血清BGP、miR-17-92、sST2与CHD患者PCI术后预后的关系

目的探讨骨钙素(BGP)、微小RNA-17-92a(miR-17-92)可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)与冠心病(CHD)患者经皮冠状动脉介入(PCI)术后预后的关系。方法选取2020年6月至2022年6月南阳市第一人民医院收治并行PCI术的168例CHD患者作为研究组,另选取同期53例未行PCI的CHD患者作为对照组。比较两组患者的血清BGP、miR-17-92、sST2水平,研究组患者随访12个月,失访6例,依据预后情况分为预后不良组126例和预后良好组36例,采用多因素Logistic回归分析影响CHD患者PCI术后预后的危险因素;绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清BGP、miR-17-92、s ST2对预后不良的预测效能。结果两组患者的血清BGP比较差异无统计学意义(P>0.05),但研究组患者的血清miR-17-92、sST2分别为1.55±0.29、(53.48±10.84)ng/mL,明显高于对照组的1.41±0.30、(20.64±5.97)ng/mL,差异均有统计学意义(P<0.05);预后不良组患者的miR-17-92、s ST2分别为1.59±0.29、(58.33±8.43)ng/mL,明显高于预后良好组的1.45±0.28、(52.15±6.86)ng/mL,而血清BGP水平为(23.06±3.84)ng/mL,明显低于预后良好组的(27.19±4.31)ng/mL,差异均有统计学意义(P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示,miR-17-92、sST2是CHD患者PCI术后预后的独立危险因素,而血清BGP是保护因素(P<0.05);ROC曲线分析结果显示,血清BGP、miR-17-92、s ST2单独及联合检测预测CHD患者PCI术后预后的曲线下面积(AUC)分别为0.783、0.628、0.723、0.856,联合预测的AUC明显高于单独预测(Z=2.897、4.627、1.984,P<0.05)。结论血清miR-17-92、sST2均是CHD患者PCI术后预后的危险因素,BGP是保护因素,监测其变化对CHD患者PCI术后预后有一定预测价值。

中国妇女维生素D受体基因型与骨密度及骨钙素关系的研究

为探讨中国妇女维生素D受体（VDR）基因型与骨密度（BMD）及含钙素间的关系，笔者采用聚合酶链反应、限制性酶切技术和Southern杂交技术，对202名北京地区汉族妇女的VDR基因型进行了分析。另外，采用双能X线法测量BMD，并采用放免法测定骨钙素。采用协方差分析的方法对结果进行分析处理。结果发现：中国妇女VDR基因型分布显著不同于高加索人种；绝经后妇女中bb与aa基因型在股骨颈及大转子区呈对应较低的BMD值；未发现VDR基因型与骨钙素间相关。因此，中国妇女VDR基因型与BMD间有一定关联，但其对骨质疏松发病的预测价值还有待深入研究。

新疆乌鲁木齐地区汉族与维吾尔族绝经后女性骨质疏松患者发病特点的研究

目的探讨新疆乌鲁木齐地区汉族与维吾尔族绝经后女性骨质疏松患者发病特点。方法将确诊为绝经后女性骨质疏松症患者汉族(118例),维吾尔族(39例)进行分组,分析对比两组患者骨密度测定值,骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、1-(OH)维生素D3以及血清Ca、P、Mg水平。结果维吾尔族女性原发性骨质疏松症患者发病年龄小于汉族患者,维吾尔族女性原发性骨质疏松症患者的绝经年龄早。维吾尔族1-(OH)维生素D3水平明显低于汉族组(P<0.01),骨钙素(BGP)检测值维吾尔族原发性骨质疏松症患者高于汉族(P<0.05)。结论维吾尔族原发性骨质疏松症患者,可能与汉族有着不同的骨质疏松症发病机制。维吾尔族原发性骨质疏松症患者更应补充足量的活性维生素D。

