人β-防御素3水凝胶治疗大鼠牙周炎

背景:既往研究显示人β-防御素3具有显著的抗真菌、抗细菌和抗病毒活性,并且在连接先天和获得性免疫应答中起到重要的桥梁作用。目的:观察人β-防御素3水凝胶治疗大鼠牙周炎的效果。方法:以泊洛沙姆188与407为基质,采用冷溶法构建空白水凝胶,将人β-防御素3与该水凝胶混合制备人β-防御素3水凝胶。将25只SD大鼠随机分为5组,每组5只:健康组不做任何处理,牙周炎组、空白水凝胶组、盐酸米诺环素组、载药水凝胶组采用正畸结扎钢丝法构建牙周炎模型,造模8周后于颊侧与腭侧牙周袋内分别注射空白水凝胶、盐酸米诺环素、人β-防御素3水凝胶,1次/周,连续给药4周后进行相关检测。结果与结论:①与健康组比较,牙周炎组大鼠牙周菌斑指数、牙龈出血指数及牙周探诊深度均增加(P<0.01);与牙周炎组比较,盐酸米诺环素组与载药水凝胶组大鼠牙周菌斑指数、牙龈出血指数及牙周探诊深度均减少(P<0.05);②大鼠脏器苏木精-伊红染色显示载药水凝胶无毒性作用;③体视显微镜与Micro CT扫描显示,与健康组比较,牙周炎组大鼠牙根暴露及釉牙骨质界-牙槽嵴顶距离均增加(P<0.05);与牙周炎组比较,盐酸米诺环素组与载药水凝胶组大鼠牙根暴露、釉牙骨质界-牙槽嵴顶距离均减少(P<0.05);④苏木精-伊红、Masson及抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,牙周炎组、空白水凝胶组大鼠牙周炎症明显、纤维结构混乱、破骨细胞活跃,盐酸米诺环素组、载药水凝胶组大鼠牙周炎症水平降低、纤维排列较规则、破骨细胞减少;⑤qRT-PCR检测显示,与健康组比较,牙周炎组大鼠牙龈组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达升高(P<0.05);与牙周炎组比较,盐酸米诺环素组、载药水凝胶组大鼠牙龈组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达降低(P<0.05);⑥结果表明,人β-防御素3水凝胶可通过降低炎症因子的相对表达及抑制破骨来减轻大鼠牙周组织炎症。

人β-防御素3融合细菌膜穿透增加蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:探讨采用酵母表达系统进行人β-防御素3(hBD3)与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性.方法:将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联,克隆于酵母表达载体pPICZαB中,电转导入X-33毕赤酵母菌,经重组酵母基因组PCR和表型鉴定获得阳性克隆,对阳性克隆进行甲醇诱导表达,上清进行目的蛋白纯化和Western Blot鉴定.结果:重组载体经酶切和测序证实序列正确,重组X-33-pICZαB-hBD3-BPI克隆经甲醇诱导24h后,上清SDS-PAGE电泳显示有目的蛋白表达,Western Blot分析表明重组蛋白抗人hBD3和BPI均阳性,该目的蛋白依次通过疏水色谱、离子交换色谱纯化,蛋白纯度达到89%.结论:采用毕赤酵母系统融合表达hBD3和BPI是可行的.

人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建

目的 克隆人 β 防御素 3 (hβD 3 )cDNA并构建其原核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法 从人扁桃体组织中提取总RNA ,经RT PCR扩增编码hβD 3成熟肽的cDNA序列 ,将其克隆至pUC18载体进行序列测定 ,然后构建于新型原核表达载体pQE 80L中。结果 RT PCR扩增得到约 13 5bp的目的DNA片断 ,序列分析与GenBank中报道的编码hβD 3成熟肽的cDNA序列完全一致。 结论 hβD 3cDNA的克隆和原核表达载体的构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。

重组人β-防御素3对临床分离多药耐药菌的抗菌活性分析

目的研究重组人β-防御素3(rhBD-3)对临床分离的多药耐药菌株杀菌活性。方法采用比浊法测定rhBD-3对从烧伤科病房分离的多药耐药菌株-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌活性。结果rhBD-3对所有测试病原菌均具有抑菌作用,其作用具有剂量依赖性;对革兰阳性菌的最低抑菌浓度为4μg/ml,对革兰阴性菌的最低抑菌浓度为8μg/ml。结论rhBD-3对临床分离的多药耐药菌株具有抑菌活性,对解决临床病原菌抗菌药物耐药问题具有潜在的应用前景。

