage-D1基因敲除杂合子小鼠和雄性野生型(wide type,WT)小鼠作为亲本小鼠,繁育Mage-D1基因敲除纯合子(Mage-D1 knock out,Mage-D1 KO)小鼠。PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定雄性Mage-D1基因敲除纯合子小鼠和同窝雄性野生型小鼠,micro-CT扫描用于分析小鼠股骨骨量,ELISA和化学法用于检测小鼠血清钙离子、磷离子、降钙素和甲状旁腺素水平。原代培养BMSCs并进行流式细胞术鉴定,免疫荧光染色观察Mage-D1在BMSCs中的表达。构建Mage-D1沉默慢病毒感染BMSCs,分为阴性对照组(sh-NC)和沉默组(sh-Mage-D1);细胞划痕实验检测BMSCs的迁移能力,流式细胞术和CCK-8检测BMSCs周期变化和增殖能力;矿化诱导后行碱性磷酸酶染色、茜素红染色;RT-qPCR和Western blot检测ALP、Runx2、Col1表达水平;RT-qPCR检测矿化相关基因p75NTR及MSX1以探讨潜在机制。结果与野生型小鼠相比,Mage-D1敲除纯合子小鼠股骨皮质骨厚度减小、皮质骨矿物含量降低、松质骨骨矿物含量降低、骨小梁数减少、松质骨骨表面密度降低、骨小梁分离度增大(P<0.05);敲除Mage-D1后,小鼠血钙、血磷、降钙素和甲状旁腺素水平无明显变化。Mage-D1表达于整个BMSCs内,在细胞核及胞核周围区域高表达。与sh-NC相比,sh-Mage-D1组细胞增殖能力降低(P<0.01),细胞迁移能力增强(P<0.01);矿化诱导后,sh-Mage-D1组ALP、Runx2、Col1基因(P<0.05)和蛋白(P<0.01)表达下降,碱性磷酸酶染色和茜素红染色更浅;sh-Mage-D1组细胞中p75NTR、Msx1表达水平比sh-NC组低。结论Mage-D1基因敲除可明显降低小鼠股骨骨量。Mage-D1可促进BMSCs增殖、抑制其迁移,正向调控其体外矿化,p75NTR-Dlx1/Msx1信号轴可能参与Mage-D1对骨代谢活动的调控。

MAGE-1、MAGE-3基因在胃癌和胃活检组织中的表达及意义

目的 :检测黑色素瘤抗原基因 1、 3(MAGE 1和MAGE 3)在胃癌中的表达 ,探索其在胃癌免疫治疗中的应用价值。方法 :采用RT PCR法 ,对 36例胃癌患者的癌组织和相应的癌旁“正常”黏膜 ,以及 37例慢性胃炎患者的胃镜活检组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因的表达进行研究 ,并对RT PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。结果 :36例胃癌组织中 ,MAGE 1基因的表达阳性率为 72 .2 2 % (2 6 / 36 ) ,MAGE 3基因的表达阳性率为 6 9.4 4 % (2 5 / 36 )。MAGE 1、MAGE 3的表达均为阳性者为 5 2 .78% (19/ 36 )。癌旁“正常”黏膜中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率分别为 4 7.2 2 % (17/ 36 )和4 4 .4 4 % (16 / 36 ) ;MAGE 1、MAGE 3基因表达双阳性者为 30 .5 5 % (11/ 36 )。在 37例胃慢性炎症患者中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率 ,分别为 2 9.73% (11/ 37)和 2 7.0 3% (10 /37) ;MAGE 1、MAGE 3基因的表达双阳性者为 8.1% (3/ 37)。胃癌组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因表达阳性率均高于癌旁和胃慢性炎症患者 ;在肿瘤组织中的表达阳性率与肿瘤浸润的深度和分化程度有关 (P <0 .0 5 ) ;而与临床病理分期及淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。结论 :基于MAGE 1和MAGE 3基因在胃癌中的高表达率 ,可利用这两种蛋白作为靶?