补肝肾健脾温针灸法防治原发性骨质疏松症及骨量减少的临床研究

目的:探讨补肝肾健脾温针灸法防治原发性骨质疏松症及骨量减少的作用。方法:分别将原发性骨质疏松症63例随机分为针灸治疗组32例和药物治疗组31例,骨量减少患者40例随机分为针灸防治组20例和药物防治组20例,针灸治疗组和防治组均选取大杼、肝俞、肾俞、足三里、阳陵泉、三阴交、悬钟、关元,予针灸治疗,隔日1次,治疗45天次;药物组口服维丁钙片,4片/次,3次/d,连续3个月。观察各组治疗前后的骨密度(BMD)、骨钙素(BGP)、骨痛积分、衰老积分及临床疗效。结果:治疗结束后3个月,针灸治疗组的L2-L4、左股骨Neck、Ward区及GT骨密度较治疗前均有明显增加(P<0.01,或P<0.05);药物治疗组左股骨Ward区骨密度较治疗前有明显变化(P<0.01),左股骨L2-L4、Neck骨、GT部位的密度较治疗前轻微增加,但差异无显著意义,两治疗组间比较差异有统计学意义。骨量减少防治结束后3个月,针灸防治组L2-L4、股骨Neck、Ward区及GT骨密度值与药物组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。针灸和药物治疗骨质疏松症患者及针灸和药物防治骨量减少患者3个月后,BGP较治疗前均有不同程度降低(P<0.01),且针灸组与药物组BGP降低差异有统计学意义(P<0.05)。针灸和药物治疗组、针灸和药物防治组治疗后骨痛积分和衰老积分较治疗前降低(P<0.05,P<0.01),针灸治疗、防治组与药物组治疗、药物防治组治疗前后骨痛积分、衰老积分差值比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。针灸治疗组的临床控制率为25.0%、药物治疗组为3.25%,针灸防治组的临床控制率为35%,药防治物组为10%,针灸治疗、防治组疗效优于药物治疗、防治组(P<0.01,P<0.05)。结论:补肝肾健脾针法治疗骨质疏松症及防治骨量减少在提高骨密度、改善骨代谢、降低骨痛积分,改善衰老症状,改善临床症状上优于口服维丁钙片。该针灸疗法对防治原发性骨质疏松症及骨量减少,延缓衰老有明显的优势。

骨钙素基因多态性与2型糖尿病糖、脂及骨代谢指标的相关性

目的探讨骨钙素(osteocalcin,OCN)基因启动子区RS1800247和RS1543297位点单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)与2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)葡萄糖糖、血脂谱及骨代谢指标的关系。方法根据骨密度的值将217名T2DM患者分为2组:糖尿病合并骨质疏松症(diabetic osteoporosis DO) 124例,糖尿病非骨质疏松症(Non-diabetic osteoporosis, NDO) 93例。用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术对OCN基因RS1800247和RS1543297位点进行多态性分析,比较不同基因型葡萄糖、血脂、骨代谢指标的差异。结果(1)所有研究对象RS1800247和RS1543297位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg定律,DO组和NDO组间RS1800247和RS1543297位点基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05);(2) RS1800247位点TT基因型携带者稳态模型胰岛素分泌指数(homeostasis model assessment insulin secretion index HOMA-β)高于CT+CC基因型携带者(P <0.05);(3) RS1543297位点TT基因型携带者胰岛素敏感性指标(Insulin sensitivity index,ISI)高于CT+CC基因型患者,稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)低于CT+CC基因型患者;(4)未发现RS1800247、RS1543297不同基因型与T2DM骨代谢及脂代谢指标有相关性。结论 RS1800247位点可能与T2DM胰岛细胞β细胞功能相关,其中T等位基因与胰岛β细胞功能的保护性相关,C等位基因可作为预测胰岛β细胞功能降低的一项遗传标志。RS1543297位点可能与T2DM胰岛素敏感性相关,其中T等位基因与胰岛素敏感性正相关,C等位基因与胰岛素抵抗相关。显示OCN基因多态性与影响糖代谢的关键因素相关,提示骨组织可通过OCN参与机体葡萄糖稳态的调控。

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc,转染细胞后检测报告基因对 rh BMP- 2的反应 ,以期用于 rh BMP活性的定量测定 .方法 用 PCR方法扩增骨钙素部分启动子 14 7bp,克隆入p GEM- 3zf(- )中 ,经酶切鉴定和序列分析正确后 ,亚克隆入能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体 pc DNA3- L uc中 ,构建真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc,然后分别将 pc DNA3-L uc和 pc DNA3- OCP- L uc转染细胞 ,并检测其对 rh BMP- 2的反应 .结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc;转染细胞后其报告基因的基础活性较 pc DNA3- L uc大为降低 ,而且报告基因的表达与 rh BMP- 2剂量在一定范围内成线性正相关 .结论 真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc的报告基因表达具有特异性 ,可代替直接测定骨钙素用于 rh BMP- 2活性的定量测定研究 .

