重组人β-防御素-2基因的植物表达载体的建立

目的 运用植物转基因技术 ,探索构建表达人类 β-防御素 - 2 ( h BD- 2 )的植物生物反应器的可能性及技术路线。方法 将 C端带 myc和 6x His双标记的重组 h BD- 2基因插入植物真核表达载体 p CAMBIA13 0 4中 ,构建 C端带 m yc和 6x His双标记的重组 h BD- 2植物真核表达载体 rp CAMBIA13 0 4/ h BD- 2 / His。利用此载体转化根癌农杆菌 L BA44 0 4,经卡那霉素进行抗性基因筛选和 PCR检测 ,确定根癌农杆菌的阳性克隆。重组 h BD- 2通过转化阳性的根癌农杆菌被导入小麦幼胚愈伤组织细胞 ,经潮霉素进行抗性基因筛选 ,获得抗性愈伤组织。结果 酶切分析、PCR验证和 DNA测序等证据表明 :C端带 m yc和 6x His双标记的重组 h BD- 2已被正确地插入 p CAMBI-A13 0 4载体中 ,并位于 Ca MV 3 5 S与 Nos终止子之间 ,提示重组 h BD- 2 / His基因的植物表达载体 rp CAMBI-A13 0 4/ h BD- 2 / His已被成功构建。卡那霉素抗性基因筛选和 PCR检测显示 :rp CAMBIA13 0 4/ h BD- 2 / His已成功转化根癌农杆菌 L BA44 0 4,阳性克隆菌株已获得。潮霉素抗性筛选结果提示 :h BD- 2基因被导入小麦幼胚愈伤组织细胞。结论 本研究为进一步培育 h BD-

重组人β-防御素-2基因在昆虫细胞的转染表达

目的 探索杆状病毒表达系统 (BEVS)高效表达人 β-防御素 - 2 (h BD- 2 )的可行性及其技术路线。方法 利用特异性引物经 PCR扩增 ,从重组质粒 rpc DNA3.1/h BD- 2 /myc- His中扩增出完整重组 h BD- 2 /His基因片段。将此片段插入转移质粒 p Ac GHL T- A的多克隆位点中 ,构建成重组转移载体 rp Ac GHL T- A/h BD- 2 /His。用该重组转移载体和多角体病毒 Ac NPV DNA共转染草地夜蛾细胞 (Sf2 1) ,二者在细胞内经过同源重组形成重组病毒 r Ac NPV/h BD- 2 /His。用终点稀释分析法检测感染上清重组病毒的感染效率。采用 Western印迹法通过特异性抗 - His抗体检测细胞及上清 h BD- 2 /His的表达。结果 目的基因 h BD- 2 /His正确地插入 BEVS系统的转移载体。经 rp Ac GHL T- A/h BD- 2 /His和 Ac NPV DNA共转染的 Sf2 1细胞有较高滴度的重组病毒 r Ac NPVh BD- 2 /his存在。被共转染的 Sf2 1细胞的可溶性蛋白 ,在相对分子质量约 4 7.5× 10 3处有强反应条带显示 ,其大小与根据测序结果所推测的 h BD- 2融合肽相对分子质量接近。培养上清分别在相对分子质量约 4 0× 10 3和 30× 10 3处有强反应条带显示。结论 可利用 BEVS系统作为高效表达重组 h BD- 2的生物反应器。

大肠杆菌感染对大鼠肺组织β-防御素-2基因表达的负相调节作用

目的 :探讨细菌对大鼠 β -防御素 - 2 (rBD - 2 )基因的表达调控。 方法 :将大肠杆菌E .coliML -35p和绿脓杆菌ATCC 2 785 3大鼠气管内接种 ,于 2 4h后提取肺组织RNA ,用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)法和Northernblot检测大鼠 β -防御素 - 2基因的表达变化。 结果 :气管内接种大肠杆菌 2 4h后使大鼠肺组织 β -防御素- 2mRNA的表达受到显著抑制 ,绿脓杆菌对其基因的表达却没有抑制作用。结论 :大肠杆菌感染可负相调节大鼠肺组织rBD - 2mRNA的表达。

人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析

目的 :对在LPS、TNF α刺激下 ,人 β 防御素 2基因 5′ 端转录调控机制进行初步分析。 方法 :将HBD 2基因 5′ 端上游序列连接入无启动子的pEGFP 1质粒 ,构建了系列 5′端缺失的 pEGFP 1 /HBD 2报告质粒。pEGFP 1 /HBD 2质粒转染细胞后给予LPS、TNF α刺激 ,用RT PCR检测 pEGFP的mRNA浓度。 结果 :显示HBD 2基因上游 2 41段有较强的启动子活性 ;LPS、TNF α刺激后 ,即使上游序列缩短至 2 41位点时 ,报告基因 pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD 2基因上游 2 41区域含有LPS、TNF α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明 2 3 2 / 2 2 2区域有一同源性极高的NF kB结合元件 ,提示NF kB结合元件可能调控HBD