MAGE-3基因的表达检测和重组MAGE抗原的制备及其应用

目的克隆MAGE-3基因并检测其在人食管癌组织中的表达情况；重组表达MAGE-1和MAGE-3抗原，用于食管癌的治疗性蛋白疫苗的免疫原性研究。方法RT-PCR法检测了MAGE-3在人食管癌组织中的表达情况。采 用DNA重组技术将MAGE-1和MAGE-3全长cDNA 克隆至pET30a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE 和 wes-tern blot鉴定后，制备其可溶性蛋白，研究其对人T细胞增殖能力的影响。结果MAGE-3基因 在食管癌组织中的表达率为50%（15/30）；在30例相应癌旁正常组织中未见表达。成功获得了MAGE-1和MAGE-3可溶性蛋白；人 T细胞能够对自身抗原递呈细胞加工处理的MAGE-1和MAGE-3蛋白产生应答。结论MAGE-1和MAGE-3蛋白可能是用于食管癌免疫治疗的免疫原性较强的靶抗原。

非小细胞肺癌组织中MAGE-A3和MAGE-C2 mRNA的表达

目的:检测肿瘤相关抗原恶性黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A3、MAGE-C2在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况,并探讨其临床意义。方法:收集206例NSCLC手术患者肿瘤组织,应用real-time PCR技术检测组织中MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA的表达,并分析其与NSCLC患者临床病理特征(性别、年龄、组织学分级、病理类型、淋巴结转移和临床分期)之间的关系。用基因沉默的方法将肺癌A549细胞MAGE-A3下调,观察处理前后MAGE-A3mRNA表达水平的改变,并分析其对细胞生物学功能(凋亡率、成球率、穿膜细胞数)的影响。结果:MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA在NSCLC组织中的表达率分别是73.3%(151/206)和52.9%(109/206);MAGE-A3 mRNA的表达与疾病分期和淋巴结转移有关(P<0.05);不同病理特征的NSCLC组织中MAGE-C2 mRNA的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA共表达与年龄和临床分期有关(P<0.05)。MAGE-A3表达降低后肺癌A549细胞的成球能力和侵袭转移能力降低(P<0.001)。结论:MAGE-A3、MAGE-C2在NSCLC组织中有较高的表达率,两者有望成为肺癌免疫治疗的潜在靶点。

黑色素瘤抗原基因MAGE-1、MAGE-3和抑癌基因p53在肺癌中表达的研究

目的:分析肺癌组织MAGE-1和MAGE-3基因以及p53基因表达及其相互关系。方法:取肺癌组织标本30例,另取癌周组织作为对照。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测MAGE-1和MAGE-3基因以及p53基因的表达。结果:MAGE-1,MAGE-3在肺癌中有较高表达,MAGE-3的表达高于MAGE-1的表达。p53在肺癌中表达较低,在正常组织中表达较高;MAGE-1在肺腺癌中表达较鳞癌高,MAGE-3在肺鳞癌中表达较高;MAGE-1,MAGE-3的表达可能与肿瘤分化程度无关;p53在小细胞肺癌中的表达有待进一步研究;p53与MAGE在体内表达成负相关。结论:MAGE-1、MAGE-3和p53在肺癌组织与正常组织中有不同的表达,MAGE-1、MAGE-3的表达与病理类型有关,与肿瘤分化无关。

MAGE-1 MAGE-3及AFP基因在肝癌组织中的表达

目的:探讨MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA在肝癌组织中的表达及用于检测微小转移的可能性。方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA的表达。结果:86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA的阳性率分别为34.9%(30/86)、60.5%(52/86)和69.8%(60/86);所有患者肝癌组织至少表达其中一种mRNA。结论:MAGE-1、MAGE-3结合AFP mRNA在肝癌组织中表达率较高,有可能用于联合检测肝癌血行微小转移。

MAGE-B3基因在多株胃肠道肿瘤细胞系中的表达

从转录和翻译两个水平检测MAGE B3基因在胃肠道肿瘤细胞系中的表达 ,以分析其在临床胃肠道肿瘤免疫治疗中的可行性。提取胃肠道肿瘤细胞株的总RNA后 ,RT PCR方法检测MAGE B3基因转录水平表达 ,采用间接免疫荧光法检测细胞中MAGE B3抗原。在转录水平除肠癌细胞株LOVO阴性外 ,其余 7株胃肠道癌细胞株MAGE B3基因表达均为阳性 ,而在蛋白水平所检测 8株胃肠道癌细胞株MAGE B3均显阳性表达。基于MAGE B3基因和抗原在胃肠道肿瘤细胞株中的高表达 ,可利用该基因或抗原作为靶分子进行免疫治疗。