重组人β-防御素3对铜绿假单胞菌生物膜结构影响的初步研究

目的研究重组人β-防御素3(rhBD-3)对铜绿假单胞菌(PA)形成生物膜的体外抑制作用。方法平板培养法培养PA,得到早期和成熟期生物膜;琼脂糖弥散抗菌法测定最低抑菌浓度(M IC);扫描电镜(SEM)观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果 rhBD-3对PA的M IC值是64μg/m l。rhBD-3作用后8、16、24 h,膜片载体表面PA活菌黏附量减少,且随着rhBD-3浓度的增高,活菌群数量进行性减少;SEM观察见rhBD-3组少量散在的游离细菌,有少量小斑片状多糖复合物,而空白对照组可见大量分布均匀的微菌落和游离细菌及多糖复合物交联。结论 rhBD-3可以抑制PA的BF形成,并对早期和成熟期BF具有破坏作用。

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P<0.01),对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P<0.01),但对蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。以0.5%乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28.1%。控制好诱导条件,乳糖与IPTG的诱导效果基本相当。

人β-防御素3基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

以质粒pPIC9K-hBD3为模板,扩增得到一段上游带信号肽因子(α-factor)的人β-防御素-3(hBD-3)基因,克隆至酿酒酵母穿梭质粒pYES2中,构建了酿酒酵母表达载体pYES2-α-factor-hBD3(pYα-hBD3)。将重组质粒转化至Saccharomyces cerevisiaeINVSC1中,鉴定阳性重组子,经2%半乳糖诱导表达。实验发现表达所得hBD-3对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC10231)具有明显的抑菌活性。hBD-3基因片段在酿酒酵母中的表达,为进一步探讨hBD-3的生物活性及防御素应用安全性打下基础。

β-防御素3调节人牙龈成纤维细胞分泌MMP-1及PGE_2的信号通路研究

目的:研究β-防御素3(HBD3)调节人牙龈成纤维细胞(HGFs)分泌MMP-1和PGE2的信号通路。方法:取P5代HGFs接种于96孔板,并随机分为1个对照组(HBD3)和7个实验组(HBD3+antiTLR2、HBD3+anti-TLR4、HBD3+SB203580、HBD3+PD98059、HBD3+SP600125、HBD3+LY294002、HBD3+SC3060)。各实验组分别以相应的信号通路抑制剂anti-TLR2、anti-TLR4预处理30 min,SB203580、PD98059、SP600125、LY294002、SC3060预处理60min,然后各组再加入100μL浓度为1μg/mL的HBD3进行培养,12h后收集各组培养上清液,ELISA法检测MMP-1及PGE2浓度。结果:信号通路抑制剂SB203580、PD98059、SC3060、anti-TLR2各组MMP-1的浓度(ng/mL)分别为3.660±0.286、3.410±0.554、4.435±0.235、3.995±0.612,低于对照组(5.128±0.256)ng/mL(P<0.05);信号通路抑制剂SP600125、SC3060两组PGE2浓度(pg/mL)分别为146.518±15.800和180.349±5.490,低于对照组(209.213±7.284)pg/mL(P<0.05)。结论:HBD3调节HGFs分泌MMP-1涉及TLR2、P38、ERK、NF-κB信号途径;调节PGE2分泌涉及JNK和NF-κB信号途径。

人β-防御素3在体外对小鼠淋巴细胞增殖反应的影响

为了更充分地阐明人β-防御素3(HBD3)对淋巴细胞增殖反应的影响,试验先用CCK-8对不同浓度的刀豆蛋白A(ConA)诱导的淋巴细胞增殖反应进行检测,进而筛选出最适ConA浓度,然后再用CCK-8检测不同浓度(1,10,100,500,1 000 ng/mL)的HBD3协同最适ConA浓度诱导淋巴细胞增殖反应。结果表明:ConA的最适浓度为2μg/mL;浓度为1,10,100 ng/mL的HBD3可以显著促进2μg/mL ConA诱导的淋巴细胞增殖反应,但是伴随着HBD3浓度的不断升高这一作用逐渐降低,当浓度为500 ng/mL和1 000 ng/mL时表现出一定程度的抑制作用。说明HBD3在一定浓度范围内对ConA诱导的淋巴细胞增殖反应具有促进作用,而超出这一浓度范围就会出现抑制作用。

