基于PERK/ATF4/CHOP信号通路研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导的ARPE-19细胞的作用机制

目的研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导ARPE-19细胞的影响及其可能机制。方法构建细胞内质网应激损伤模型,将ARPE-19细胞分为空白组、模型组、空白血清组、滋阴明目方含药血清组、牛磺熊去氧胆酸组。对细胞进行形态观察,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白的表达。结果选用浓度50μmol/L衣霉素干预ARPE-19细胞造模。观察细胞形态发现,滋阴明目方含药血清组和牛磺熊去氧胆酸组ARPE-19细胞较模型组细胞数量增多,生长较均匀,漂浮的死亡ARPE-19细胞及碎片减少。与空白组相比,模型组和空白血清组的细胞存活率下降(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达上调(P<0.01)。与模型组相比,滋阴明目方含药血清组细胞存活率上升(P<0.01),凋亡率明显下降(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达下调(P<0.01)。结论滋阴明目方含药血清可以减少ARPE-19细胞内质网应激损伤模型的凋亡,其分子机制与调控PERK-ATF4-CHOP信号通路有关。

葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察葛根芩连汤对2型糖尿病(T2DM)小鼠胰腺内质网应激的影响,探讨其治疗T2DM的作用机制。方法75只SPF级雄性db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和葛根芩连汤高、中、低剂量组,每组15只,15只db/m小鼠作为空白组,给药组分别予相应药物灌胃12周。检测小鼠体质量、空腹血糖(FBG)及糖化血红蛋白(HbA1c),HE染色观察胰腺组织病理变化,TUNEL染色检测胰岛细胞凋亡情况,Western blot检测胰腺组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测胰腺组织PERK、ATF4、CHOP mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著增加(P<0.01);胰腺组织结构不完整,边界模糊,内有空泡,胰岛细胞凋亡明显增加(P<0.01);胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著减少(P<0.05,P<0.01);胰腺组织病理改变有所减轻,胰岛细胞凋亡不同程度减少(P<0.05,P<0.01);葛根芩连汤高、中剂量组和二甲双胍组胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论葛根芩连汤可能通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路,下调相关基因和蛋白表达,减少胰岛细胞凋亡,保护胰岛细胞功能,延缓T2DM进展。

FABP4沉默通过调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路对妊娠糖尿病大鼠内质网应激和胰岛素抵抗的影响

目的:探讨脂肪酸结合蛋白4(FABP4)沉默通过调节蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核细胞启动因子2α(eIF2α)/转录因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路对妊娠糖尿病(GDM)大鼠内质网应激(ERS)和胰岛素抵抗(IR)的影响。方法:腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型。通过尾静脉注射FABP4 siRNA质粒(si-FABP4)、阴性对照质粒(NC)和PERK激活剂(CCT020312),将大鼠随机分为Normal组、GDM组、GDM+NC组、GDM+si-FABP4组、GDM+si-FABP4+CCT020312组。检测胰腺组织中FABP4含量、血脂水平、炎症标志物水平和氧化应激标志物水平,检测胰腺组织中PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。HTR-8/SVneo细胞分为5组:对照(Control)组、高糖(HG)组、HG+NC组、HG+si-FABP4组、HG+si-FABP4+CCT020312组,24 h后检测细胞中FABP4及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。结果:与Normal组相比,GDM组大鼠血清和胰腺组织中FABP4水平显著上调(P<0.05)。FABP4沉默显著降低了FBG和IR,并伴有血脂、CRP、TNF-α、IL-6及MDA水平降低和SOD、CAT水平升高(P<0.05)。此外,FABP4沉默减轻了胰腺和胎盘组织损伤。而CCT020312上调PERK、eIF2α磷酸化水平和ATF4、CHOP蛋白表达后,FABP4沉默对GDM大鼠IR、炎症、氧化应激以及胰腺和胎盘损伤的抑制作用均被逆转(P<0.05)。FABP4在HG诱导的HTR-8/SVneo细胞中上调表达,沉默FABP4可抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路蛋白表达,CCT020312则逆转这种变化(P<0.05)。结论:FABP4沉默通过抑制炎症和氧化应激,改善GDM大鼠的IR和ERS,其机制与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