肿瘤特异性抗原(MAGE)在肿瘤免疫治疗中的作用

目前,已经发现肿瘤特异性抗原Mage基因家族有55个成员,其中MageA、B和C三个亚家族在各种组织来源的恶性肿瘤中特异性表达,正常组织(睾丸除外)均不表达。所以,Mage抗原作为肿瘤的特异性标志,在肿瘤的检测和免疫治疗方面具有很大的应用潜力。本文介绍了Mage家族的基因定位,Mage蛋白的特性,Mage基因的作用。同时,总结了近年来Mage基因家族在临床方面的应用研究结果。

MAGE-A9和MAGE-A11基因在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨黑素瘤抗原MAGE-A9和MAGE-A11在乳腺正常组织、乳腺良性病变、乳腺癌组织中的表达以及甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对MAGEA9和MAGE-A11基因表达的影响。方法:应用RT-PCR和免疫组化方法检测60例乳腺正常组织、60例乳腺良性病变及60例乳腺癌组织(标本均取自河北医科大学第四医院乳腺中心2007年11月至2008年5月乳腺手术治疗患者)中MAGE-A9和MAGE-A11 mRNA及其蛋白的表达,分析其与乳腺癌患者临床病理学特征的关系。RT-PCR检测乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231经5-Aza-CdR和TSA单独或联合作用后MAGE-A9和MAGE-A11 mRNA表达量的变化。结果:乳腺癌组织中MAGE-A9mRNA和蛋白阳性表达率分别为45%(27/60)和43.3%(26/60),MAGE-A11 mRNA和蛋白阳性表达率分别为66.7%(40/60)和63.3%(38/60),而乳腺正常组织及良性病变组织中均未发现MAGE-A9、MAGE-A11 mRNA及其蛋白的表达。MAGE-A9、MAGE-A11 mRNA和蛋白的表达与乳腺癌患者的年龄、病理类型、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移、瘤栓及孕激素受体的表达均无明显关系(P>0.05),但与人表皮生长因子受体2(HER-2)和雌激素受体(ER)的表达有关(P<0.05)。未经药物处理的MCF-7、MDA-MB-231细胞未见MAGE-A9和MAGE-A11 mRNA表达;单用5-Aza-CdR处理后可见MAGE-A9和MAGE-A11基因重新表达,联合应用5-Aza-CdR和TSA处理可使MAGE-A9、MAGE-A11基因的表达量进一步增加(P<0.05);而TSA单独处理对基因表达没有影响(P>0.05)。结论:乳腺癌组织中MAGE-A9和MAGE-A11的表达与ER和HER-2的表达有关,5-AzaCdR单用或联合应用TSA可诱导和增强MAGE-A9和MAGE-A11 mRNA的重新表达,说明DNA的去甲基化和组蛋白乙酰化可能是调控人类肿瘤细胞MAGE表达的重要机制。

MAGE-12蛋白在肺癌中的表达及其意义

目的 探讨肺癌组织中MAGE 12的蛋白表达、定位及其与临床病理分型之间的关系。方法 采用免疫组化方法检测 17例肺癌标本中MAGE 12蛋白表达及细胞内定位。结果 17例中 11例蛋白水平表达 ,表达率为 6 4 .7% ,其中 15例肺鳞癌中 10例表达MAGE 12蛋白 ,2例肺腺癌中 1例表达。 11例蛋白水平表达的样本及 1例已知阳性表达MAGE 12的LB373 MEL细胞株均定位于细胞质 ,反应呈棕黄色。结论 MAGE 12蛋白在肺癌有较高的表达率 ,基于MAGE

CAGE MAGE-A1和MAGE-A3去甲基化在胃癌发生发展中的作用

目的:探讨肿瘤相关抗原基因(CAGE)、黑色素瘤抗原基因-A1(MAGE-A1)和黑色素瘤抗原基因-A3(MAGE-A3)启动子区去甲基化状态改变在胃癌早期发生、发展中的作用及意义。方法:87例内镜活检标本分为胃癌组、癌前病变组和正常对照组,应用甲基化特异性PCR方法分别检测各组中3种基因启动子区的去甲基化状态。结果:胃癌组、癌前病变组和正常对照组中,各基因启动子区的去甲基化阳性率分别为:CAGE:80.0%(24/30)、37.5%(12/32)和4.0%(1/25);MAGE-A1:60.0%(18/30)、21.9%(7/32)和0(0/25);MAGE-A3:46.7%(14/30)、12.5%(4/32)和8.0%(2/25),呈下降趋势。3种基因启动子区去甲基化阳性率在3组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。30例胃癌至少发生1种基因启动子区去甲基化的有27例;至少发生2种基因启动子区去甲基化23例;7例同时发生了3种基因启动子区的去甲基化。结论:这3种基因启动子区去甲基化改变可能发生于胃癌发病早期,且贯穿于胃癌发生、发展的全过程并起到一定的作用,联合检测可能有助于提高胃癌去甲基化诊断的阳性率。