人骨膜源性成骨细胞的体外培养

探索成骨细胞的体外培养方法 ,建立人骨膜源性成骨细胞体外实验模型。方法 :以人髂骨骨膜为材料 ,通过植块培养法进行细胞培养 ,通过形态学观察 ;细胞的碱性磷酸酶 (ALP)染色 ;培养液中骨钙素 (BGP)的放免分析等进行细胞学鉴定。结果 :成骨细胞为成纤维细胞型 ,贴壁生长 ,形态多样化 ,HE染色细胞轮廓清晰 ,核内可见 2 -3个核仁 ;细胞的ALP染色为阳性 ;培养液中可检测出较高浓度的BGP。结论 :可以利用人骨膜为材料进行成骨细胞的体外培养 ,本培养方法 ,简便易行 ,可靠。

依替二膦酸锶对去势大鼠骨代谢的影响

目的观察新合成的抗骨质疏松化合物--依替二膦酸锶对骨代谢的影响。方法本研究以去势SD大鼠为基础,对依替二膦酸锶、依替二膦酸二钠和二氯化锶以及不同剂量依替二膦酸锶对大鼠血清骨钙素(BGP)和血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)的影响进行动态观察和比较。结果药物干预治疗后,依替二膦酸锶治疗组其血清TRAP-5b均逐渐下降,与去势对照组的相比表现出明显统计学差异;依替二膦酸锶150mg/kg·d治疗组,其血清BGP有缓慢上升的趋势,于12w末与去势对照组相比差异表现出显著的统计学意义。结论依替二膦酸锶50mg/kg·d、100mg/kg·d和150mg/kg·d治疗剂量均能有效抑制破骨细胞分泌TRAP-5b的能力。依替二膦酸锶150mg/kg·d治疗剂量可能有助于增强绝经期后骨质疏松大鼠成骨细胞分泌BGP的能力。

游泳运动对老龄雄性小鼠骨量及骨代谢相关激素影响的研究

目的:通过游泳运动对老龄雄性小鼠骨量及骨代谢相关激素的影响,为运动预防老年性骨质疏松提供实验依据,并探寻较佳的运动负荷量。方法:以2月龄和12月龄雄性小鼠为研究对象,2月龄鼠设为青年对照组(YC),12月龄鼠随机分为4组:实验对照组(EC),30分钟游泳组(30min组),60分钟游泳组(60min组)和90分钟游泳组(90min组),每周5次,共训练8周,观察增龄和的游泳运动对老龄小鼠股骨骨量、钙调激素及骨钙素(BGP)水平的影响。结果:30Min、60Min组的游泳运动可使老龄小鼠股骨骨量增加;升高;同时使甲状旁腺素(PTH)水平下降;反映骨形成状况的血清骨钙素(BGP)水平升高。60Min组效果明显优于30Min组。90Min组无上述作用。结论:游泳运动是一种适合于老年人的健身方式,适宜负荷的游泳运动可通过对性激素及钙调激素分泌释放的调节,减缓伴随增龄而发生的骨量丢失,起到预防老年性骨质疏松的作用。

骨形成蛋白2基因转染对犬牙髓细胞生物学特性的影响

目的构建骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)绿色荧融合蛋白pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,然后再用其在体外转染犬牙髓细胞(DDPCs)形成BMP2-DDPCs细胞,观察BMP2基因转染对牙髓细胞生物学特性的影响。方法构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,采用阳离子脂质体转染法将BMP2基因转染体外培养的DDPCs,检测BMP2-DDPCs碱性磷酸酶(ALP)活性,骨钙素(OC)产量和Ⅰ型胶原合成量等指标的测定,研究BMP2基因转染对牙髓细胞生物学特性的影响。结果成功构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,对构建的BMP2真核重组质粒用XhoI、HindIII进行双酶切,其产物进行琼脂糖凝胶电泳后,在1.2、4.7kb可见两条特异条带;并进行全基因序列测序,报告100%符合,证明pEGFP-N1-BMP2重组质粒构建成功。BMP2-DDPC中ALP活性,OC产量和Ⅰ型胶原合成量增加,与对照组DDPCs、N1-DDPCs相比差异有统计学意义(P<0.05),通过增强ALP、OC和Ⅰ型胶原等成骨标志物的表达,促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化。结论 pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒转染后的牙髓细胞,具有成牙本质细胞的特征。