基于内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病大鼠足细胞凋亡的影响

目的:基于蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病(MN)大鼠内质网应激的影响。方法:将80只雄性SD大鼠随机分配,其中20只为正常组,剩余60只大鼠采用尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法诱导MN病变。将造模成功的大鼠随机分为模型组、贝那普利组和丹参多酚酸盐低、中、高剂量组,每组10只,另取10只正常组大鼠共同进行实验。贝那普利组每日给药剂量为10 mg/kg,丹参多酚酸盐低、中、高剂量组每日给药剂量分别为16.7、33.3、66.7 mg/kg,正常组和模型组予等体积生理盐水,各组均每日灌胃1次,连续4周。检测各组大鼠治疗后24 h尿蛋白定量(24 h-UTP);腹主动脉取血分离血清,检测各组大鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量;过碘酸六胺银(PASM)染色后光镜观察各组大鼠肾组织病理形态,透射电子显微镜进一步观察各组大鼠肾组织细微结构变化;免疫荧光法检测各组大鼠肾组织免疫球蛋白G(IgG)沉积情况;免疫组化(IHC)法检测各组大鼠肾组织足细胞裂隙膜蛋白(Podocin)、足细胞裂孔隔膜蛋白(Nephrin)表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组大鼠肾组织PERK、ATF4、CHOP、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果:相较于正常组,模型组大鼠的肾组织显示出显著的病理性变化,肾小球基底膜显著增厚,并出现类似钉突的结构改变,同时伴有系膜基质的增生现象,沿毛细血管袢有IgG弥漫性沉积;各给药组大鼠肾组织上述病理改变有所缓解,足细胞损伤减少,IgG沉积减轻。模型组大鼠24 h-UTP水平显著高于正常组(P<0.01);各给药组大鼠24 h-UTP水平均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠24 h-UTP水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠24 h-UTP水平明显低于贝那普利组(P<0.01),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠24 h-UTP水平的降低作用具有明显的剂量依赖性(P<0.01)。各组大鼠血清BUN、Scr水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠肾组织Podocin、Nephrin蛋白表达显著低于正常组(P<0.05);各给药组大鼠上述蛋白表达均显著高于模型组(P<0.05),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠上述蛋白表达水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠上述蛋白表达水平明显高于贝那普利组(P<0.05),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠上述蛋白表达水平的升高作用具有明显的剂量依赖性(P<0.05)。模型组大鼠肾组织PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白表达水平均明显高于正常组(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显低于正常组(P<0.01);各给药组大鼠肾组织上述蛋白表达水平均较模型组显著改善(P<0.05,P<0.01),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠上述蛋白表达水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠上述蛋白表达的改善程度显著优于贝那普利组(P<0.01),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠上述蛋白表达水平的改善作用具有明显的剂量依赖性(P<0.01)。结论:丹参多酚酸盐可能通过调控PERK/ATF4/CHOP信号通路,缓解肾组织内质网应激,抑制足细胞凋亡,进而保护肾脏及延缓疾病进展。

降脂通脉饮对高血脂症大鼠血脂和PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察降脂通脉饮对高血脂症大鼠血脂及蛋白激酶样内质网激酶(PERK)/转录激活因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路的影响,探讨降脂通脉饮调节血脂的作用机制。方法将30只SD大鼠随机分为正常组、模型组及降脂通脉饮低、中、高剂量组,每组6只。正常组大鼠给予普通饲料喂养,同时灌胃生理盐水;其余组大鼠给予高脂饲料喂养,其中模型组同时灌胃生理盐水,降脂通脉饮低、中、高剂量组同时灌胃1.56 mg/(kg·d)、3.125 mg/(kg·d)、6.25 mg/(kg·d)的降脂通脉饮。连续干预8周后,生化法检测血清胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,RT-PCR和Western blot法检测颈动脉组织中PERK、ATF4、CHOPmRNA及蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平和PERK、ATF4、CHOP mRNA及蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,降脂通脉饮中、高剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平和PERK、ATF4、CHOP mRNA及蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论降脂通脉饮可能通过调节内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路而发挥降脂作用。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