MAGE-A1、MAGE-A3基因在人舌鳞癌中的表达及其临床意义

目的从mRNA水平观察肿瘤特异性抗原MAGE(黑色素瘤抗原基因)-A1及MAGE-A3基因在人舌鳞癌组织中的表达情况,以评价MAGE-A1、MAGE-A3基因作为舌鳞癌的免疫学检测、免疫和基因治疗的分子标志物的可行性。方法提取38例舌鳞癌、10例牙龈瘤病变组织和10例癌旁口腔正常组织标本中的总RNA,逆转录合成cDNA,而后应用RT-PCR法扩增其中的MAGE-A1,MAGE-A3目的基因片段,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)基因作为内对照,经琼脂糖电泳确认。分别采用Mann-WhitneyTest检验和Fisher'sExactTest检验对舌鳞癌不同病理分型、淋巴结转移与否的MAGE-A1,MAGE-A3的表达差异进行统计学分析。结果在38例舌鳞癌中MAGE-A1基因表达23例(60.5%);MAGE-A3基因表达26例(68.4%);两者均有表达13例(34.2%)。MAGE-A1和或MAGE-A3基因表达共36例(94.7%),MAGE-A1、MAGE-A3基因均不表达2例(5.3%)。低分化鳞癌患者两种基因同时表达的阳性率(53.3%)明显高于高分化者(9.1%)。在10例牙龈瘤和10例癌旁正常组织中未见MAGE-A1、MAGE-A3基因表达。结论舌鳞癌组织中MAGE-A1,MAGE-A3基因均有较高表达。提示MAGE基因可以作为检测舌鳞癌的分子标志物,且具有免疫、基因治疗特异性靶位的潜在价值。

MAGE基因mRNA在肺癌细胞中的表达

目的 检测MAGE 1、 2、 3、 4基因在肺癌细胞及癌旁正常肺组织中mRNA的表达水平。方法 用逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)方法对 3 5例肺癌患者肿瘤组织和癌旁正常肺组织进行MAGE 1、 2、 3、 4mRNA表达检测。结果 3 5例肺癌肿瘤标本中MAGE 1、 2、 3、 4的阳性表达率分别为 2 2 .9% ( 8/3 5 )、62 .9% ( 2 2 /3 5 )、3 7.1% ( 13 /3 5 )、77.1% ( 2 7/3 5 ) ;四种基因至少有一种表达的几率是 85 .7% ( 3 0 /3 5 ) ;两种或两种以上同时表达几率是 71.4% ( 2 5 /3 5 )。癌旁正常肺组织四种基因均不表达。MAGE基因的表达在肺腺癌和鳞癌 ,在不同分期的非小细胞肺癌间无差异 ,并且与淋巴结转移与否无关 (P >0 .0 5 )。结论 MAGE 1、 2、 3、 4在肺癌组织中有较高比例的表达 ,癌旁正常肺组织中无表达。

利用质谱技术对肝癌组织中自然呈递的MAGE表位进行鉴定

目的:利用质谱检测技术和差异比较方法,对肝癌组织中自然呈递的黑色素瘤抗原基因(melanomaantigengene,MAGE)表位进行鉴定分析.方法:肝癌细胞和癌旁无瘤肝细胞取自同1例肝癌患者,弱酸洗涤法分离肝癌细胞和肝细胞表面所有肽段;利用表位预测法挑选出HLA—A2限制的MAGE-1,MAGE-3理论侯选肽作为质谱筛选目标;利用弱酸洗涤法从肝癌细胞和肝细胞表面分离肽段,这些肝癌细胞和肝细胞都来自同1例肝癌患者.然后用HPLC分离纯化这些肽段,并将二种细胞的各峰段(fractions)进行差异比较,挑选出肿瘤特异性的峰段进行质谱分析.结果:经表位预测,共选出80条目标肽.从肝癌细胞样品中检测出2条自然呈递的MAGE抗原肽:FLWGPRALV(MAGE-3271-279)和FPSLREAAL(MAGE-1294-302),他们分别来自HCC的峰45.246和峰34.801,m/z分别为1058.49和1003.62.结论:这是首次从肿瘤组织中分离、鉴定出自然呈递的MAGE抗原表位.本实验证实质谱检测法可以对组织中自然呈递的肿瘤相关抗原表位进行快速准确检测,而检测的准确性和高效性对于表位的鉴定和肿瘤疫苗的设计部是非常重要的.

