pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型

pH值是影响酶催化反应速率的重要因素之一,建立动力学模型有助于定量分析酶解反应。经典的“三状态”动力学模型未考虑pH值对底物解离状态的影响及产物抑制的作用,该文对“三状态”动力学模型进行改进。在一系列假设基础上提出绿色木霉产纤维素酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的反应机理,建立了pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的动力学模型,推导出反应速率表达式。Lineweaver-Burk作图法求得内切β-葡聚糖苷酶水解CMC-Na在不同pH的动力学参数:K′m和V′max,试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合,从而模型得以验证。

绿色木霉MJ1产内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用KTAUPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后酶的比活力提高了28·6倍,回收率为19·7%。SDS-PAGE后经BIO-RAD凝胶成像系统分析该内切酶的分子量为64·7kD。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度53℃,最适pH为4·2,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为1·230×10-2g/mL、2·396×10-2mg/(mL·min)。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为2·2mmol/L时分离效果达到最佳。

一株绿色木霉产外切β-葡聚糖苷酶条件及其纯化与性质的研究

从树林中腐烂木块上采集并筛选出一株分泌外切β葡聚糖苷酶(exo1,4βD glucanaseorcellobiohydrolase,CBH)的绿色木霉菌株.在100mL的锥形瓶中装入40mL培养基的产酶状况最好,其通气量最佳,培养液初始pH为8时绿色木霉产生的CBH活力最高.随绿色木霉生长时间的延长,CBH的活力与培养基中的葡萄糖含量呈交替的一高一低的波浪状变化.通过硫酸铵分部分离、葡聚糖G100凝胶过滤、DEAE纤维素52阴离子交换柱层析等方法使绿色木霉所产的CBH达到了电泳纯,纯化倍数为16.3.CBH的反应最适温度为60℃,最适pH为6.0,Km(底物为羧甲基纤维素钠)为17.34mg/mL.

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。

康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

康氏木霉GIMP3.444经摇瓶发酵,获得分泌到胞外的纤维素酶,粗酶液经(NH4)2SO4分级沉淀、Sephacryl S200凝胶过滤层析、DEAE Sepharose FF离子交换层析及Octrl Separose CL-4B疏水层析分离纯化出一种内切型的β-葡聚糖苷酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,BIO-RAD分析相对分子量为61.8 ku。该内切β-葡聚糖苷酶的最适反应温度为55℃,最适反应p H值为4.4,作用于羧甲基纤维素钠时,Lineweaver-Burk法求得Km、Vmax分别为4.81 mg/m L、2.48 mg/(min·m L)。

1株产纤维素酶细菌的内切-β-葡聚糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

为对1种细菌来源的内切-β-葡聚糖苷酶进行分离纯化和酶学性质研究,利用盐析沉淀、凝胶层析、疏水层析和弱阳离子交换色谱等对细菌菌株DM-4所产内切-β-葡聚糖苷酶进行了分离纯化,利用SDS-PAGE电泳对其纯度和分子量进行检测,考察温度和pH值对酶活力的影响,最后计算酶的反应动力学常数。结果显示,经分离纯化,获得2个酶活组分CMC酶Ⅰ和酶Ⅱ,其纯化倍数分别为45.94倍和32.27倍,回收率分别为14.66%和8.33%。CMC酶Ⅰ和酶Ⅱ分子量分别为38.99、45.53 ku,其最适作用温度分别为55~60℃和55℃,最适pH值均为7.5。温度低于70℃时,2种酶组分均对热稳定,并在pH值为6.0~8.0范围内具有良好稳定性。CMC酶Ⅰ的K_(m)为2.55 g/L,V_(m)为37.59μg/(min·mL);CMC酶Ⅱ的K_(m)值为4.37 g/L,V_(m)为28.82μg/(min·mL)。结果表明,采用盐析沉淀、凝胶层析、疏水层析和弱阳离子交换色谱多种分离技术对菌株DM-4所产内切-β-葡聚糖苷酶具有良好的分离纯化效果,经凝胶电泳检测,酶组分达电泳级纯度。酶学性质表明,菌株DM-4所产的2种CMC酶组分均为中性偏碱性纤维素酶,这与霉菌来源的纤维素酶有所不同。