基于PERK/ATF4信号通路探讨保元汤对慢性心力衰竭模型大鼠的影响

【目的】观察保元汤对慢性心力衰竭模型大鼠的治疗作用及机制。【方法】将SD大鼠随机分为空白组、模型组、保元汤组、卡托普利组、保元汤+CCT020312[蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)激活剂]组,每组15只。除空白组,其他各组大鼠采用阿霉素诱导构建慢性心力衰竭模型。给予相应的药物干预后,检测各组大鼠心功能指标[左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)及脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)],炎症相关因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)],氧化应激因子[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)],细胞凋亡相关指标[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬酶3(Caspase-3)]及PERK/转录激活因子4(ATF4)信号通路相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、PERK、ATF4、C/EBP同源蛋白(CHOP)水平变化。【结果】与空白组比较,模型组大鼠LVEDD,BNP、cTnI,TNF-α、IL-1β,MDA水平,Bax、Caspase-3,GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著升高,LVEF、LVFS,SOD及Bcl-2蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。与模型组和保元汤+CCT020312组比较,保元汤组、卡托普利组大鼠LVEDD,BNP、cTnI,TNF-α、IL-1β,MDA水平,Bax、Caspase-3,GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著降低,LVEF、LVFS,SOD及Bcl-2蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。与卡托普利组比较,保元汤组大鼠上述指标(除CHOP蛋白表达水平外)均无显著变化(P>0.05)。【结论】保元汤可以延缓慢性心力衰竭大鼠进展,其机制可能与抑制PERK/ATF4信号传导通路缓解心肌细胞凋亡,进而减轻炎症反应和氧化应激程度,从而促进心功能及心肌损伤的修复有关。

GCN2/ATF4/BNIP3通路介导线粒体自噬对子宫内膜癌细胞增殖活性的影响

探究GCN2 /ATF4 /BNIP3通路介导线粒体自噬对子宫内膜癌细胞增殖活性的影响。方法 人子宫内膜癌细胞株Ishikawa为研究对象,随机分为四组,A组:为对照,不做任何干预,B 组:线粒体诱导(10μM CCCP)、C组:线粒体诱导+GCN2过表达(10μM CCCP+GCN2慢病毒转染), D组:线粒体诱导组线粒体诱导+GCN2-siRNA(10μM CCCP+GCN2-siRNA转染)。CCK-8法检测各组细胞增殖活性,qRT-PCR和Western blot分别检测GCN2、ATF4、BNIP3、LC3、PINK1的表达水平的变化。结果 与A组相比,B组在24h、48h和72h各时间点增殖活力均明显减少(P<0.05),与B组相比,C组在各时间点增殖活力均明显增加(P<0.05),D组在各时间点增殖活力均明显减少(P<0.05)。Western blot和qRT-PCR检测结果显示,与A组相比,B组细胞LC3、PINK1蛋白和mRNA均明显增加(P<0.05),GCN2、ATF4、BNIP3蛋白和mRNA表达无明显差异(P<0.05),与B组相比,C组GCN2、ATF4、BNIP3蛋白和mRNA表达均明显增加(P<0.05),LC3、PINK1蛋白和mRNA表达均明显下降(P<0.05),D组(P<0.05),GCN2、ATF4、BNIP3蛋白和mRNA表达均明显下降(P<0.05),LC3、PINK1蛋白和mRNA表达均明显增加(P<0.05)。结论 抑制GCN2 /ATF4 /BNIP3通路可通过激活线粒体自噬抑制子宫内膜癌细胞增殖。

