人β_2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β2 微球蛋白 (β2 m)是主要组织相容性复合体 (MHC)Ⅰ类分子的轻链部分 ,为制备MHCⅠ类分子四聚体的必要成分。根据已报道的序列设计特异引物 ,利用RT PCR方法从人白细胞中克隆了 β2 m基因 ,并构建了成熟β2 m的原核表达载体 ,在大肠杆菌中得到高效表达。表达的β2 m大部分在包涵体中 ,经洗涤、变性和复性 ,并以强阴离子交换柱层析纯化 ,获得SDS PAGE纯的人重组 β2 m ,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然 β2 m抗体反应的特性。此工作为制备MHCⅠ类分子四聚体奠定基础。

针对HLA-I类分子高效基因编辑方法的建立及其应用

目的:建立一种HLA-I类分子高效基因编辑的方法,以制备编辑HLA-I类通用型造血干细胞。方法:针对β2微球蛋白基因设计并合成sgRNA,将NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA按照不同的摩尔比(1∶1-1∶4)形成RNP复合物,分别设置对照组和四个转染组,通过核转染方式转入HEK-293细胞或者CD34+造血干细胞。培养72 h后,应用流式细胞术检测转染细胞表面HLA-I类分子表达情况,T7E1酶切反应鉴定切割作用,DNA直接测序方法鉴定序列套峰出现情况。结果:流式细胞术检测发现转染后HEK-293细胞或者CD34+造血干细胞有不同程度的HLA-I类分子阴性表达细胞群,直接测序不同转染组在sgRNA PAM序列附近均有明显套峰出现。在HEK-293细胞转染中,NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA摩尔比为1∶4时HLA-I类分子阴性表达细胞群比例最高(87.69±0.83)%,摩尔比为1∶3时T7E1酶切割效率最高(38±2.0)%。在CD34+造血干细胞转染中,NLS-Cas9-NLS核酸酶与Easyedit sgRNA摩尔比为1∶2时,HLA-I类分子阴性表达细胞群比例为(91.56±3.39)%,摩尔比为1∶1时T7E1酶切割效率为64±8.45%。结论:本研究提供了一种针对HLA-I类分子进行高效基因编辑的方法,该方法可以有效地将细胞表面的HLA-I类分子进行沉默表达,并成功应用于编辑CD34+造血干细胞。