前肢畸形WHBE兔前肢骨密度检测及降钙素、骨钙素蛋白表达

目的观察前肢畸形的WHBE（FMWHBE）兔前肢骨密度和降钙素（CT）、骨钙素（又称γ-羧基谷氨酸蛋白，BGP）蛋白表达水平，探讨前肢畸形的可能成因及作为骨生物力学研究的模型动物的可能性。方法分别选取1、2、3、4月龄FMWHBE兔、WHBE兔和日本大耳白兔，每个月龄阶段各6只。所有实验兔称体质量后耳动脉取血检测血清CT、BGP含量，用小动物成像系统测量前肢肱骨、桡骨、尺骨近心端、中段、远心端骨密度，并经脱钙后进行CT、BGP免疫组织化学染色观察。结果各组实验兔各月龄体质量无显著差异。FMWHBE兔肱骨1月龄全段和2月龄近心端、中段及3月龄肱骨远心端，桡骨1月龄中段和远心端及2、3月龄的远心端，尺骨1、2月龄全段及3月龄远心端骨密度均显著低于WHBE兔和日本大耳白兔组（P〈0．05或P〈0．01）。1月龄FMWHBE兔血清CT、BGP含量均显著降低（P〈0．05或P〈0．01），2月龄BGP显著高于日本大耳白兔俨〈0．01），3月龄CT显著高于WHBE兔（P〈0．05）。CT、BGP免疫组织化学染色显示，FMWHBE兔CT表达阳性部位较少，阳性较弱，BGP表达稍弱于wHBE兔和日本大耳白兔。结论FMWHBE兔发生前肢畸形和骨密度变化可能与其生长发育过程中趴卧姿态导致的前肢骨特殊应力及CT、BGP的表达特点有关。

bFGF促进骨膜细胞成骨性生长的研究

目的研究bFGF对骨膜细胞的成骨性生长的影响。方法手术分离大鼠骨膜,用胰酶消化法分离骨膜细胞进行元代培养稳定传代后,选择第3～5代细胞随机分成两组;细胞同步化处理后,实验组用终浓度10ug/L的bFGF刺激细胞,对照组正常培养,72h后,用[3H]-TDR方法检测细胞的增殖状态,RT-PCR方法和Western blot方法检测成骨细胞骨钙素基因的表达。结果 10ug/L的bFGF处理细胞72h后,[3H]-TDR方法检测显示细胞DNA合成水平明显上调;而成骨细胞骨钙素基因在mRNA水平和蛋白水平的表达也明显上调。结论 bFGF能刺激骨膜细胞的成骨性生长。

壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞的基因表达

目的旨在对壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞向成骨样细胞分化的基因表达作一研究。方法根据不同浓度的壳聚糖纳米粒介导的BMP-2(pBMP-2),试验组分为CPB50组(50μg/mL pBMP-2),CPB100组(100μg/mL pBMP-2)和CPB200组(200μg/mL pBMP-2)。骨髓基质干细胞在壳聚糖纳米粒介导的BMP-2基因转染分化后,检测和分析成骨样细胞的特征性分子(碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、护骨素(Osteoprotegerin,OPG)、骨钙素(Osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN))的表达水平。结果基因转染后细胞中的ALP、OPG、OC和OPN基因呈现高表达,尤其是CPB200组最高。结论壳聚糖纳米粒介导BMP-2基因转染骨髓基质干细胞后能促进细胞中成骨样细胞特征性分子的高表达。

肾上腺皮质机能亢进治疗前后血清骨钙素水平

本文用自己建立的放射免疫分析方法测定了12例肾上腺皮质机能亢进患者的血清骨钙素(BGP)含量。治疗前,肾上腺皮质机能亢进患者平均血清 BGP(?)±2SE 为2.5±0.5ng/ml,显著低于正常值(4.8±1.3ng/ml,P<0.01)。8例患者于手术治疗后2周复查,血清 BGP 恢复至正常水平(5.1±1.8ng/ml),本文结果提示,骨钙素测定是皮质类固醇抑制成骨细胞活性的一个敏感指标。