基于PERK/ATF4/CHOP通路探讨游泳运动干预血管性痴呆大鼠的机制

目的:基于PERK/ATF4/CHOP通路探讨游泳运动对血管性痴呆(VD)大鼠的脑保护作用。方法:选择48只SPF级雄性SD大鼠,按随机数字表法分为假手术组和实验组,分别为12、36只。实验组采用永久性结扎双侧颈总动脉法进行模型制备,按随机数字表法分为模型组、游泳运动组和药物组,每组12只。游泳运动组给予无负重游泳训练30 min/(次·d),连续4周;药物组腹腔注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠0.33 mg/(kg·d),连续4周;其余2组自由活动4周。干预4周后,采用Morris水迷宫实验观察大鼠的行为学变化;采用透射电镜观察大鼠海马CA1区神经元超微结构;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western blot法分别检测蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA水平及蛋白的相对表达量。结果:①行为学变化:与假手术组比较,模型组平均逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,游泳运动组、药物组平均逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。②神经元超微结构:模型组胞浆内细胞器数量减少,胞浆基质溶解空泡化,线粒体嵴断裂,结构不清晰,神经纤维可见坏死、溶解;与模型组比较,游泳运动组胞浆内各细胞器结构、空泡样变程度明显改善。③脑组织PERK、ATF4、CHOP mRNA水平及蛋白含量:与假手术组比较,模型组海马CA1区PERK、ATF4、CHOP mRNA水平均明显升高(P<0.05),PERK、ATF4、CHOP蛋白含量均明显升高(P<0.05);与模型组比较,游泳运动组、药物组海马CA1区PERK、ATF4、CHOP mRNA水平及蛋白含量均明显降低(P<0.05)。结论:游泳运动可保护VD大鼠脑组织,改善其认知功能;其作用机制可能与调控PERK/ATF4/CHOP通路,抑制VD大鼠海马区ERS相关蛋白PERK、ATF4、CHOP mRNA及蛋白表达有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜的保护作用

目的基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的作用。方法将48只小鼠随机分成正常组、模型组、美沙拉嗪组(阳性药,045 g/kg)和化浊解毒消痈方高、中、低剂量组(2868、1434、717 g/kg),每组8只。除正常组外,其余各组小鼠均采用25%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用7 d建立溃疡性结肠炎模型,造模后各组灌胃给予相应剂量药物。给药7 d后,分析小鼠疾病活动指数(DAI)评分,HE染色观察结肠组织病理学改变,RT-qPCR和Western blot法检测结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达。结果与模型组比较,化浊解毒消痈方各剂量组和美沙拉嗪组小鼠DAI评分降低(P<005),结肠组织病理形态得到改善,结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达降低(P<005),其中高剂量组作用与美沙拉嗪组相当。结论化浊解毒消痈方能抑制结肠上皮细胞的过度凋亡,对UC小鼠结肠损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路活化、抑制凋亡,进而修复结肠黏膜、促进溃疡愈合有关。

荭草苷抑制PERK/ATF4/CHOP通路改善癫痫小鼠认知功能障碍机制

目的探索荭草苷抑制PERK/ATF4/CHOP通路改善癫痫小鼠认知功能障碍的机制。方法腹腔注射东莨菪碱与盐酸匹鲁卡品,建立癫痫小鼠模型。小鼠随机分为5组:对照组、模型组、荭草苷(50 mg/kg)组、MK-28(PERK激活剂,1 mg/kg)组、荭草苷(50 mg/kg)+MK-28(1 mg/kg)组,分组给药后,观察小鼠癫痫发作情况;Morris水迷宫检测认知功能;TUNEL染色检测海马神经元凋亡率;ELISA测量血清COX-2、IL-18及IL-6水平;免疫印迹法检测海马组织凋亡及PERK/ATF4/CHOP通路蛋白表达。结果荭草苷组小鼠发作次数及持续时间、逃避潜伏期、海马神经元凋亡率、血清COX-2、IL-18及IL-6水平、海马组织Caspase-3、Bax、ATF4、CHOP蛋白表达及p-PERK/PERK相比模型组和荭草苷+MK-28组均降低(P<0.05),MK-28组小鼠各指标变化趋势与荭草苷组相反。结论荭草苷可通过抑制PERK/ATF4/CHOP通路激活阻止炎症,减轻癫痫小鼠海马神经元凋亡,改善其认知功能。