一种康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为获得康氏木霉(Trichodermakoningii)内切β-葡聚糖苷酶组分,并研究其酶学性质,通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析对康氏木霉GIMP3.444纤维素酶主要组分进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测蛋白质纯度和分子量,MALDI-TOFMS鉴定蛋白质种类。结果显示,从康氏木霉所产的纤维素酶系中分离纯化获得一种内切β-葡聚糖苷酶组分,相对分子质量为44 600,酶的比活力为19.65 U/mg。该内切酶的最适反应p H值为4.5,最适反应温度为55℃。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物时,酶的米氏常数(Km)为7.22 mg/ml。不同金属离子对酶活性影响不同,其中Ca2+(0.3 mmol/L)对酶的抑制作用较强,抑制了近35%的活力。通过MALDI-TOFMS鉴定及数据库分析,确定该酶为一种新的内切β-葡聚糖苷酶组分。

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了绿色木霉WS-71纤维素酶系中的内切型β-1,4-葡聚糖苷酶组分。通过SDS-PAGE电泳测得分子量为41.8kD,该酶组分的最佳水解温度是50℃,最适pH为4.6。酶在温度40～70℃和在pH4.0￣5.0的区间稳定。Fe3+,K+,Ca2+,Mg2+,Mn2+对酶解有促进作用,Hg2+,Cu2+,Zn2+和EDTA对酶解有不同程度的抑制作用。作用于羧甲基纤维素钠的Km值为16.78mmol/L,Vmax为5.612×10-4mol/min,Kcat为6.97S-1。

从黑曲霉发酵粉中分离纯化一种内切β-葡聚糖苷酶

通过硫酸铵分级沉淀 ,CM -SephadexC - 2 5 ,DEAE -SephadexA - 5 0 ,POROS 2 0HQ离子交换色谱分离方法 ,从黑曲霉发酵粉中分离纯化了一种新的内切 β -葡聚糖苷酶 .该酶在还原条件下分子量为 39.2kD ,最适pH为 4.0 ,最适温度为 5 5℃ ,Km 为 7.41mg mL .

生物炭-牛粪堆肥中产β-葡聚糖苷酶微生物群落应答碳代谢抑制效应

【背景】在高浓度葡萄糖引起的碳代谢抑制效应下,产β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase)功能微生物群落为适应碳代谢压力的变化,会差异化表达糖耐受和非糖耐受的功能基因。在堆肥中添加生物炭可以改变微生物生存的环境,进而影响微生物群落的组成与功能。【目的】分析在不同碳代谢压力下添加生物炭对产β-葡聚糖苷酶功能微生物群落的结构组成与功能的影响。【方法】在生物炭牛粪-稻草堆肥中添加葡萄糖、纤维二糖及β-葡聚糖苷酶抑制剂,构建不同的碳代谢压力。以细菌来源GH1家族的β-葡聚糖苷酶基因为分子标记基因构建基因克隆文库。同时测定羧甲基纤维素酶酶活和β-葡聚糖苷酶酶活。【结果】放线菌、变形菌和拟杆菌是功能微生物群落中的优势菌群。其中,CL处理组变形菌数量有所下降,在添加了抑制剂的处理组中,拟杆菌的数量明显上升。高浓度葡萄糖显著抑制了羧甲基纤维素酶酶活,但对β-葡聚糖苷酶酶活影响不大,其中低浓度纤维二糖的处理可以显著诱导β-葡聚糖苷酶活性。GHCH处理组中β-葡聚糖苷酶表现出高浓度葡萄糖激活特性。【结论】添加生物炭未明显影响参与纤维素降解的功能微生物群落对碳代谢抑制效应的应答。与自然堆肥相比,在添加了生物炭的堆肥中,产β-葡聚糖苷酶的微生物群落对添加了高浓度葡萄糖引起的碳代谢抑制效应或添加了低浓度纤维二糖的诱导效应更敏感。