局部应用降钙素基因相关肽对小鼠肩袖损伤后早期愈合的影响

背景:骨腱界面的损伤修复一直是骨科和运动医学领域里的一大难题,新生骨的形成有利于骨腱界面的愈合。降钙素基因相关肽在维持组织稳态和组织损伤后修复过程中发挥着非常重要的作用,但是其在骨腱界面损伤中的作用至今未见报道。目的:建立小鼠肩袖损伤模型,观察降钙素基因相关肽对损伤处成骨因子骨钙素表达的影响,评估其对小鼠肩袖损伤后早期愈合的作用。方法:建立小鼠冈上肌止点-肱骨损伤模型,随机分成2组:实验组术后当天经盂肱关节注入5nmol/kg降钙素基因相关肽,每周3次,共2周;对照组注入等量的生理盐水。术后4,6周安乐死动物获取肩袖损伤标本,行苏木精-伊红染色观察其组织病理变化,实时荧光定量PCR检测骨钙素mRNA的表达,免疫组织化学、免疫印迹实验观察骨钙素的蛋白表达水平,生物力学检测两组肩袖损伤标本的拉断载荷。结果与结论:术后4,6周实验组成骨因子骨钙素的mRNA及蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05);与对照组比较,实验组术后4周有更多的纤维软骨生成,术后6周有更多的新生骨生成;实验组术后4周的力学拉断载荷比对照组轻微上升,但没有统计学差异(P>0.05);术后6周,实验组的力学拉断载荷比对照组高(P<0.05)。结果证实局部注射降钙素基因相关肽能提高损伤处骨钙素的表达及新生骨的形成,有利于肩袖损伤后早期愈合。

2型糖尿病骨钙素、25羟维生素D水平与颈动脉内膜中层厚度的相关性研究

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者外周血骨钙素(BGP)、25羟维生素D[25-(OH)-D]水平与颈动脉内膜中层厚度(IMT)的相关性。方法选取甘肃省人民医院内分泌科T2DM患者66例,健康对照组40例,采用电化学发光法测定血清BGP和25-(OH)-D水平,彩色多普勒超声诊断仪测定IMT。应用独立样本t检验、Pearson相关分析、多元线性回归分析及Logistic回归分析等统计学方法对数据进行分析。结果 T2DM组BGP水平较对照组显著降低(P<0.05);25-(OH)-D水平较对照组降低,但差异无统计学意义(P>0.05),IMT较对照组显著增高(P<0.05)。Pearson相关分析表明:IMT与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)呈正相关(r=0.410,P<0.05)、与BGP呈负相关(r=-0.274,P<0.05)。BGP水平与空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(Hb A1c)和甘油三酯(TG)呈负相关(r=-0.335、-0.256、-0.204均P<0.05)。多元线性逐步回归分析显示:BGP、年龄、FBG是IMT的独立影响因素。Logistic回归分析显示BGP水平降低是颈动脉斑块形成的危险因素。结论 BGP水平降低是2型糖尿病动脉粥样硬化的危险因素。

中国老年学学会骨质疏松委员会骨代谢生化指标临床应用专家共识

骨代谢生化指标包括:钙磷代谢调节指标、骨吸收标志物、骨形成标志物。骨代谢生化指标分别来源于骨、软骨、软组织、皮肤、肝、肾、小肠、血液及内分泌腺体等,是由成骨细胞或破骨细胞分泌的酶和激素,以及骨基质的胶原蛋白代谢产物或非胶原蛋白。骨代谢生化指标可及时反映骨转换状态,灵敏度高、特异性强,用于骨质疏松诊断分型、预测骨折风险、抗骨质疏松治疗疗效评价,以及代谢性骨病的鉴别诊断。并且在骨质疏松发病机制、骨质疏松药物的研究及流行病学研究方面具有重要临床意义。随着骨代谢生化指标检测技术逐渐成熟,临床应用日趋广泛,但不同来源的标本、不同方法、不同设备、不同试剂、人的不同年龄段、不同种族和不同性别等,检测结果存在差异。至今,骨代谢生化指标测定国内外尚无统一检测标准;为此,将骨代谢生化指标的生物学作用及临床意义、技术应用与质量控制,分别整理、凝炼成一篇为各位同仁可读、可用、可参考的文字材料。期待通过"共识"为推动临床骨代谢生化指标检测技术的提高,规范检测流程,建立科学的参考范围,使骨代谢生化指标在骨质疏松规范诊断、规范治疗、抗骨质疏松药物疗效评价及科研工作中发挥重要作用。