青蒿琥酯调节PERK/ATF4/CHOP信号通路对OGD/R诱导的心肌细胞铁死亡的影响

目的:探讨青蒿琥酯调节蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/激活转录因子-4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的心肌细胞铁死亡的影响。方法:体外培养大鼠心肌细胞H9c2构建OGD/R模型,通过CCK-8法检测0、1.0、2.5、5、10、20μmol/L青蒿琥酯处理24h后各组细胞活力,筛选合适的青蒿琥酯作用浓度。将体外培养H9c2细胞随机分为对照组、模型组、青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯高剂量组、MK-28(PERK激活剂)组、青蒿琥酯高剂量+MK-28组,除对照组外的其余各组细胞构建OGD/R模型,然后马上使用青蒿琥酯和MK-28分组处理,采用CCK-8法和流式细胞术分别检测各组H9c2细胞活力和凋亡率;ELISA检测各组H9c2细胞培养基上清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(MB)、炎性因子[前列腺素E2(PGE2)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素(IL)-1β]水平;化学荧光法检测活性氧(ROS)水平,微量法检测铁含量、丙二醛(MDA)水平,微板法检测谷胱甘肽(GSH)水平;免疫印迹实验检测各组H9c2细胞PERK/ATF4/CHOP通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组细胞活力、GSH水平降低(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较,青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯高剂量组细胞活力、GSH水平均升高(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达均降低(P<0.05);青蒿琥酯高剂量组细胞活力、GSH水平相较青蒿琥酯低剂量组进一步升高(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达较青蒿琥酯低剂量组进一步降低(P<0.05);MK-28组细胞活力、GSH水平降低(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达升高(P<0.05)。与青蒿琥酯高剂量组比较,青蒿琥酯高剂量+MK-28组细胞活力、GSH水平降低(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达升高(P<0.05)。结论:青蒿琥酯可通过抑制PERK/ATF4/CHOP信号激活而抑制OGD/R诱导的心肌细胞炎症、铁蓄积和脂质过氧化,减轻铁死亡,增强其细胞活力,缓解细胞损伤。

基于内质网应激PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨枳葛口服液含药血清对乙醇诱导BRL-3A损伤的保护作用及机制研究

目的基于内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)信号通路PERK/eIF2α/ATF4/CHOP探讨枳葛口服液含药血清对BRL-3A大鼠肝细胞损伤的保护作用及机制。方法(1)制备含药血清:SD雄性大鼠随机分为3组:枳葛口服液组、美他多辛组、正常组,分别予以枳葛口服液、美他多辛及生理盐水灌胃,连续干预5天,腹主动脉取血制备含药血清。(2)培养正常BRL-3A大鼠肝细胞,用不同浓度乙醇(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%)干预细胞24 h后用CCK-8法测定各组细胞存活率。(3)BRL-3A大鼠肝细胞分为正常组,模型组,美他多辛组,枳葛口服液低、中、高剂量组(后简称为低剂量组、中剂量组、高剂量组)。24 h后测定各组细胞上清液中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,CCK-8检测BRL-3A细胞存活率,Real-time PCR及Western blot检测各组细胞内PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路相关mRNA及蛋白表达水平。结果(1)不同浓度乙醇(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%)干预细胞24 h后,细胞存活率随着乙醇浓度的升高呈逐渐下降趋势,当乙醇浓度为5%时,细胞存活率明显下降(P<0.05),故选择乙醇浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5.0%、3.0%、5.0%进行后续实验。(2)与正常组相比,模型组上清液中GGT、LDH含量显著升高(P<0.05),PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路相关因子mRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.05),呈现明显肝损伤状态。(3)与模型组相比,枳葛口服液组及美他多辛组以上指标均呈现不同程度的降低,其中枳葛口服高剂量组效果最显著(P<0.05)。结论枳葛口服液含药血清能够改善乙醇诱导的BRL-3A大鼠肝细胞损伤,其机制可能与抑制内质网应激PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨银杏内酯B治疗代谢性脂肪性肝病的作用