β-防御素3在人精子上的表达及功能研究

目的:探讨附睾上皮分泌的β-防御素3(HBD-3)在人精子上的表达和功能,以及是否参与弱精子症的发生。方法:采用间接免疫荧光染色和Western blot检测HBD-3在人精子的定位和表达;采用计算机辅助精子分析(CASA)检测HBD-3是否参与精子活力和前向运动能力。结果:HBD-3在弱精子症精子的表达量较正常生育组下调。精子上HBD-3表达水平与精子活力呈正相关性。抗HBD-3抗体将干扰正常精子活力,而rHBD-3可改善弱精子症精子的活力。结论:在男性生殖系统中,精子表面HBD-3参与精子活力和前向运动能力发生。本研究为男性不育症提供新型诊断靶点和治疗策略。

丁酸钠与VD_(3)对IPEC-J2细胞β-防御素3mRNA表达的协同作用

研究旨在验证丁酸钠与维生素D_(3)(VD_(3))联合使用对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)β-防御素-3(pBD3)mRNA表达的协同作用。试验分别设置丁酸钠组、VD_(3)组、丁酸钠与VD_(3),联合使用组。使用荧光定量PCR检测各试验组对猪小肠.上皮细胞pBD3基因表达水平的影响。结果表明,不同浓度丁酸钠均能上调β-防御.素-3mRNA的表达,表达水平在一定浓度范围与添加浓度呈正相关,VD_(3),对β-防御素-3mRNA的表达作用影响不明显,丁酸钠与VD_(3)联合使用对IPEC-J2细胞β-防御素-3mRNA表达具有协同作用。

人β-防御素3与杀菌/通透性增加蛋白重组腺病毒载体及其转染C3H10T1/2细胞的构建

目的构建人β-防御素3(h BD3)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的重组腺病毒载体p Adxsi-BPIBD3,并转染鼠胚胎间充质干细胞系(C3H10T1/2),观察融合蛋白的表达。方法酶切原始质粒,得到BPI-BD3片段,连接到p Shuttle-CMV得到p Shuttle-BPI-BD3,验证后将插入片段转移至p Adxsi载体构建重组腺病毒质粒,线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化后,TCID50测定重组腺病毒滴液。p Adxsi-BPI-BD3及空载体p Adxsi(作为对照组)转染C3H10T1/2。RT-PCR、Western blot检测BPI-BD的表达;MTT法检测其对细胞增殖的影响。结果成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,纯化后病毒滴度达1.2×1010pfu/ml。p AdxsiBPI-BD3转染C3H10T1/2后,RT-PCR、Western blot结果显示,BPI-BD3融合蛋白表达成功。MTT结果显示,转染的C3H10T1/2生长无明显影响(P>0.05)。结论成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,且转染C3H10T1/2后可稳定表达BPI-BD3融合蛋白,为进一步研究应用抗菌肽BPI-BD3奠定基础。

人β-防御素3基因的克隆分析及其真核表达载体的构建

根据Genebank上公布的人β-防御素3基因序列设计引物,以提取的人DNA为模板进行PCR扩增,得到全长为1391bp的人β-防御素3完整基因组序列,包括起始序列、信号肽序列、2个外显子、1个内含子以及上下游酶切位点和终止密码子等。与NCBI上公布的DNA序列的同源性达到99.93%,在内含子上有1个A的缺失,其编码氨基酸序列与公布序列的同源性达100%。将其克隆到pMD18-T载体中,进一步构建了其真核表达载体pcDNA-hBD3,为其表达和功能研究奠定基础。

重组人β-防御素3对多耐药细菌的抑菌活性分析

目的研究重组人β-防御素3(rhBD-3)对临床多耐药菌株(铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌)的抗菌活性。方法采用比浊法测定不同浓度rhBD-3下4种细菌液OD值,确定最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),并与对照组比较。结果 rhBD-3对所测菌株菌均有抑菌活性,在一定的浓度范围内,rhBD-3的浓度增高抑菌活性增强。rhBD-3的MIC、MBC与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。结论 rhBD-3对临床多耐药细菌具有显著的抑菌活性,给解决临床细菌耐药带来新希望。