体重指数影响骨钙素基因HindⅢ多态性与中国绝经前妇女空腹血糖间的关联

目的:考察骨钙素(BGP)Hind III基因多态性是否与中国绝经前妇女空腹血糖(FPG)变异间存在关联;检测BGP基因型和体重指数(BMI)间的关联是否可以部分地解释BGP基因型与FPG间的关联。方法:研究对象是328名中国绝经前妇女,年龄21岁以上[(33.2±5.9)岁],FPG值平均为4.92 mmol/L(标准差,0.81),采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态(RFLP)法对所有研究对象的BGP Hind III位点进行基因分型。结果:BGP Hind III多态性与校正年龄的FPG以及未用年龄校正的FPG间均存在显著的关联(P值分别为0.028和0.041),且BGP基因可以解释3.32%的FPG变异。但BGP Hind III多态性与年龄和BMI校正的FPG间无显著关联(P=0.517)。此外,BGP Hind III多态性与未校正的BMI(P=0.002)或年龄校正的BMI(P=0.003)都有显著的关联,且BMI与未校正的FPG也存在显著相关(r=0.424,P<0.01),BMI可以解释20.15%的FPG变异。结论:BMI可影响BGP Hind III多态性与中国绝经前妇女FPG间的关联。该研究结果提示协变量如BMI在FPG的遗传关联研究中的重要性。

熊果酸干预骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化

背景:熊果酸可通过Wnt信号通路抑制破骨细胞增殖分化,对胶原诱导性关节炎模型大鼠有抗炎和骨保护作用,但是熊果酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、分化以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达的影响尚不明确。目的:探讨熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖、分化及Wnt信号通路的影响。方法:采用全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,不同浓度(1.0,2.5,5.0,10.0,20.0μmol/L)熊果酸作用骨髓间充质干细胞,以不含熊果酸的培养基为对照组,MTT法检测熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响。用含不同浓度(1.0,2.5,5.0μmol/L)熊果酸的成骨诱导液培养骨髓间充质干细胞,以不含熊果酸的成骨诱导液为对照组,在诱导后第7天和第14天采用ELISA法检测碱性磷酸酶活性和骨钙素水平,在诱导第14天采用RT-PCR检测成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达水平,采用RT-PCR和Western blot法检测Wnt信号通路相关Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达。结果与结论:①不同浓度熊果酸均可促进骨髓间充质干细胞增殖,浓度为5.0μmol/L时增殖率最高;②骨髓间充质干细胞成骨诱导第7天和第14天时碱性磷酸酶活性和骨钙素水平均比对照组增高,差异有显著性意义(P<0.05),且诱导相同时间,随熊果酸浓度增加碱性磷酸酶活性增强,骨钙素水平升高(P<0.05);③诱导14d,熊果酸可促进骨髓间充质干细胞分化后成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2m RNA表达以及Wnt信号通路相关Wnt-3α、GSK-3β、β-cateninm RNA和蛋白表达,随熊果酸浓度增加其表达水平升高(P <0.05);④结果表明,熊果酸通过Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化。

CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

目的利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白(MGP)基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA(gRNA),人工合成gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的LentiCRISPRv2质粒中,构建成LentiCRISPRv2 MGP gRNA重组质粒。将重组质粒与psPAX2、VSVG包装质粒一同转染293 T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证MGP mRNA及蛋白表达水平。qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了LentiCRISPRv2 MGP gRNA重组质粒,成功包装了含有MGP gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达MGP的RAW264.7细胞系。qPCR及蛋白质印迹法检测显示,其MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P<0.05)。qPCR结果显示,最具有代表性的LentiCRISPRv2 MGP gRNA1细胞破骨标志分子Itgb3(2.29±0.17)、Acp5(2.86±0.15)、Ctsk(2.07±0.13)的mRNA水平均显著上调(P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了MGP基因敲除的RAW264.7细胞系,敲除MGP后RAW264.7细胞破骨分化能力增强。