目的:通过动物实验验证银杏内酯B(GB)治疗代谢性脂肪性肝病(MAFLD)的作用是否与调控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路,抑制内质网应激,减少肝细胞凋亡及炎症反应相关。方法:72只雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,辛伐他汀组,GB低、中、高剂量(GB-L、GB-M、GB-H)组(n=12),高脂高糖饲料喂养12周构建MAFLD模型(正常组除外)。治疗8周后,收集血清和肝组织。生化试剂盒检测血脂和肝脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]及肝功能[天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)];酶联免疫吸附法(ELISA)法检测血清和肝脏中的炎性因子[白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平;HE染色、油红O染色观察肝组织病理学;Western blot法检测肝脏组织中GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果:肝脏组织病理学显示,与正常组相比,模型组大鼠肝脏脂肪变性显著,与模型组相比,各治疗组脂肪变性情况有明显改善;生化指标和蛋白表达显示,与正常组相比,模型组大鼠肝脏及血清TC、TG、LDL-C、IL-1、IL-6、TNF-α,血清AST、ALT及肝脏GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax水平显著升高(P<0.05),血清、肝脏HDL-C及肝脏Bcl-2水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,各治疗组大鼠血清和肝脏TC、TG、LDL-C、IL-1、IL-6、TNF-α,血清ALT、AST及肝脏GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax水平显著降低(P<0.05),肝脏Bcl-2水平显著升高(P<0.05),与模型组相比,GB-H组大鼠血清和肝脏HDL-C水平明显升高(P<0.05),GB-L组和GB-M组HDL-C水平呈上调趋势,但这2组相较于模型组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GB对MAFLD具有治疗作用,其作用机制可能与调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路抑制内质网应激,缓解肝细胞凋亡及炎症反应有关。

不同运动对2型糖尿病小鼠骨中cAMP/CREB/Atf4途径及骨形成的影响

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)小鼠骨形成变化及不同运动对T2DM小鼠骨中环磷酸腺苷(c AMP)/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)/激活转录因子4(ATF4)途径和骨形成的影响。方法:40只4周龄C57BL/6雄性小鼠,适应性喂养1周后随机分为正常对照组(ZC,10只)和T2DM造模组(30只)。T2DM造模组小鼠造模成功后随机分为T2DM对照组(TC组,9只)、T2DM游泳组(TS组,9只)和T2DM下坡跑组(TD组,9只)。利用游泳和下坡跑对TS组和TD组小鼠进行8周训练。结束后,取小鼠血清并利用ELISA法检测c AMP浓度;取右侧股骨并利用RT-PCR法检测CREB、ATF4、骨钙素(OC)、骨钙蛋白(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的m RNA表达;取右侧胫骨并利用West-blotting法检测CREB蛋白表达;取小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并诱导其向骨细胞(OB)分化,利用碱性磷酸酶(ALP)染液对OB染色;取左侧股骨并用Micro-CT对股骨远端BMD进行扫描。结果:与ZC组相比,TC组c AMP浓度下降,CREB、ATF4、OC、OCN和BSP m RNA及CREB蛋白表达均显著下降(P<0.05或P<0.01),OB成骨能力和BMD显著下降(P<0.01)。与TC组相比,TS组OC和OCN m RNA表达上调(P<0.05或P<0.01),OB骨形成能力增强;TD组c AMP浓度下降,CREB、ATF4、OC和OCN m RNA及CREB蛋白表达均显著上调(P<0.05或P<0.01),OB骨形成能力和BMD显著增加(P<0.01)。与TS组相比,TD组c AMP浓度升高,CREB、ATF4和OC的m RNA表达显著上调(P<0.05或P<0.01),OB骨形成能力增强。结论:2型糖尿病小鼠骨形成代谢被抑制;下坡跑通过激活2型糖尿病小鼠骨中c AMP/CREB/ATF4途径,促进成骨细胞分化及骨形成能力,提高骨密度,且其作用效果优于游泳。