利用瞬间表达技术分析小麦几丁质酶和β-1,3葡聚糖苷酶基因的抗病性功能

几丁质酶基因和-β1,3葡聚糖苷酶基因是植物抗病反应过程中的两类重要的病程相关蛋白(PR)基因。为了快速准确地评价此类基因组成性表达后的抗病效果及在分子育种上的应用价值,利用瞬间表达技术分别在感病小麦品种离体叶片表皮细胞中过量表达1个小麦几丁质酶基因Cht4和2个小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2和G lb3s6,并以GUS基因的共表达标识阳性转化细胞。基因枪轰击后高密度接种白粉病菌孢子,40h后观察转化阳性表皮细胞及其表面孢子的发育,并以阳性转化细胞中白粉病菌成功侵入的细胞所占比例(侵入频率)为指标分析目标基因的表达对白粉病菌入侵及吸器形成产生的影响(对照为单独导入GUS基因的表皮细胞)。结果表明,小麦几丁质酶基因Cht4(侵入频率为18.3%,对照为25.04%)和小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2(侵入频率为19.63%,对照为24.63%)在感病小麦品种叶片表皮细胞中的瞬间表达,对白粉病菌侵入和吸器形成均有抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性。

三七茎叶总皂苷酶转化产物和C-K的抗肿瘤作用

目的:研究三七茎叶总皂苷酶转化产物和人参皂苷化合物K(C-K)的抗肿瘤作用。方法:利用β-葡聚糖苷酶转化三七茎叶总皂苷,转化产物经大孔吸附树脂富集和纯化,硅胶柱层析及制备薄层层析分离纯化后得到C-K。观察酶转化产物和C-K对S180肿瘤细胞生长的抑制作用及对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响。结果:三七茎叶总皂苷酶转化产物和C-K的抑瘤率分别为41.8%和44.7%;对艾氏腹水癌小鼠延长存活期分别为3.9d和4.6d。结论:三七茎叶总皂苷酶转化产物和C-K具有较强的抗肿瘤作用。

Enzymatic Transformation of Notoginsenoside Fe by β-Glucanase

Aim An industrial enzyme β-glucanase was used to transfortn notoginsenoside Fe for the first time. Methods Notoginsenoside Fe was isolated from the leave saponin of Panax notoginseng （Burk.） Chen FH. The enzymatically transformed compounds were detected by HPLC and two transformed compounds were identified as 20 （S） -protopanaxadiol-20- O- α-L-arabinofuranosyl （ 1→6 ） - β-gluco- pyranoside, ginsenoside-Mc） and 20（S）-protopanaxadiol-20-O-β-D-glucopyranoside compound-K （C-K） respectively on the basis of their ^1H NMR and ^13 C NMR spectral data. Results Based on the enzymolytic kinetic curve, the transformation rate of notoginsenoside Fe reached 95% after 24 h. Conclusion The enzymatic transformation pathway of notoginsenoside Fe by β-glucanase has been proposed as notoginsenoside Fe→ginsenoside Mc→C-K.

一株木霉菌(Trichoderma sp.)TY2纤维素酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

【目的】筛选高活力纤维素酶产生菌,高效利用纤维素资源。【方法】从朽木和和纸浆样品中分离筛选出一株产纤维素酶活较高的菌株TY2。对其形态和18SrDNA特征序列分析鉴定为木霉菌(Trichodermasp.)。对菌株发酵条件及酶学特性进行研究。【结果】TY2菌株的最佳产酶条件为:1%滤纸+2%麸皮+0.5%葡萄糖为碳源,0.5%蛋白胨为氮源,起始pH5.0,温度28℃,200r/min,5d,其CMCase和FPase活力分别达412.5和100.3U/mL。经分离纯化出TY2菌株内切β-葡聚糖苷酶。内切β-葡聚糖苷酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.6,在50℃以下,pH3.0～5.0,酶活性稳定,且在80℃仍具有降解CMC-Na的效果。同时研究发现铜离子、锌离子、钾离子和钠离子对内切β-葡聚糖苷酶的酶活有促进作用,而汞离子有明显的抑制作用。【结论】所筛选的TY2菌株具有潜在的工业应用价值。

黑曲霉产纤维素酶系中内切酶的纯化和性质

目的从黑曲霉产纤维素酶系中分离纯化一种内切酶,并对其性质进行研究。方法硫酸铵盐析、Sephadex G100脱盐、DEAE FF弱阴离子交换柱层析,再经SDS-PAGE电泳标定其纯度及分子量。结果从黑曲霉发酵粉中分离纯化出了一种电泳纯的内切β-葡聚糖苷酶,SDS-PAGE分析该内切酶的分子量为26.4kD。结论实验采用的分离纯化方案稳定可行,酶学性质表明,该酶的最适反应温度是55℃,最适pH为4.8。