RNA干扰基因敲除MAGE-1在恶性胶质瘤U87细胞中的初步研究

目的:通过构建抑制MAGE-1的短片段双链核糖核酸(siRNA)表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞U87细胞中对MAGE1基因表达的干涉作用。方法:化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE1基因核苷酸链,克隆至经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建核糖核酸干扰(RNAi)质粒载体。利RTPCR、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后胶质瘤U87细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干效果。结果:重组构建的pSUPERMAGE1载体经双酶切、电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成地插入至预计位点,且序列与预期完全一致。稳定转染后G418筛选出的U87多克隆细胞MAGE-1的表达RTPCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干扰作用。结论:载体的成功构建并能对U细胞中的MAGE1分子进行RNAi,为进一步研究MAGE1在肿瘤中的作用,分析基因功能,展开肿瘤基因治疗奠了基础。

肝癌组织中三个MAGE家族基因的克隆

目的:从肝癌组织中克隆肿瘤相关抗原基因MAGE-1的全长cDNA,为该基因及其编码抗原应用于肝癌的免疫治疗奠定基础.方法:根据MAGE-1编码区上、下游序列设计一对引物,用RT-PCR方法从肝癌组织中扩增该基因的全长cDNA,酶切产生粘性末端后连接入PUC19质粒.经初步酶切鉴定后,通过DNA序列分析获取所克隆基因片断的核苷酸序列.结果:成功地克隆了MAGE-1基因的全长cDNA,同时还获得一约750bp的MAGE-3基因片段及一与MAGE-6和MAGE-12高度同源的基因的克隆.此与MAGE-6,-12高度同源的基因可能为一未知MAGE家族成员.结论:肝癌组织中表达多种MAGE家族基因,甚至可能存在未知MAGE家族基因的表达,这将为寻找肝癌免疫治疗的攻击靶点开辟新的途径.

肿瘤抗原MAGE-12的表位及二级结构预测

目的预测肿瘤抗原 MAGE- 12的α-螺旋二级结构、B细胞表位和 MAGE- 12的 HL A- A2限制性 CTL表位。方法用 Garnier- Robson和 Chou- Fasman方案预测肿瘤抗原 MAGE- 12的α-螺旋二级结构 ;用 Kyte- Doolittle亲水方案预测肿瘤抗原 MAGE- 12的 B细胞表位 ;用简单基序 ( simple motifs)和延展基序 ( extended m otifs)对肿瘤抗原 MAGE- 12的 HL A-A2限制性 CTL 表位进行预测。结果 MAGE- 12可能含有较多的 α-螺旋 ;B细胞识别的表位可能在 82～ 93残基 ( QSDEGSS-NEEQE)或附近和 3～ 14残基 ( L EQRSQHCKPEE)或附近 ;发现 1个 HL A- A2限制性 CTL 表位为 FL WGPRAL V( 2 71～2 79)。结论用亲水性方案和基序法预测肿瘤抗原 MAGE- 12的 B细胞表位和 MAGE- 12的 HL A- A2限制性 CTL 表位 ,为实验方法探索 MAGE- 12的表位提供有用线索。

人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的 克隆肿瘤特异性共享抗原mage 3基因 ,制备基于α 病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法 用RT PCR方法从黑色素瘤细胞系LB3 73中制备mage 3基因 ,以含α 病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体 ,构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化 2 93细胞 ,用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage 3蛋白的表达。结果 正确构建了mage 3 pSMART2a重组质粒 ,并且在转化此质粒的 2 93细胞中检测出了mage 3蛋白的表达。结论 此重组mage 3 pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗 ,可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。

肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位4分支多重抗原肽的合成及鉴定

目的 设计合成肿瘤抗原MAGE 12的B细胞表位抗原肽并对其进行鉴定。方法 在预测MAGE 12的B细胞表位序列为QSDEGSSNEEQE(82 -93 )的基础上 ,采用 4分支多重抗原肽结构合成抗原肽 ,免疫C 5 7BL 6小鼠 ,产生多克隆抗体 ,应用ELISA实验及免疫组化实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体。结果 免疫C 5 7BL 6小鼠后可产生MAGE 12的抗原特异性的多克隆抗体 ,抗体滴度可达 1∶64。结论 证明所预测的表位为MAGE 12的B细胞表位。