基于PERK/ATF4/CHOP通路探讨普伐他汀对棕榈酸诱导心肌细胞损伤的影响

有研究报道,棕榈酸(palmitic acid,PA)通过上调内质网凋亡信号通路相关蛋白PERK、ATF4、CHOP表达水平诱导H9c2心肌细胞凋亡[1]。普伐他汀(pravastatin)属于他汀类调脂药物,可减轻心脏微血管内皮细胞氧化应激损伤,有效降低心血管疾病死亡率[2-3],但pravastatin以何种途径参与心肌细胞脂毒性损伤的调控机制研究较少。本研究将探讨Pravastatin对高脂造成心肌细胞凋亡的保护作用及其与内质网凋亡通路中PERK/ATF4/CHOP途径的相关性。

耐力训练对心肌PERK/eIF2α/ATF4信号通路激活的影响

探讨内质网应激机制在耐力训练对心肌功能影响过程中的作用。方法:通过建立不同运动方式、运动训练状态和不同恢复阶段的动物模型,测定心肌中与内质网应激相关的信号通路PERK/eIF2α/ATF4激活水平的变化。结果:无论是急性运动,还是4或10周的递增负荷耐力训练,都没有显著激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路,但是以延长运动时间为特征的耐力训练能够激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路。结论:以递增运动时间为特征的耐力训练能够激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路,该通路的激活对运动心肌的结构和功能变化可能产生影响。

基于PERK/ATF4/CHOP信号通路探讨瑞香素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

目的探讨瑞香素(daphnetin,DAP)对人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RA-FLS)的作用及其与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)PERK/ATF4/CHOP信号通路的关系。方法RA-FLS细胞培养,免疫荧光法检查波形蛋白(vimentin)和CD68对细胞进行鉴定;CCK-8检测(0、5、10、20、30、40、50、60、70)mg·L^(-1) DAP对RA-FLS细胞增殖活性的影响,根据增殖活性将实验分为空白组(Blank)、低剂量组(L-DAP)、中剂量组(M-DAP)、高剂量组(H-DAP)以及高剂量+抑制剂4-PBA组(H-DAP+4-PBA);ELISA检测TNF-α、IL-6水平;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell及划痕实验检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测细胞中与内质网应激相关蛋白GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Caspase-12、C-caspase-12、Bcl-2表达。结果CCK-8结果显示,与0 mg·L^(-1) DAP组比较,20~70 mg·L^(-1) DAP中各组增殖活性均差异具有显著性(P<0.05),组间比较后0、20、40、60 mg·L^(-1) DAP对应的细胞增殖率差异具有统计学意义(P<0.05),以此浓度分别作为空白、低剂量、中剂量、高剂量组以及高剂量+4-PBA实验分组依据;DAP可成浓度依耐性抑制RA-FLS细胞炎症因子IL-6、TNF-α释放,减弱细胞侵袭能力,促进细胞凋亡,上调PERK、p-PERK、ATF4、GRP78、CHOP及Caspase-12及C-caspase-12蛋白表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平。另一组实验证明,高剂量DAP+4-PBA可上调IL-6、TNF-α表达以及细胞侵袭,抑制细胞凋亡及ERS相关蛋白表达。结论DAP可通过激活PERK/ATF4/CHOP信号通路调节相关炎症因子分泌,抑制RA-FLS细胞增殖及侵袭,诱导细胞凋亡,有望成为治疗RA的潜在途径。