人β-防御素3转染脂肪干细胞成骨分化潜能及抗牙周炎致病菌的作用

目的探讨人β-防御素3(hβD-3)转染脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化潜能及体外抗牙周炎致病菌的作用。方法体外提取人腹部脂肪组织,分离后用流式细胞仪鉴定人脂肪干细胞(hADSCs)免疫表型(CD29/CD44),体外培养hADSCs,将细胞分为对照组、空载组与实验组(按hβD-3-hADSCs接种密度分为低密度组、中密度组和高密度组),对照组不作处理,空载组转染不含hβD-3基因的慢病毒载体,实验组利用质粒构建含hβD-3基因的慢病毒载体并转染hADSCs。空载组与实验组均加入成骨分化诱导液,对照组不作处理,在诱导7、14 d后,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测3组细胞中成骨相关基因[碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)]的表达量,以评价hADSCs的分化能力。测量抑菌圈的直径,设置抗生素阳性对照(米诺环素组、环丙沙星组),检测转染后的hADSCs对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌的抑菌活性。结果诱导7、14 d时,空载组与实验组的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);空载组与实验组诱导14 d时的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量高于诱导7 d时,差异有统计学意义(P<0.05)。葡萄球菌抑菌实验中,低密度组抑菌圈小于米诺环素组与环丙沙星组,中密度组抑菌圈大于环丙沙星组,高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组,差异有统计学意义(P<0.05)。卟啉单胞菌抑菌实验中,低密度组抑菌圈小于米诺环素组与环丙沙星组,中密度组抑菌圈大于米诺环素组,高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论hβD-3转染可促进hADSCs成骨分化,且对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌均有较好的抗菌活性。

β-防御素3在涎腺良恶性肿瘤及炎症中表达差异及鉴别诊断价值

目的探讨β-防御素3(HBD-3)在涎腺良恶性肿瘤及炎症中表达差异及鉴别诊断的价值。方法选择2009年3月—2014年4月在我院治疗的涎腺良性肿瘤标本87例、恶性肿瘤标本35例、炎症标本46例和正常涎腺组织标本65例,利用SP免疫组化检测HBD-3蛋白在不同疾病类型涎腺组织中的表达,利用RT-PCR检测HBD-3 mRNA在不同疾病类型涎腺组织中的表达。结果 HBD-3蛋白在涎腺恶性肿瘤组织中呈低表达,可见于胞质和胞核,而在涎腺良性肿瘤组织及炎症组织中呈高表达,均表达于胞质,HBD-3蛋白在涎腺恶性肿瘤组织中表达水平显著低于正常涎腺组织,而在涎腺良性肿瘤组织及炎症组织中表达水平则显著高于正常涎腺组织,差异均有统计学意义(P<0.05);与正常涎腺组织相比,HBD-3 mRNA在涎腺恶性肿瘤组织中相对表达量显著降低,而在涎腺良性肿瘤组织和炎症组织中相对表达量则显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HBD-3蛋白及基因在涎腺良性肿瘤组织及炎症组织中均呈高表达,而在涎腺恶性肿瘤中则均呈低表达,且出现了蛋白表达核转移,可能具有一定的抗肿瘤潜能。

乳糖诱导鸡β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达

目的研究用乳糖作为诱导剂对鸡β-防御素3(Gal-3)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。最优表达条件为终浓度2 g/L乳糖37℃下诱导3 h,可以达到良好的诱导效果。结论乳糖可以诱导Gal-3基因表达,并取得良好效果,为工业化生产提供了良好的实验参考和借鉴。

人β-防御素3的研究新进展及其与疾病的关系

防御素是近年来发现的一类内源性小分子多肽,人β-防御素-3(HBD-3)是在银屑病患者皮损组织中首先发现,HBD-3在人体上皮细胞和黏膜组织中广泛表达,分子结构稳定,具有广谱的抗微生物活性,能促进伤口愈合,发挥免疫调节及抗肿瘤等多种作用。HBD-3在呼吸系统疾病、消化系统疾病、囊性纤维化、肿瘤等疾病中发挥重要作用,应用前景广阔。

人β-防御素3在感染皮肤组织中表达的研究

目的:探讨人β-防御素3(hum an β-defensin 3,hBD3)在感染皮肤组织中的表达情况。方法:取烧伤患者感染皮肤组织和正常皮肤组织,提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹法检测hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论:感染皮肤组织中hBD3的mRNA和蛋白水平均显著高于正常皮肤组织。感染皮肤组织中hBD3表达增强。

人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

目的 :在大肠杆菌系统中表达有活性的人 β 防御素 3(hBD3)。 方法 :从pGEM T hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因 ,插入pGEX 4T 1构建pGEX 4T 1 hBD3融合表达载体 ,转化E .coliDH5α宿主菌 ,进行IPTG诱导 ,诱导菌经超声裂解后获得包涵体 ,包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST hBD3融合蛋白 ,再经凝血酶切割 ,获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果 :以与GST融合表达的方式 ,运用pGEX 4T 1系统在大肠杆菌中表达了hBD3,融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使rhBD3释放出来 ,其对金黄色葡萄球菌的MIC为 4 μg/ml;对大肠杆菌的MIC为 8μg/ml。 结论 :采用pGEX 4T 1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。