PERK/ATF4/CHOP通路对BCG诱导THP-1细胞NLRP3炎性小体活化的调控作用

旨在探讨牛分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1细胞后PERK/ATF4/CHOP通路对NLRP3炎性小体的调控作用。在BCG单独感染或与PERK小干扰RNA共处理THP-1细胞后,采用qRT-PCR和Western blot方法检测NLRP3炎性小体相关分子和PERK/ATF4/CHOP通路标志性分子在mRNA、蛋白水平的表达;在BCG单独感染或与PERK抑制剂GSK2656157共处理THP-1细胞后,分别采用qRT-PCR和Western blot方法检测NLRP3炎性小体相关分子和PERK/ATF4/CHOP通路标志性分子在mRNA、蛋白水平的表达,采用ELISA方法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的释放量,采用CCK-8方法检测THP-1细胞活率,采用免疫荧光检测NLRP3与ASC的共定位。结果表明:在BCG单独感染THP-1细胞不同时间后,PERK、NLRP3、ASC和Caspase-1在蛋白水平的表达均随感染时间延长而升高,且在24 h达到最高(P<0.001),IL-1β和IL-18的释放随时间递增,24 h达到最高(P<0.001)。在BCG单独感染或与PERK小干扰RNA共处理THP-1细胞24 h后,与未感染对照组相比,siNC+BCG感染组NLRP3、ASC、Caspase-1、PERK、ATF4、CHOP分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.001)上调,而siPERK+BCG感染组与siNC+BCG感染组相比,NLRP3等关键分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著下调(P<0.01,P<0.001);在BCG单独感染或与GSK2656157共同作用THP-1细胞24 h后,与未感染对照组相比,BCG感染组NLRP3、ASC、Caspase-1、PERK、ATF4、CHOP分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,IL-1β和IL-18的释放极显著增加(P<0.001),细胞活率极显著下调(P<0.001),而BCG+GSK2656157感染组与BCG单独感染组相比,上述分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著下调(P<0.01),IL-1β和IL-18的释放显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)减少,细胞活率显著上调(P<0.05),免疫荧光的结果显示NLRP3与ASC存在共定位,且GSK2656157可以极显著抑制BCG感染引起的NLRP3和ASC的表达上调(P<0.001)。以上研究结果表明,PERK/ATF4/CHOP通路对BCG感染巨噬细胞后NLRP3炎性小体的活化具有调控作用。

miR-193a-3p通过LGR4/ATF4信号的上调促进成骨细胞分化

目的:探讨miR-193a-3p通过LGR4/ATF4信号的上调促进成骨细胞分化的作用及分子靶向机制。方法:髂前上棘骨穿刺术取骨质疏松患者骨髓组织3~5 ml,建立体外骨髓间充质干细胞细胞模型(hBMSCs),将hBMSCs诱导分化为成骨细胞,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定miR-193a-3p的表达水平。过转染AgomiR-193a-3p和AntagomiR-193a-3p的BMSCs,检测miR-193a-3p对碱性磷酸酶(ALP)活性和基质矿化的影响。检测过表达miR-193a-3p对成骨细胞标记基因Runx2的作用。生物信息学分析方法寻找miR-193a-3p的候选靶基因LGR4。荧光素酶报告试验验证miR-193a-3p针对LGR4。检测过表达miR-193a-3p对LGR4表达的调节作用。检测过表达miR-193a-3p对调节骨信息的LRG4下游靶点ATF4表达的调节作用。结果:①miR-193a-3p在成骨细胞分化过程中在第1天,第7天和第14天以时间依赖性的方式显著下调。②转染AgomiR-193a-3p的BMSCs水平上调,而转染AntagomiR-193a-3p的BMSCs水平下调。③miR-193a-3p的过表达下调了BMSCs的ALP活性,抑制了BMSCs的基质矿化。④miR-193a-3p的过表达下调Runx2的表达。⑤生物信息学分析方法发现LGR4 mRNA的3′-UTR对miR-193a-3p具有保守的结合位点。LGR4是骨形成的关键调节因子,被预测为miR-193a-3p的潜在靶基因。⑥荧光素酶报告试验表明,miR-193a-3p的过表达显著降低了含有WT结合位点的LGR43′-UTR荧光素酶报告者的荧光素酶活性;miR-193a-3p的过表达对含有miR-193a-3pMT结合位点的LGR43′-UTR荧光素酶记者没有明显影响。⑦miR-193a-3p的过表达显著下调LGR4的表达。结论:miR-193a-3p可通过LGR4/ATF4信号的上调促进成骨细胞分化。可通过调控其表达干预骨质疏松的发生和治疗。